文摘

草药产品的安全一直是普遍关注由于其复杂的化学性质和缺乏适当的评价方法。我们有一个敏感的和可再生的multiparametric细胞高含量分析测定评估四种中药注射剂的hepatic-safety古典动物性毒性分析和验证。我们的研究结果表明,药物的肝毒性的报道,Fufangkushen注入,可以将至少部分归因于人类HepG2细胞线粒体功能的干扰它的一些成分。这种方法应该用于临床前屏幕在药物发现程序和postclinical评价中药制剂。

1。介绍

中药(TCM)注射是一种创新和速效的草药产品的剂型。它在临床治疗急性中起着重要作用,在中国严重的症状。然而,中药注射液的安全性一直是长期关注公众,尤其是在连续药品不良反应(ADR)最近的报告。中医注射引起的ADR占77.2%的中药引起的ADR在国家ADR病例报告数据库1]。肝毒性是一个药物开发项目终止的主要原因,经常导致监管行为包括拒绝批准和黑盒警告2]。药物引起的肝毒性占例急性肝衰竭的一半在美国和英国3]。长期和急性肝损伤动物毒性试验是要求正式在临床前研究。然而,经典的动物研究是低效的,只有大约一半的新药物肝毒性可以发现在动物试验4]。更精确、快速和高通量方法来评估药物的肝毒性,尤其是中医注射,是需要的。

肝毒性的主要机械的分类包括抑制线粒体功能,破坏细胞内钙稳态,激活细胞凋亡,氧化应激,抑制特定酶或转运蛋白和活性代谢产物的形成,导致直接毒性或免疫原性(5]。HCA被认为是一个重要的预测工具的应用上面的机械理解肝毒性的评估。是最近进展的自动化定量荧光显微镜和图像分析数字化应用microfluorescent,多功能探针技术。它使动态监测在体外实时细胞的多细胞生物标志物极度参与毒性的发病机理6]。建立了HCA化验调查243年肝毒性药物HepG2细胞。当数据还考虑到了报道最大的人血浆浓度的药物,特异性为98%,敏感性为93%检测化合物导致肝毒性观察。

中医注射通常是一个没有完全清楚的复合制剂治疗物质基础,很难评估毒性效应,特别是在其机制。可视化的特点、直觉和多参数的HCA适合中药制剂的毒性评估。四种中药注射剂,Danhong注入(济),利用(XDI)对Mailuoning注入(MLNI)和Fufangkushen注入(FFKSI),选择HCA化验。他们都是广泛应用于临床实践在中国总销售额超过40亿元人民币在2013年。四个注射不同的肝毒性ADR报告7]。XDI和MLNI报道在对ADR SFDA[公告的信息8,9]。也观察到济FFKSI可能增加ALT, AST,高山在个别临床病例(10- - - - - -14]。

这项研究旨在开发和验证一个实际的,可再生的,在体外multiparametric细胞HCA试验来评估肝毒性中药注射剂,表明他们的行动机制。分析应用于人类细胞HepG2行(15- - - - - -17在96 -孔板培养。荧光染料,采用光学兼容性评估多个参数关于药物引起的肝损伤,包括手机号(CN)、核面积(NA),线粒体质量(MS),线粒体膜电位(MMP)和等离子体膜透性(PMP)。药物与已知的肝毒素的机制,P-fluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP),对乙酰氨基酚、盐酸阿霉素,被用作积极控制。FCCP,线粒体氧化磷酸化的有力解偶联剂18),也可以降低MMP活性和凋亡[19]。对乙酰氨基酚转化为细胞色素P450酶活性代谢物,NAPQI,有效的解毒与谷胱甘肽共轭。然而,有毒的剂量后,耗尽了谷胱甘肽结合反应蛋白质和代谢物共价有界。从谷胱甘肽的损失,发生过氧化反应通过Fenton-type机制从而导致激活蛋白酶和内切酶和DNA链断裂。NAPQI过剩的影响在孤立的线粒体和线粒体呼吸抑制被认为造成损害肝细胞(20.]。阿霉素引起的不平衡氧自由基(ROS)和抗氧化剂。oxidant-antioxidant系统的扰动导致组织损伤与脂质过氧化作用和蛋白质氧化了的组织。表明炎症过程,自由基,氧化应激和脂质过氧化反应往往与有毒药物如阿霉素引起的肝损伤(21]。

验证试验,28天亚急性动物进行了研究。动物死亡,生存状态,身体和肝脏重量,抗氧化活性在血浆和肝匀浆测定并与HCA的结果。四种中药注射剂的肝毒性评估和行动的机制被建立的方法建议。

2。材料和方法

2.1。药品和试剂

FCCP(σ,圣路易斯,密苏里州,美国,批号122 m4004v),对乙酰氨基酚(σ,圣路易斯,密苏里州,美国,批号061 m0042v),和盐酸阿霉素(Meilun生物技术有限公司,大连,中国,批号20120205)被用作积极控制验证试验。FCCP的平均浓度(IC 50)和对乙酰氨基酚是5.2μM和1.3毫米(22),分别。盐酸阿霉素浓度最低的是0.1μ米(4]。剂量反应关系,FCCP 0.3 -30μ在0.3 M,对乙酰氨基酚-10毫米,盐酸阿霉素为0.1 -10μ米被选中。四种中药注射剂,济(Buchang制药有限公司,山东,中国,批号12081024077),XDI(拜肯制药有限公司,江苏,中国,批号120812),MLNI(金陵药业股份有限公司、江苏、中国,批号20121208),和FFKSI (Zhendong制药有限公司,山西、中国,批号20130228),从第一个购买天津中医药大学教学医院。中药注射剂是连续稀释到1000倍DMEM /高葡萄糖补充10%的边后卫。HepG2细胞线从文化的集合类型购买中国科学院(中国上海)。Mitotracker深红色调频荧光探针获得表达载体(美国CA),而其他荧光探针获得从Sigma-Aldrich(美国密苏里州)。

2.2。细胞培养和药物治疗

HepG2细胞亚文化收购后不到十五代人的文化收藏。细胞在DMEM /高葡萄糖培养4500 mg·L−1葡萄糖和4毫米·L−1谷氨酰胺(美国热费希尔科学、UT)和补充10%的边后卫(美国纽约Gibco)和100 IU·毫升−1penicillin-streptomycin(美国纽约Gibco) 37°C公司5%2的气氛。细胞被亚文化与trypsin-EDTA 0.25%胰蛋白酶化后的解决方案(美国纽约Gibco),镀上胶原蛋白我涂(Shengyou、杭州、中国)96孔酶标(美国康宁,MA) 8×10的密度3每口井,培养在37°C公司为5%2。只有60井内的96 -使用了微型板块由于evaporation-related边缘效应在外面的井。

2.3。HCA成像和图像分析

测定,细胞参数与CN, NA(赫斯特33342年),女士(Mitotracker深红色FM), MMP(罗丹明123),和PMP测量碘化(PI)。24小时孵化后,50μ包含3 L荧光团的混合物μ摩尔·L−1赫斯特33342年0.9μ摩尔·L−1Mitotracker深红色调频,9μ摩尔·L−1π碘在DMEM /高葡萄糖添加到每个。在黑暗的细胞被孵化30分钟。在100年消除媒介μL 1.2μg·毫升−1罗丹明123添加在每个。额外的细胞培养半小时阻止光线,然后他们洗一次温暖的DMEM之前图像扫描。试验板是成像和分析使用轻歌剧HCA系统(美国珀金埃尔默,MA) 25°C的相对湿度45%使用20 x目标。六个字段的荧光图像每口井在33342年赫斯特,Mitotracker深红色调频,π碘和罗丹明123频道获得了共焦扫描,分别。CN, NA,女士、MMP和PMP测量并计算平均值的六个图像采用图垫“(美国图垫软件,Inc . CA)软件。

2.4。亚急性毒性试验

动物保健和操作规程严格按照中国实验动物使用规定,和动物进行按照制度伦理指南,和实验机构的动物保健和使用委员会批准天津国际联合科学院生物技术和医药。Sprague-Dawley老鼠(男, g)购买的军事医学科学院实验动物中心,坐落在不锈钢丝笼子底部控制环境(25±1°C, 50 - 60%的湿度,每天12 h荧光灯)10天的驯化。所有的老鼠喂食了标准的食物和水随意。

老鼠被随机分成9组,每组六个动物。临床剂量的1.2倍设置为低剂量组。四个低剂量组管理4.4毫升·公斤−12.2毫升·公斤−11.3毫升·公斤−1和2.2毫升·公斤−1济,XDI,对FFKSI MLNI,而高剂量组分别有6次临床剂量的注入。对照组收到22毫升·公斤−1生理盐水。所有的代理都通过尾静脉注射对28天的日常管理。身体的重量都记录在实验和每周的第一天。剂量是根据体重改变纠正。身体状况观察动物的日常包括改变皮毛,眼睛和粘膜,肥料和行为模式。老鼠实验期间牺牲立即尸体剖检;所有宏观异常的心、肝、脾、肺、肾等器官都被记录下来。由于强烈的不良反应FFKSI高剂量组大鼠的老鼠尸体剖检,所有的器官和组织都经常在第14天进行处理。

2.5。血清生化指标

28天的药物治疗后,大鼠禁食过夜,血样经腹主动脉与10%水合氯醛麻醉后(5毫升·公斤−1在4°C)和镀凝了五个小时。血清被离心分离3000 r,持续15分钟。生化参数的血清酶活性的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)和碱性磷酸酶(ALP)由商业ALT测定试剂盒(Biosino,北京)、AST试剂盒(Biosino,北京),GPO-PAP TG工具包(Biosino,北京),和高山工具包(Biosino、北京、中国)使用日立7020临床化学分析仪(日立,东京,日本)。

2.6。抗氧化效果

老鼠的肝脏立即隔离,在冰冷的生理盐水洗。0.2克每鼠肝组织是加权精确、均质与生理盐水聚四氟乙烯均质器和离心机3000 r 10分钟10%肝匀浆(w / v)。超氧化物歧化酶(SOD)的活性,过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(谷胱甘肽)和丙二醛(MDA)是由使用商业SOD WST-kit(南京建成,中国),猫分析工具包(南京建成,中国),谷胱甘肽分析工具包(南京建成,中国)和MDA测定工具包(南京建成,中国)。

2.7。统计分析

六IC 50图像领域/被图垫“计算软件。所有数据被表示为±SEM。执行统计分析使用方差分析和LSD SPSS 17.0进行测试。的价值 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。方法验证用积极控制药物

multiparametric HCA的敏感性试验首次验证了三个已知的肝毒素的化合物。33342年宏彻代表图像,Mitotracker深红色调频,π碘,罗丹明123个频道被HCA建立典型FCCP(3所引起的细胞毒性的影响μ米),对乙酰氨基酚(3毫米),盐酸阿霉素(3μ米),如图1,增加强度Mitotracker深红色调频女士表示增加FCCP和盐酸阿霉素(数据造成的1 (g)和1 (h));罗丹明123显示MMP的强度下降减少造成的所有三个积极的药物(数字1 (j),1 (k),1(左))。细胞的细胞核萎缩是由FCCP,图1 (d)。如图2,FCCP 3μ10米,μ米,30μ米( ),对乙酰氨基酚在1毫米,3毫米,10毫米( ),盐酸阿霉素为0.1μ米到10μ米( CN)显著下降了35.8% -70.4%,空白组。FCCP 30μ米( 100年),对乙酰氨基酚μ米( )和盐酸阿霉素在3μ米和10μ米( )显著增加PMP的17.5,61.4,19.0,和44.9倍,分别。对乙酰氨基酚钠显著增加了25.7%在3毫米( ),而这增加了MMP的26.7%在100年μ米( )。此外,对于FCCP、对乙酰氨基酚和盐酸阿霉素,CN的IC 50 5.18μ1.67米,1.84毫米,μM,分别。NA的IC 50是0.60μ0.17米,111.63毫米,μM,分别。对于女士来说,集成电路50是7.02μ1.94米,9.78毫米,μM,分别。MMP IC 50为0.77μ0.63米,113.18毫米,μM,分别。FCCP、对乙酰氨基酚和盐酸阿霉素,PMP的IC 50 25.69μ10.73米,0.01毫米,μM。

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图1
代表图像的HCA积极诱导肝毒性药物在33342年宏彻,Mitotracker深红色调频,π碘,罗丹明123个频道。HepG2细胞治疗的空白(a, e, i, m,和q), 3μM FCCP (d h l p和t), 3毫米对乙酰氨基酚(b, f, j, n, r),和3μM盐酸阿霉素(阿霉素)(c、g、k、o和s)所示。Mitotracker深红色调频表示强度的增加增加线粒体质量(女士)(g, h)。减少罗丹明123表示强度降低线粒体膜电位(MMP) (j、k和l)。MMP的减少是由白色箭头表示(g、k和o)。π的强度增加时,等离子体膜透性(PMP)增加。PMP增加被白色箭头(o)表示。赫斯特33342年细胞细胞核染色萎缩和CN减少FCCP,白色箭头(d)所示。
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图2
对乙酰氨基酚(AAP),盐酸阿霉素(阿霉素),和FCCP-generated剂量反应曲线推导出从细胞数(a),线粒体质量(b),核区(c),线粒体膜电位(d)和等离子体膜透性(e)暴露于对乙酰氨基酚(1μ10米,μ米、100μM, 1毫米,10毫米和100毫米),暴露于盐酸阿霉素(1纳米,10 nM, 100 nM, 1μ10米,μ米,100μ米),暴露于FCCP (32 nM, 160海里,800海里,4μ米,20μ米,100μ米),HepG2细胞进行了研究。数据表示为±SEM, 。
3.2。中药注射剂在HCA肝毒性试验的效果

5固定浓度(1000 - 800 - 500 - 300 - 100倍稀释)的四个注射,济,XDI,对FFKSI, MLNI被选中。如图3HCA,代表图像捕获的方法建立了典型的细胞毒性作用引起的肝细胞FFKSI 100倍稀释,XDI 100倍稀释,对MLNI 100倍稀释,稀释济100倍。值得注意的是1000 - 800 - 500 - 300 - ( ),稀释100倍( FFKSI显著降低MMP) 11.1% -22.8%比空白组(图4 (d))。XDI和FFKSI对100倍稀释造成的CN 50.8%和48.4%的显著下降( ),分别(图4(一))。XDI稀释100倍还显示对女士的显著增加( 与空白组相比)34.8% ( )( )(图4 (b))。如图4,济和MLNI浓度没有显著变化的参数进行了研究。HCA化验的结果表明,高浓度的FFKSI和XDI可能导致对HepG2细胞的线粒体损伤。此外,对于济,XDI,对MLNI, FFKSI, CN的IC 50是0.41倍,8.6×10−3倍、30.77倍和2725.78倍;女士的IC 50 741.85倍、3.77倍、0.35倍和2725.68倍;NA的IC 50 404.25倍、821.73倍、109.64倍和2199.53倍;MMP的IC 50 5.95×10−6倍、220.91倍、345.43倍和4.95×107倍;PMP的IC 50 660.16倍、90.01倍、268.64倍和1.31×109倍。

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图3
代表HCA的图像分析评估HepG2细胞的细胞核数量和形态4染料染色的控制(f, k, p,和u), Danhong注入(济)100倍稀释(b, g, l q和v),利用(XDI)对100倍稀释(c, h, m, r, w), Mailuoning注入(MLNI) 100倍稀释(d,我,n, s, anad x),和Fufangkushen注入(FFKSI) 100倍稀释(e、j、o、t和y)组。手机号(CN)减少了XDI 100倍稀释,对FFKSI 100倍稀释(c、e)。罗丹明123(绿色)的强度在FFKSI-treated组低于对照组,表明MMP的减少(o)。注意:IC 50细胞参数与细胞数(CN) IC 501和IC 50的细胞参数与核相关区域(NA) IC 502。
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图4
Danhong注入(济)的影响,利用(XDI)对Mailuoning注入(MLNI)和Fufangkushen注入(FFKSI)细胞数(a),核区(b),线粒体质量(c),线粒体膜电位(d)和等离子体膜透性(e)。HepG2细胞接受济,XDI,对MLNI, FFKSI。FFKSI(100倍稀释)和XDI(100倍稀释)对造成偏离的对照组明显降低细胞的数量(一个)。女士的显著增加是引起XDI(100倍稀释)对(b)。所有FFKSI组(100 - 300 - 500 - 800,和1000倍稀释)诱导MMP的减少(d),数据表示为意味着±SEM。 , , 。
3.3。中药注射剂在亚急性毒性试验的效果

确认HCA的结果,亚急性动物毒性试验。所有54动物受到的亚急性毒性试验,四人牺牲在实验中,两个从FFKSI高剂量组,一个从FFKSI低剂量组,一个从XDI高剂量组对(表1)。动物的高剂量FFKSI组,观察抽搐在六大鼠药物注射后立即和持续近3分钟。因为强烈的不良反应发生在与高剂量组FFKSI,老鼠尸体剖检和所有的器官和组织都经常在第14天进行处理。FFKSI低剂量组大鼠体重增加缓慢。注射后的第七天,老鼠易怒和皮毛变得淡棕色。下肢的鼠药物管理局23日后瘫痪了,老鼠2天后死亡。在XDI高剂量组对大鼠的体重增加缓慢,皮毛是乏善可陈。大鼠下肢瘫痪了17日一天后注入和河鼠3天后死亡。

表1
亚急性毒性试验表型变化。

四个注入大鼠的生长的影响如图所示5。体重显著降低FFKSI高剂量和低剂量组( )以及在XDI低剂量组(对 分别)16.9%,26.8%,和16.0%(图5(一个))。济和MLNI并未改变体重后28天的注入。XDI在高剂量(对 )以及MLNI低剂量和高剂量组( )降低肝脏重量比体重与对照组相比显著(图5 (b)),而济和FFKSI没有改变它。

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图5
体重(a)和肝脏重量比老鼠的体重(b) 28天注射Danhong注射后,利用,Mailuoning注入,Fufangkushen注入。数据给出均值±SEM、 , 。
3.4。4通过血清生化分析中药注射剂的效果

28天后管理四个注射,血清AST的活动,ALT, TG,高山酶组对照组相比没有明显变化。不影响肝功能4观察中药注射剂引起的血清生化研究。

3.5。中药注射剂对肝脏抗氧化酶的影响活动和脂质过氧化作用

进一步评估抗氧化的四个注射对肝功能的影响在活的有机体内、SOD、MDA、猫和谷胱甘肽测定。如图6、SOD、MDA、猫和谷胱甘肽4中药注射剂的活动并没有显示出明显的变化除了FFKSI的高剂量组。猫的活动FFKSI高剂量组( , )减少40.4%相比空白;与此同时,MDA活动( , )显著增加了70.0%。它表明,高剂量的FFKSI增加活性氧(ROS)和肝组织的抗氧化能力下降,按照减少HCA试验中发现的MMP的建立。XDI高剂量组对的SOD值低于所有其他群体;MDA水平也高于其他组除了FFKSI高剂量组没有显著差异。它表明,长期使用XDI在高浓度也可能导致对某些氧化损伤肝脏(图7)。

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图6
血清AST (a)、ALT (b), TG (c),和高山(d) Danhong注入剖面,利用,Mailuoning注入,Fufangkushen注入四周治疗后大鼠。数据给出均值±SEM对每个点每个点至少有四个独立的老鼠, , 。
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图7
Danhong注入的影响,利用,Mailuoning注入,Fufangkushen注射SOD (a), MDA (b),猫(c)、谷胱甘肽(d)在肝匀浆。FFKSI高剂量组,猫活动下降非常显著(b)和MDA浓度显著增加(c),数据给出的意思是±SEM、 , 。

4所示。讨论

增加中药注射剂在临床实践中的应用,安全问题已经增加。四种中药注射剂研究在这项研究中被广泛应用于临床实践在中国大的患者人群。2013年,四个注射的销售额总计超过40亿元人民币。不同程度的肝毒性中药注射剂ADR报告的四个收集临床中心和SFDA报告。XDI和MLNI对ADR报告信息公告(8,9]。FFKSI增加ALT、AST和高山(7];XDI增加对ALT、慢性乙型肝炎和肝硬化的临床治疗(10,11]。MLNI ALT和AST增加68 - 229 U / L和30 - 157 U / L 2周后使用的12,13]。济的ADR发生率相对较低(5.15 )[14),其肝毒性不良反应很少记录。因此,快速、准确的方法是上市后需要重新评价中药肝毒性的注入。

细胞分析已经越来越多地用于预测药物毒性(23),这是一种有效的手段来减少对动物的依赖。多参数HCA化验迄今为止应用于测量基因毒性、肝毒性,药物引起的phospholipidosis和发育神经毒性。肝毒性,O ' brien et al。5]应用HCA和测试243个已知的肝毒性药物使用人类肝细胞HepG2的特异性为98%,敏感性为93%。根据O ' brien的工作,活细胞multiparametric HCA细胞毒性试验是由亚伯拉罕et al。24]。17个化合物与不同的肝毒性机制进行评估。HCA的能力分析与不同的机制被批准敏感检测。加赛德et al。25)开发对人类肝细胞HepG2 HCA肝毒性试验和144种化合物进行了评估。的特异性和敏感性分别为58%和75%,分别。然而,HCA-based肝毒性试验没有试图评估药物组合或中药或中药复杂的化学成分毒性和潜在的多个因素。由于其复杂的化学性质、安全性评价中药制剂一直是一个具有挑战性的任务,尤其是在提供一个瀑特异性毒性和机械的见解。确定多个细胞与细胞健康相关的参数应用microfluorescent,多功能探针技术同时使HCA的合适工具安全评价中药制剂具有复杂的化学物质。相比常规化验,HCA的高灵敏度分析可以提供清晰的图像细胞和量化多细胞生物标志物来评估化合物的影响和分析毒性的发病机制。长期和急性毒性测试在不同的动物物种对于新药的批准是必要的。然而,不可预知的ADR仍然无法避免根据时间监测。HCA的分析建立在人类细胞是高度预测药物引起的肝损伤。它可以用于药物发现和时间重新评估优化复合系列的安全性,并提供一个风险评估工具对候选人选择更高的产出和敏感度。

FCCP和对乙酰氨基酚的浓度中位数指IC 50轻歌剧HCA分析协议的5.2系统μM和1.3毫米。盐酸阿霉素浓度最低的是设置为0.1μ根据先前的研究[M4]。为了证实剂量反应关系,FCCP (0.32 -100μ-100米),对乙酰氨基酚(0.001毫米),和盐酸阿霉素(0.001 -100μ米)。由于没有足够的证据使用的数量之间的关系在体外细胞实验和临床剂量的中药注射剂,制定选择计算的最高浓度注射HCA化验。考虑以下: 60是成人的平均体重, 是中药注射剂的临床剂量(mL·公斤吗−1d−1),5000年平均血流量(mL)的成年人,和50%的体积比是血细胞在等离子体。济的临床剂量为0.67毫升·公斤−1d−1;例如,100倍稀释济计算和设置为最高浓度(26]。

在亚急性动物测试,根据“中药新药研究指导”(27),1.2倍的临床剂量设置为低剂量组与政府4.4毫升·公斤−12.2毫升·公斤−11.3毫升·公斤−1和2.2毫升·公斤−1济,XDI,对FFKSI MLNI,分别。同时临床剂量高剂量组的6倍。

考虑到需要一个增殖细胞模型预测细胞毒性研究的有效性选择HepG2人类细胞的细胞系药物安全性评价了其他研究的支持。Schoonen等人发现他们预测略高于海拉,ECC-1, CHO-k1cells [15,16]。其他人也有类似的发现(Bugelski et al . 2000年)(17]。细胞与代谢能力(HepaRG细胞)和形态学的代表在活的有机体内状态(L-02细胞)可能会进一步加强后的细胞毒性检测的可预测性研究。

在这项研究中,5个参数(MS, MMP的CN, NA, PMP)同时评估评估细胞增殖,线粒体功能,细胞结构的完整性。细胞渗透染料赫斯特33342年用于定位细胞和测量纳米和CN。CN是一个最敏感的细胞健康指标直接影响药物的毒性,而NA变化表明细胞核的损伤,活细胞的DNA结合染料,π碘,PMP通过核亮度量化措施。

线粒体是最重要的一个目标网站14肝毒性药物。据的三步模型药物引起的肝损伤,MMP的减少是最重要的一步(28]。线粒体功能受损时,MMP会减少,细胞色素C和其他细胞凋亡诱导因素将从线粒体释放到胞质触发后续激活procaspase-9和下游凋亡效应物导致细胞凋亡(6,29日]。在我们的试验中,Mitotracker深红色调频和若丹明被选出的123位宾客衡量线粒体功能。罗丹明123在线粒体取决于MMP的积累而Mitotracker深红色调频污渍从MMP的线粒体没有影响。合并后的应用提高了精度严重受损的线粒体。由于线粒体是主要目标的过程中肝损伤和细胞内钙的不敏感,线粒体质量采用作为替代HCA Ca2 +膜透性的测定建立了O ' brien et al。5]。它是适合肝毒性评价复杂天然产物的化学成分。

在亚急性动物测试,4老鼠牺牲因为错误操作的注入速度和注入空气,两个从FFKSI高剂量组,一个从FFKSI低剂量组,一个从XDI高剂量组对。老鼠注射FFKSI时激烈的挣扎;观察抽搐后立即注射和持续近3分钟2 6个老鼠和老鼠死于注射高剂量组的过程。没有更多的老鼠死于注射速度被拒绝了。FFKSI低剂量组大鼠的体重增加缓慢,在注射后的第七天,老鼠易怒和毛皮变成淡棕色。管理一个大鼠下肢瘫痪了后23天注入和老鼠死后2天后。

浓度血清AST、ALT、高山和TG是肝脏健康的重要指标(30.,31日]。活动的AST、ALT和TG酶注射4显示的所有组相比无显著差异控制在28天的注入。它表明,4中药注射剂在老鼠身上不会引起严重的肝组织病理学损伤。

过多的自由基会消耗细胞内SOD,猫,谷胱甘肽和导致肝细胞(肝细胞损伤32]。MDA是脂质过氧化作用的最终产品。MDA的浓度被广泛用作标记的自由基介导的脂质过氧化损伤的肝组织(33]。根据生化实验FFKSI高剂量组,细胞抗氧化活性减弱以及MDA含量的增加和减少的猫活动肝匀浆,表明高剂量FFKSI削弱了肝细胞的抗氧化能力。浓度依赖性减少CN和MMP被发现在1000 - 100倍稀释的FFKSI HCA试验,表明FFKSI受损细胞诱导线粒体功能障碍。FFKSI引起的肝毒性可能是相对的伤害减少肝细胞的抗氧化能力,促进活性氧的形成和破坏线粒体膜结构。

100倍稀释的XDI显著减少CN,并且显著增加对HCA的女士的结果。在亚急性毒性试验,一个老鼠在XDI高剂量组对牺牲的实验。XDI低于对其他组织的SOD值而MDA水平高于其他组除了FFKSI高剂量组,尽管这些群体之间没有显著差异。此外,体重在XDI低剂量组和肝重量的比率对体重在XDI高剂量组对明显低于空白。它表明,长期使用XDI在高浓度也可能导致对某些氧化损伤肝脏通过影响线粒体的功能。高度的相关性被发现HCA肝毒性试验的结果与亚急性动物测试。

总之,我们提供了一个在体外基于单元的高含量测定用PerkinElmer HCA系统高度预测人类药物引起的肝损伤。四种中药注射剂的肝毒性测试。结果是按照亚急性动物研究。相比传统的肝毒性化验,化验是敏感和准确的高吞吐量,低成本,更少的动物需要适用于中药制剂具有复杂的化学物质。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

本研究创新团队的资金支持天津高等教育(td2 - 5031),中国国家重点基础研究发展计划(批准号2012 cb723504),中国国家自然科学基金(批准号。81202850,81202850)。