文摘

根状茎Polygoni Cuspidati中草药,已广泛应用于中药很长时间了。Polydatin,的主要活性成分之一根状茎Polygoni Cuspidati,最近被证明拥有广泛的心血管药理作用。在本研究中,我们调查了在白藜芦醇苷的影响浸膏得率的形成腹膜macrophage-derived泡沫细胞的载脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE^−−/),探讨了潜在的潜在机制。从ApoE腹膜巨噬细胞收集^−−/老鼠和培养在体外。这些细胞顺序被分为四组:对照组,模型组,组白藜芦醇苷洛伐他汀组和浸膏得率。显著抑制白藜芦醇苷我们的研究结果表明,浸膏得率泡沫细胞的形成源于腹膜巨噬细胞。进一步研究调节胞内脂质代谢和白藜芦醇苷表明浸膏得率具有抗炎作用,这可能是通过PPAR -监管γ信号通路。

1。介绍

动脉粥样硬化的并发症是死亡的主要原因。动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病,其特点是多余的脂质在动脉内膜的沉积1- - - - - -3]。Macrophage-derived泡沫细胞在动脉粥样硬化的各个阶段发挥重要作用[4]。从fatty-streak病变早期到先进的斑块,macrophage-derived泡沫细胞整体的发展和动脉粥样硬化的进展。脂质稳态,特别是胆固醇体内平衡,起着至关重要的作用在泡沫细胞的形成5]。巨噬细胞泡沫细胞的形成是一个杰出的人类动脉粥样硬化斑块的特征,通常被认为是相关的炎症反应和氧化低密度脂蛋白(ox-LDL) [6]。的有限的疗效目前的动脉粥样硬化及其并发症治疗策略强调迫切需要新的治疗选项(7]。

招募巨噬细胞及其后续ox-LDL的清道夫受体是主要的细胞事件导致fatty-streak形成(8]。清道夫受体中,集群分化抗原36 (CD36)是已知的主要受体在这一过程中泡沫细胞的形成(9,10]。最有说服力的数据支持的关键角色CD36泡沫细胞的形成和动脉粥样硬化CD36-null转基因小鼠模型的研究。巨噬细胞分离CD36-deficient动物吸收ox-LDL很深刻的缺陷和泡沫细胞的形成。因此,淘汰赛的CD36 proatherogenic ApoE-null老鼠保护这些动物动脉粥样硬化病变的发展。相比CD36-intact ApoE-null与西方饮食的老鼠,这些动物显示主动脉病变的大小减少70%以上11]。

胆固醇流出被认为是最重要的关键关于维护胆固醇体内平衡和动脉粥样硬化。的一个主要潜在的巨噬细胞胆固醇流出途径是由腺苷结合盒转运体A1 (ABCA1)。它促进流出的磷脂和胆固醇lipid-poor ApoA-I过程中涉及到的直接绑定ApoA-I运输车。所以ABCA1视为关键调解人的巨噬细胞胆固醇流出成熟的高密度脂蛋白(12]。巨噬细胞的细胞内胆固醇体内平衡是由胆固醇吸收和胆固醇流出,动态监管过程严格控制这些清道夫受体,如CD36和ABCA1 [13]。

过氧物酶体摘要受体(PPAR -γγ)是一种核转录因子,是巨噬细胞中高度表达,macrophage-derived泡沫细胞在动脉粥样硬化病变。PPAR -γ调节胆固醇代谢和炎症变弱14]。它能抑制巨噬细胞泡沫细胞形成和动脉粥样硬化(15]。PPAR -γ促进单核细胞/巨噬细胞分化和ox-LDL的吸收增强CD36的表达(16]。PPAR -γ在第一步的reverse-cholesterol-transport通路的激活ABCA1-mediated人类巨噬细胞胆固醇流出(17]。中断的PPAR -γ基因抑制ABCA1的表达,减少巨噬细胞胆固醇流出。所以PPAR -γ发挥了至关重要的作用在调节胆固醇体内平衡通过控制一组基因的表达,调节胆固醇流出细胞及其运输在等离子体18]。

根状茎Polygoni Cuspidati传统的中草药,行动的“清热祛湿、减轻黄疸,清除热量,下沉毒素,活血,和去除瘀”(19]。Polydatin,其主要活性成分之一,已被证明具有广泛的心血管药理作用在最近的药理研究。Polydatin显示显著影响血脂的规定,保护心肌细胞,扩张血管,引起血小板聚集,血栓形成,动脉粥样硬化(20.]。然而,直接影响的吸收白藜芦醇苷的浸膏得率ox-LDL巨噬细胞、泡沫细胞的形成尚未阐明。的机理也尚不清楚。白藜芦醇苷的antiatherosclerotic影响浸膏得率

澄清对白藜芦醇苷的影响浸膏得腹膜macrophage-derived ApoE的泡沫细胞^−−/老鼠,我们调查的吸收白藜芦醇苷的作用浸膏得ox-LDL,细胞内脂质代谢、炎症因子的表达,mRNA的表达PPAR -γ在腹膜巨噬细胞ABCA1, CD36。显著抑制白藜芦醇苷我们的研究结果表明,浸膏得率在腹膜巨噬细胞泡沫细胞的形成。Polydatin具有显著的抗炎作用,调节脂质代谢,可能通过PPAR -γ信号通路。

2。材料和方法

2.1。动物

六个ApoE^−−/老鼠从杰克逊实验室(美国)购买和饲养的实验动物中心北京大学重19到21 g。

2.2。试剂和化学物质

Polydatin提取和纯化根状茎Polygoni Cuspidati西安冠宇生物技术有限公司。是白藜芦醇苷的纯度浸膏得率99.42%。洛伐他汀被北京Winsunny有限公司RPMI 1640胎牛血清(的边后卫)和抗生素(链霉素/青霉素)买来Gibco (BRL生活技术,大岛,纽约)。肿瘤坏死因子-α和il - 6的ELISA试剂盒购自上海Westang生物技术公司,有限公司,上海。

2.3。隔离和小鼠腹腔巨噬细胞的文化

ApoE^−−/老鼠被颈椎脱位牺牲,按照实验动物保健原则(NIH出版物编号为85 - 23,1985年修订)和北京大学动物调查委员会的指导方针。无菌冰冷的磷酸盐(PBS)注射到小鼠的腹腔和腹膜灌洗。这种液体是认真收集和离心机在1000 rpm 6分钟。离心后,上清液被丢弃,细胞颗粒在RPMI 1640 resuspended介质(含100单位/毫升的青霉素,100μ链霉素的g / mL, 100μ谷酰胺的g / mL)和镀在6-well组织培养板1.5×10(配角)⁶细胞每口井。细胞培养在湿润的气氛中5%的有限公司₂在37°C 2 - 3 h允许依从性,和不依从细胞被漂洗掉prewarmed RPMI 1640中型和2毫升的RPMI 1640年完成介质(补充10%胎牛血清)补充道。媒体与所有添加取代日常和巨噬细胞在5天内从收获进行进一步分析21,22]。

2.4。低密度脂蛋白修改

低密度脂蛋白被暴露在5μmol / L CuSO₄24小时在37°C。铜^{2 +}当时被广泛的透析。修改的程度是由测量硫代巴比土acid-reactive物质。ox-LDL含有30 - 60 nmol硫代巴比土acid-reactive物质定义为丙二醛每毫克当量LDL蛋白质用于实验的23]。

2.5。组

ApoE的腹膜巨噬细胞^−−/老鼠收集并分为4组:对照组(牛血清处理250μL)、模型组(治疗牛血清250份μL和ox-LDL 250μg),洛伐他汀组(牛血清处理250μL, ox-LDL 250μ克,110μ集团白藜芦醇苷g / mL洛伐他汀)和浸膏得率(牛血清处理250μL, ox-LDL 250μg和8.9μ)白藜芦醇苷g / mL浸膏得率。培养液添加到弥补2.5毫升在所有组。

2.6。巨噬细胞细胞的超微结构观察

,白藜芦醇苷与ox-LDL被加载后,浸膏得率和洛伐他汀为48 h,这些巨噬细胞在400 g离心10分钟,和球团生产用PBS洗净,然后用2% (v / v)混合P-formaldehyde-glutaraldehyde 0.05甲次砷酸盐缓冲(pH值7.4)4小时4°C。之后,球团准备透射电子显微镜(jem - 1200 ex)。

2.7。在巨噬细胞胞内脂质分析

在巨噬细胞胞内脂质提取与己烷/异丙醇(3:2)0后,24日,48 h与ox-LDL孵化,Polydatin,和洛伐他汀,蒸发,然后在异丙醇溶解含10% Triton x - 100样品溶液的制备。自由胆固醇和总胆固醇测定商业分析系统和光化学物质(kouichi)。胆固醇酯被减去估计自由胆固醇总胆固醇。实验重复了三次。

2.8。蛋白质水平的TNF -α和il - 1β与ELISA检测

24小时和48小时后与ox-LDL孵化,TNF -的水平α和il - 6在培养媒体按照制造商的指示用ELISA试剂盒(上海Westang生物科技有限公司、有限公司、上海)。ELISA数据得到至少三个独立的实验。

2.9。PPAR - rt - pcr分析表达式γABCA1, CD36 mRNA

从培养腹膜巨噬细胞使用提取的总RNA RNA隔离设备(Sangong生物科技有限公司,上海),根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸是准备从0.3μg的RNA。

根据制造商的指示,执行rt - pcr检测PPAR -利用寡核苷酸引物γABCA1, CD36 mRNA (Sangong生物科技有限公司,上海),PPAR -γ(403个基点):感觉5′CCC TGG CAA AGC ATT TGT 3′, 5′反义aat有条件现金援助TGG CCC TCT呕吐3′;ABCA1(364个基点):感觉5′cag ATG CCC TAC CCC TGT TA-3′, 5′反义-GGG AGA AGA GCG TGC TAA TG-3′;CD36(418个基点):5′感觉有条件现金援助TAA gg AAT CCC CGT GT-3′, 5′反义CCA ATG GTC CCA GTC柠檬酸TT-3′;β肌动蛋白(302个基点):5′感觉膀胱移行细胞癌CTG GAG亚美大陆煤层气有限公司AGC TA-3′,反义5′柠檬酸GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3′(24]。这个实验至少重复三次。

2.10。统计分析

结果表示为平均数±标准差值的实验。统计学意义在每个治疗组比较消极的控制,由单向方差分析测试。每个实验至少重复三次。SPSS 13.0版(美国IL SPSS Inc .)是用于分析。值和被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。Polydatin保护腹膜巨噬细胞细胞的超微结构

检查潜在影响巨噬细胞细胞白藜芦醇苷的浸膏得率,老鼠巨噬细胞与ox-LDL 48 h没有孵化或和白藜芦醇苷的浸膏得率电镜下的超微结构进行了评价。巨噬细胞的正常结构如图1(一)。相比之下,巨噬细胞在模型组的结构完全破坏,周质中细胞器消失了。原子核分裂成多个不同大小得发抖。结构的核膜、核仁和常染色质(图消失了1 (b))。和洛伐他汀组白藜芦醇苷在浸膏得率,原子核的结构是集成。核膜、核仁和丰富的常染色质被观察到。细胞器的一部分被损坏和观察液泡化。这表明腹膜巨噬细胞的载脂蛋白e^−−/老鼠ox-LDL有利的反应和吞噬能力。/洛伐他汀和ox-LDL白藜芦醇苷联合治疗与浸膏得率显著降低ox-LDL的损伤细胞内超微结构仅在巨噬细胞群ox-LDL相比治疗(数字1 (c)和1 (d))。

3.2。Polydatin调节腹膜巨噬细胞细胞的胞内脂质代谢

装满ox-LDL后24小时和48小时,总胆固醇的水平,游离胆固醇和胆固醇酯在巨噬细胞模型组升高。总胆固醇在巨噬细胞胆固醇酯的比例超过50%在模型组,这是符合泡沫细胞的病理变化。治疗24小时和48小时后,Polydatin和洛伐他汀显著降低胆固醇积累ox-LDL巨噬细胞加载。和洛伐他汀组白藜芦醇苷之间观察到的浸膏得率没有差别(数字2(一个)- - - - - -2 (d))。

3.3。Polydatin TNF -蛋白质含量降低α和il - 1β在腹膜巨噬细胞细胞

进一步调查潜在的炎症因素白藜芦醇苷的影响浸膏得率,TNF的表达α和il - 1β腹膜巨噬细胞的细胞被ELISA评估。ox-LDL治疗后24小时和48 h, TNF -的蛋白质水平α和il - 1β显著增加。Polydatin和洛伐他汀降低TNF的表达α和il - 1β的水平。和洛伐他汀组白藜芦醇苷和没有区别浸膏得率(数字3(一个)和3 (b))。这说明向药性ApoE的腹膜巨噬细胞^−−/老鼠被ox-LDL增强,伴随产生大量炎症因子,如肿瘤坏死因子-α和il - 1β。

3.4。Polydatin调节mRNA的表达PPAR -γ在腹膜巨噬细胞细胞ABCA1, CD36

的mRNA表达PPAR -γABCA1, CD36被rt - pcr检测有抑制白藜芦醇苷确定浸膏得率影响PPAR -γ腹膜巨噬细胞细胞通路。ox-LDL治疗后24小时和48小时的mRNA水平PPAR -γABCA1,在腹膜巨噬细胞细胞CD36显著增加了。然而,PPAR -的mRNA的表达γ和ABCA1被发现,白藜芦醇苷增加浸膏得洛伐他汀组治疗24和48 h后,ox-LDL相比治疗组。但CD36的mRNA表达显著减少和洛伐他汀组治疗24小时后白藜芦醇苷在浸膏得率。没有差别的mRNA的表达PPAR -γ和洛伐他汀组白藜芦醇苷和CD36浸膏得率。但集团白藜芦醇苷ABCA1的mRNA表达浸膏得率高于洛伐他汀组()(数据4(一)- - - - - -4 (f))。

4所示。讨论

在生命的早期动脉粥样硬化开始,经常会导致严重的并发症与高发病率和死亡率在晚年。巨噬细胞胆固醇accumulation-induced泡沫细胞形成早期动脉粥样硬化的标志(25]。说明涉及巨噬细胞的分子和细胞过程导致了许多治疗靶点被建议(7]。在巨噬细胞胆固醇积累会导致一个不平衡的细胞胆固醇通量,硬化脂蛋白摄取的增加和/或减少从细胞胆固醇流出26- - - - - -28]。可能会增加白藜芦醇苷在我们的研究中,我们发现浸膏得率从巨噬细胞胆固醇流出,减少ox-LDL的吸收,从而导致抑制巨噬细胞的胆固醇积累。其机制可能是诱导PPAR -γ端依赖的方式。

大样本临床试验已经证实他汀类药物有antiatherosclerotic影响,包括改善内皮功能、抑制血小板聚集、抗炎作用增加,稳定动脉粥样硬化斑块(29日- - - - - -32]。但是,他汀类药物导致一些严重的副作用。我们试着找到从中药新药antiatherosclerotic效应和调节脂质,但很少有副作用。寻找新药和antiatherosclerosis lipid-regulation影响已经多年来获得了迅猛的发展,导致大量报道天然药物的重要活动。许多类成份和天然化合物的检测调节血清脂质浓度的降低动脉粥样硬化和冠心病的发病率20.,33]。我们可以减少白藜芦醇苷的研究小组发现,浸膏得颈动脉内膜中层厚度(IMT)、斑块积分和减少斑块稳定性相关的血清指标如Hs-CRP,金属蛋白酶- 1和TIMP患者颈动脉粥样硬化(34,35]。

根状茎Polygoni Cuspidati记录第一次在书中命名吗各种各样的著名医生的记录(明易Bie Lu)。现代药理研究表明,它具有明显的抗菌、抗炎、利尿、通便,月经恢复的影响36]。有多个白藜芦醇苷作为其主要成分之一,浸膏得生物行为,如肝脏保护,抗炎,抗肿瘤,antipathogenic微生物,应用于预防和治疗心血管疾病。特别是,其心血管药理作用,如心肌细胞(CM)保护,血管平滑肌扩张,血小板聚集,血栓形成,预防动脉粥样硬化,得到了学者们的极大关注相关领域最新的年37]。

Cholesterol-loaded巨噬细胞、泡沫细胞在动脉粥样硬化斑块的主要因素。在体外研究表明,修改形式的低密度脂蛋白导致培养的巨噬细胞积累胆固醇酯(38]。在这项研究中,我们收集了从ApoE腹膜巨噬细胞^−−/老鼠,这已成为使用最广泛的啮齿动物模型研究动脉粥样硬化(39,40]。然后我们通过ox-LDL刺激巨噬细胞细胞“泡沫细胞”模式。结果表明,总胆固醇在巨噬细胞胆固醇酯的比例是50%以上模型组,这与泡沫细胞的病理变化是一致的。我们使用MTT分析方法来决定适当的剂量和洛伐他汀白藜芦醇苷的浸膏得率(数据没有显示)。在我们的研究中,我们发现/洛伐他汀和ox-LDL白藜芦醇苷联合治疗浸膏得率显著减轻ox-LDL在细胞内超微结构的损害相比ox-LDL加载细胞巨噬细胞。Polydatin和洛伐他汀调控细胞内脂质代谢授予的保护作用巨噬细胞泡沫细胞的形成。

在这项研究中,我们发现,与ox-LDL孵化后24小时和48小时,腹膜巨噬细胞的载脂蛋白e^−−/老鼠ox-LDL有利的责任和吞噬能力和丰富的炎症因子分泌。一起工作,这些影响可以抑制TNF的高程-α,il - 1β。我们没有观察到任何区别和洛伐他汀组白藜芦醇苷的浸膏得率,表明是与洛伐他汀白藜芦醇苷的功效浸膏得率。

CD36和ABCA1的下游靶基因转录控制PPAR -γ。CD36是细胞内胆固醇积累相关。ABCA1能促进胆固醇和磷从细胞的溶解。激活PPAR -γ通过ox-LDL可以诱导巨噬细胞CD36的表达,促进ox-LDL的吸收,增加细胞内胆固醇的积累,然后激励泡沫细胞的形成(16]。这是一个积极的反馈途径。同时,激活PPAR -γ也上调ABCA1的表达,降低胆固醇,抑制泡沫细胞的形成。这是负面反馈通路。因此,ox-LDL-PPAR——的规定γ-CD36和ox-LDL-PPAR -γ-ABCA1信号通路对抑制泡沫细胞的形成和antiatherosclerosis很重要(41]。在我们的研究中,我们审查的表达是否PPAR -γ影响ABCA1的表达和CD36。,白藜芦醇苷与ox-LDL治疗后,浸膏得率和洛伐他汀为24小时和48 h, PPAR -的表达γABCA1, CD36在mRNA水平增加。Polydatin和洛伐他汀可能上调的mRNA表达PPAR -γ和ABCA1表达下调CD36的mRNA的表达。可能白藜芦醇苷这表明浸膏得率调节ABCA1 mRNA的表达,通过激活PPAR - CD36信使rnaγ连续信号,抑制巨噬细胞泡沫细胞的形成。

抑制白藜芦醇苷在结论,我们的研究表明,浸膏得ApoE的腹膜macrophage-derived泡沫细胞的形成^−−/老鼠。有抗炎作用和白藜芦醇苷进一步调查表明,浸膏得率调节细胞内的脂质代谢,可能通过PPAR -γ信号通路。因此,我们的数据提供了一些实验证据的防治动脉粥样硬化白藜芦醇苷使用浸膏得率。

信息披露

投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表或论文的准备。

利益冲突

本文的作者宣称他们没有直接提到金融与商业身份。

作者的贡献

吴Min和刘Meixia同样导致了纸。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。81102721也没有。81202805),技术项目计划国家中医药管理局(没有。04-05LP30),中国国家博士后科学基金(没有。(20070410622),其特殊的援助项目。201003226),山东的R & D项目关键技术,中国(没有。2010年—10289年)。