文摘

绿原酸(ChA)提出了金银花的主要生物活性化合物Japonicae红花(LJF)。42 Wistar鼠随机分为7组调查ChA的药代动力学和组织分布,通过口服LJF提取物,以布洛芬为内标,采用高效液相色谱法结合串联质谱分析。从血浆样品分析物提取和组织匀浆用乙腈液液萃取,分离上 列线性梯度洗脱,被电喷雾电离质谱在负选择多反应监测模式。成功我们的结果表明,方法具有令人满意的选择性、线性、提取复苏,基体效应,精确,精度和稳定性。使用noncompartment模型研究药物动力学资料表明ChA迅速吸收和消除。组织研究表明,最高水平观察到肝脏,其次是肾脏、肺、心脏、脾脏。总之,该方法适用于研究ChA口服后的药代动力学和组织分布。

1。介绍

金银花Japonicae红花(LJF) (金银花粳稻研究),作为传统中药,是广泛应用于风热感冒等疾病和血液热毒痢疾的主要财产清算热量和解毒作用[1]。积累的证据表明LJF等数十种化学成分绿原酸(ChA)(图1),adinoside, stryspinoside [2,3]。LJF的主要活性成分,茶不仅是最丰富的酚酸LJF也通常是用来控制LJF的确切内容的质量(4]。茶可以防止氧化和微生物感染,保护心血管系统和肝,降低血压,和减弱炎症和疼痛5,6]。此外,茶也可以抑制的复制和生存能力肠病毒71年在体外(7]和显示有效的抗菌活性和antibiofilm [8,9]。另外,茶可以减少通过抑制肝脏炎症和纤维化的toll样受体信号通路(410),减弱心肌梗死后心室重构(11],减轻急性炎性疼痛[12),防止镜片透明度和人类晶状体上皮细胞(细胞毒性13]。关于茶的多种生物活性,研究药动学特征和组织分布ChA即时要求其临床应用。


图1
绿原酸的化学结构。

在这项研究中,我们调查的药代动力学和组织分布首先从LJF ChA提取在活的有机体内利用高效液相色谱法结合串联质谱(HPLC-MS / MS)。快速和敏感HPLC-MS / MS方法开发和验证来描述ChA后的药代动力学和组织分布在大鼠口服LJF提取物。

2。实验

2.1。材料和试剂

LJF是在长沙买的。ChA,布洛芬的参考标准是由中国国家控制药品和生物制品研究所(中国,北京)。乙腈(ACN)和甲醇(甲醇)、高效液相色谱法,从默克公司收购(达姆施塔特,德国)。甲酸是高效液相色谱的品位和购买的ROE科学有限公司(中国,北京)。

2.2。动物、药品监督管理局和抽样

Wistar鼠加权180 - 220克,半男半女,从长沙购买专业生物技术有限公司(长沙,中国)。老鼠被安置了1星期,室温(22±2°C),相对湿度(45 - 60%),黑暗和12 h /光周期控制设施和免费获取食物和自来水。在这项研究中,42个老鼠被随机分配到7个组,用免费获取水和大鼠禁食12小时前被给。LJF提取物溶解20% PEG400和口服药物的剂量400毫克/公斤。

收集血样和组织样本,10点30、60、120、180和240分钟后剂量。血液样本放入肝素化微型离心机管,其次是离心法大约在11000 r / min 5分钟。由此产生的等离子层分离并存储在微型离心机管−80°C到分析。组织样本的体重迅速并投入正常生理盐水把血吸掉在滤纸,剁碎和均质生理盐溶液(1:2、w / v)彻底在冰浴。这些组织匀浆储存在−80°C到分析。

2.3。制备校准标准和质量控制样品

原液的ChA ChA被准确地准备重达10.00毫克的对照品为10毫升容量的玻璃瓶和溶解在甲醇给最终浓度为1.000 g / L,布洛芬。ChA的标准解决方案与浓度的78.20,156.30,312.50,625.00,1250.00,2500.00,5000.00和10000.00μ准备的g / L与甲醇进一步稀释股票的解决方案。布洛芬的工作方案(5 mg / L)与甲醇通过稀释股票的解决方案。所有的解决方案都储存在4°C和室温使用前。

准备标准校准样品,20μL ChA标准的解决方案添加到200年μL(控制空白血浆。混合物是vortex-mixed彻底得到最终的标准浓度的7.820,15.630,31.250,62.500,125.000,250.000,500.000和1000.000μg / L。质量控制(QC)和样品浓度为15.630,125.000和800.000μ20 g / L是由强化μ200 L ChA标准的解决方案μL(控制空白血浆。这些样本存储在−20°C。

2.4。样品制备

LJF提取物的制备操作如下:200克LJF 2000毫升85% ETOH回流三次每2小时。随后,该解决方案集中在减压和微波干燥,提取内容的16.7% (ChA)检测到HPLC-MC / MC,远高于2.51%的内容是在LJF (ChA)。

20毫升的液体内部标准(5 mg / L布洛芬)说,在分析过程中,到200年μL (biosamples组织匀浆、等离子体、标准校准样品,或QC样品添加20紧随其后μL内标液(5 mg / L布洛芬),添加;400μ我添加了乙腈沉淀蛋白。生物样本涡旋状的1分钟,在11000 r / min离心10分钟在4°C。获得的上层清液过滤通过0.22μm过滤膜,5μL上层清液的注入HPLC-MS进行分析。

2.5。仪表和HPLC-MS / MS条件

HPLC-MS / MS系统包含一个UFLC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司公司、日本),包括一个autosampler和温度控制柱室,一个API 4000质谱/质谱计(AB SCIEX,美国)与电喷雾电离(ESI)来源。峰值信号采集、集成和使用软件分析师1.5.1浓度进行测定,由AB SCIEX(美国波士顿)。

色谱分离执行站岗列 列(3μ米,4毫米×2.0毫米,Phenomenex托兰斯,美国CA)和卢娜 列(3μ米,50毫米×2.0毫米,Phenomenex)。autosampler温度维持在25°C和列在4°C。一个梯度0.01%甲酸甲醇(溶剂)和0.01%甲酸水(溶剂B)如下:使用95% B 0.00到0.50分钟,20% B在0.50到2.00分钟,95% B在2.00到4.50分钟。流量为0.4毫升/分钟。

质谱计配备一个应急服务国际公司(模式)正源进行负离子MRM模式,设置的毛细管电压4500 V;离子源的压力气体(N21是4.5×105爸和2是5.5×105Pa;气幕气体(N2)是2.0×105Pa。绿原酸的监测离子从191.1 m / z 353.0 m / z, declustering潜在的56 (DP) V,碰撞能量(CE)的21个电动车,而布洛芬从161.0 m / z 204.9 m / z, DP 53 V, CE 11 eV。

2.6。方法验证
2.6.1。选择性

为了研究潜在干扰内源性化合物可以coelute分析物和内标,200μL空白鼠血浆从六个不同的来源有或没有的标准解决方案ChA和布洛芬和血浆样品测试后的管理。

2.6.2。量化的线性和下限(LLOQ)

线性校准曲线是由绘制峰面积比( 内部标准和浓度(ChA)的 )的魅力。系列校准标准的等离子体和不同的组织准备如上望见进行分析。结果拟合线性回归分析使用 权重因子。

2.6.3。提取复苏和基体效应

计算复苏,以低(15.63 QC样品进行了分析μg / L)、中(125.00μg / L),高(800.00μg / L)浓度在上述制备方法一式五份。ChA的峰面积(A1)和布洛芬(A2)血浆样品中。此外,20μ以及600 L的内部标准μL移动阶段于200年添加到每个浓度μL的QC样品旋转30秒紧随其后。和5μL的混合溶液被注入。ChA的峰面积(A1′)和布洛芬(A2′)的血液样本。

经济复苏是通过使用下列公式计算:ChA在标准血浆样本(%)= A1 / A1′;布洛芬在标准血浆样本(%)= A1 / A2′。计算矩阵的影响(我),20μL(内部标准于200年添加到每个浓度μL QC样品;此外,600年μL空白血浆或移动阶段,30秒传得沸沸扬扬,5μL的混合溶液被注入。ChA的峰面积(A3、A4)和布洛芬(A3′, A4′)血浆样品中被记录。我可以通过使用以下公式确定:ChA在标准血浆样本(%)= A3 / A3′;布洛芬在标准血浆样本(%)= A4 / A4′。

2.6.4。准确度和精密度

为了确定盘中准确度和精密度,五个复制的低,媒介,高浓度QC样品在同一天进行,计算每个样本的浓度根据校准曲线。interday准确性和精度评估通过分析三个批次在不同的日子。数据可接受性标准如下:精度是由计算浓度和名义浓度的比值,精度是评价相对标准导数(RSD),准确度和精密度都在15%。

2.6.5。稳定

冻融稳定性是由评估QC样品三冻结和解冻周期后在室温和−80°C。短期稳定性评价的QC样品在室温下保持3 h和6 h。postpreparative稳定是由由于QC样品后6 h和12 h autosampler在4°C。ChA的长期稳定是由放置−80°C的QC样品30天。储存条件,复制的低,介质,手术后和高浓度QC样品进行了分析和实验结果都通过色谱面积并与名义值。

3所示。结果

3.1。方法验证
3.1.1。选择性

没有观察到干涉峰保留时间的车(2.1分钟)和内部标准(布洛芬,2.8分钟)(图在所有条件2)。


图2
代表质谱ChA和布洛芬。(a1) ChA空白血浆样本。布洛芬(a2)空白血浆样本。(b1)标准校准血浆样本与ChA LLOQ(7.820水平μg / L)。与布洛芬(b2)标准校准血浆样本LLOQ水平。(c1)后血浆样本ChA LJF提取管理。(c2)后血浆样品管理LJF提取的布洛芬。(d1)肝脏ChA样本。(d2)肝脏样本中布洛芬。
3.1.2。量化的线性和下限(LLOQ)

back-calculated浓度(平均数±标准差)的ChA女士代表HPLC-MS /校准标准的决心是在接受范围内。校准曲线的相关系数大于0.99,这表明一个好的线性范围从7.820μ1000.000 g / Lμg / L。ChA的LLOQ是7.820μg / L在血浆和组织样本。

3.1.3。提取复苏和基体效应

提取复苏和基体效应计算。ChA均值提取复苏三个浓度的布洛芬的94.7%和93.8%。ChA均值矩阵效应三个浓度的布洛芬的96.7%和94.9%。

3.1.4。准确度和精密度

准确度和精密度数据为内部和interday血浆样本范围内的标准(表1)。内部和interday意味着精度在5.0%以内;内部和interday精度(RSD %)值小于8%。

表1
准确度和精密度的ChA血浆样本。
3.1.5。稳定

ChA在四种条件下的稳定性数据表中列出2。在等离子体ChA已经稳定了6小时在室温下,在autosampler 12 h, 3冻融循环后,30天内储存在−80°C。

表2
血浆样品的稳定性。
3.2。药代动力学分析

药代动力学分析与noncompartmental WinNonlin 6.1软件模拟数据处理模型。意味着血浆浓度时间剖面和相应的药代动力学参数的ChA口服后在图所示3和表3。在这项研究中,我们发现ChA在老鼠迅速吸收和消除,口服生物利用度较低。ChA在等离子体的半衰期约为0.8 h;的 为0.58±0.13 h和 是1490±0.16 ug / L。

表3
ChA在口服后大鼠血浆药代动力学参数( )。

图3
口服后血浆浓度时间的魅力。每个点代表均值±6 SD大鼠。
3.3。组织分布分析

茶的浓度决定在几个器官,这表明ChA迅速增加,然后降低伴随着广泛分布。组织分布显示的最高水平是在肝脏,其次是肾脏、肺、心脏、脾脏如图4。浓度机关表明ChA代谢迅速,它几乎不能被探测到在组织4 h。


图4
ChA口服后在老鼠的组织分布。每个点代表均值±6 SD大鼠。

4所示。讨论

考虑到低溶解度的ChA, 20% PEG400被选为溶解改善ChA的溶解能力。ChA,根据我们的初步实验,主要是分布最丰富的供血组织,如肝脏和肾脏,它暗示ChA的分布可能取决于器官的血流灌注率。然后,我们探索了生物转化的主要魅力在肝脏和肾脏。ChA下降更快比肾,肝,表明肝脏与肾脏发挥了更重要的作用。此外,它可以推断出,ChA可能目标肝和诱导的保护作用。法雷尔的吸收和代谢等人研究了ChA在单层培养的胃上皮14),但细胞实验有其固有的局限性。药物动力学的ChA提取Shuang-Huang-Lian [15),银黄颗粒(16),兴建冷冻干燥器(17),或Daqingye [18在LJF)也研究了,而小。其他方法,如高效液相色谱法(17,19),但是有的/女士[15],rp - [16),或HPLCDAD [4),被用来检测查。

通过动物实验,我们可以探索LJF提取(ChA)的多种药理作用。女士和HPLC-MS /应用在我们的研究中表现出更高的灵敏度比质/女士。正如我们所知,在活的有机体内研究药代动力学和组织分布LJF提取显著(ChA)是有意义的。药代动力学的研究有助于更好地理解的效果和毒性ChA,此外,组织分布研究发现主要目标网站至关重要和占性格20.]。所以,我们第一次发现HPLC-MS / MS方法,很简单,敏感,一个高度侦探 和短 。

虽然我们建立这个方法,发现一些重要的有意义的知识,还有一些方面需要改善。药代动力学,从动物甚至人类进一步的实验数据在活的有机体内需要进行研究。组织分布,我们决定在每个器官ChA的浓度;查的方法用于量化组织需要验证,就像茶的方法应用于量化老鼠等离子体。

5。结论

总之,第一次,一个快速,简单,敏感HPLC-MS /量化的方法验证ChA女士在大鼠血浆和组织。线性,特异性提取复苏,准确性和稳定性的方法被成功建立。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

作者要感谢Zengrong教授、湖南中医药大学,他的帮助识别LJF并检测其内容。