文摘

本研究的目的是探讨sihuangxiechai汤对哮喘豚鼠模型的影响由腹腔致敏(i.p)注射卵白蛋白(OVA)和挑战卵子吸入诱导慢性气道炎症。微分单元项cytospins进行染色,染色后的解决方案。白细胞及其分类的数量在支气管肺泡灌洗液(BALF)和血液血细胞分析仪和显微镜进行评估。组织学分析肺是由苏木精和伊红染色())。interleukin-4的水平(il - 4)和肿瘤坏死因子-α(TNF -α)血清和BALF中检测到放射免疫检定法(RIA)。BALF和血液中白细胞的总数没有显著区别Sihuangxiechaitang汤治疗组和地塞米松(DXM)治疗组,但明显低于哮喘组。肺组织中嗜酸性粒细胞的百分比sihuangxiechai汤治疗组明显低于哮喘组。结果表明,il - 4和肿瘤坏死因子的水平αsihuangxiechai汤治疗组与哮喘组相比显著降低。总之,这些发现表明,sihuangxiechai汤具有保护效应在减少OVA-induced哮喘气道炎症和气道高反应性(AHR)在豚鼠模型,可能是有用的作为辅助治疗支气管哮喘的治疗。

1。介绍

支气管哮喘是最常见的慢性呼吸道疾病,严重损害人们的健康。全球哮喘的患病率明显增加,并且它被包括在发达国家发病率和死亡率的一个重要原因(1,2]。它已经被广泛认识到哮喘的特征是结构性改变航空公司(3)和可变度的慢性炎症会导致反复发作的喘息、呼吸困难、胸闷和咳嗽。这种慢性疾病也会引起支气管痉挛,支气管粘膜水肿增厚,嗜酸性渗透,支气管壁重构,和过多的粘液生产和最终会导致气道阻塞(4- - - - - -6]。这些反应被称为气道重塑,这被认为是由于不平衡发生在气道再生和修复的机制。最近的研究表明,哮喘是一种慢性气道炎症性疾病,是由多种细胞和嗜酸性粒细胞(Eos)一样,肥大细胞,中性粒细胞,T淋巴细胞、气道上皮细胞,细胞因子(7]。这些细胞分泌一些化学介质,如主要碱性蛋白(MBP),嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP),嗜酸性粒细胞过氧化物酶(促红细胞生成素)、脂类生态系统、弹性蛋白酶,Th2细胞因子,如il - 4 (IgE合成的开关因素),IL-5, IL-13 [8]。因此,这些细胞被认为是基础和治疗研究的主要目标。其中,Eos加上Th2细胞因子il - 4, IL-5,在哮喘气道高反应性和IL-13可能最终导致;它还会引起气道炎症的初始和效应阶段阶段过敏(9,10]。毒性蛋白生产和发布的Eos可以直接损伤气道上皮细胞;然后,重构与更严重的气流阻塞;因此,AHR是生产。有证据表明,Eos的气道炎症发作的风险。Eos有着重要的抗原呈递功能。它还可以作为抗原呈递细胞(APC)参与哮喘的发病机制产生的细胞因子il - 4。与此同时,il - 4也可以促进Th0分化成Th2和产生大量的细胞因子。的许多特点,哮喘被认为反映后果Th2 cell-dominated过敏原的免疫反应。此外,有浓度过敏原特异性Th2细胞在哮喘的发病机制发挥关键作用。 Airway Eos, together with IL-4, IL-5, and IL-13, may directly act on epithelial and smooth muscle cells in airway epithelium to induce mucus hyperproduction, goblet cell hyperplasia, and AHR [7,11- - - - - -13]。此外,IgE的传播中扮演着重要的角色在过敏性哮喘气道炎症。众所周知,IgE水平积极与哮喘症状的存在,敏概率(14]。

同样,肿瘤坏死因子-α(TNF -)被认为是一个重要的proinflammation和启动子在哮喘气道炎症。IL-13和TNF -众所周知装修相关细胞因子(15]。此外,哮喘炎症也诱导细胞因子释放肿瘤坏死因子-,它可以增加生产更多的炎症介质,包括引发,集落刺激因子(gm - csf),和其他细胞因子。临床观察和动物实验表明TNF -的内容在BALF高架当哮喘发作(16- - - - - -19]。

气道炎症学说的建立以来,抗炎治疗在哮喘的不可替代的作用。由于其抗炎、antiallergy和其他药理作用,糖皮质激素有成为一线治疗哮喘的药物20.]。虽然糖皮质激素可以显著改善气道炎症和抑制Eos浸润和气道炎症介质释放,它不能改变的疾病。大量的实践证明,中医药(TCM)的整体论思想和优势在合成操作治疗哮喘。在之前的报告中,中药的化合物(黄芪,honey-fried麻黄炮制黄芩,黄精,天蝎座,蜈蚣,柴胡,和桂枝)被认为是改善病人的宪法,调节免疫功能,增强抗炎和抗过敏药能力,满足临床应用(21]。例如,黄芪(黄芪)之间在中国最受欢迎的促进健康的草药;它们的使用可以追溯到2000多年前,记录神农的药物学写在汉代。它也被用于治疗糖尿病,肾炎,白血病,子宫癌22]。此外,黄芩是一种广泛使用中药历史上使用抗炎、抗癌疗法(23]。

在本文中,我们研究了sihuangxiechai汤适用于过敏性疾病的影响。卵清蛋白(OVA)被用来诱导哮喘豚鼠模型,评估可能的影响和机制sihuangxiechai煎煮和系统性炎症免疫反应。根据研究的定量分析炎症和细胞因子的作用在OVA-induced哮喘豚鼠模型,本研究的目的是探索中药处方的机制哮喘和我的新药物可以增强免疫力,改善人体的防御功能,增强抗病能力,并提供药效学和临床机制的实验依据。

2。材料和方法

2.1。动物

32岁的健康男性豚鼠(称重)从Lukang购买& Co .(中国山东济宁)。几内亚猪被安置在标准实验室条件下一周。豚鼠都提供食物和自来水随意。所有实验程序依法进行了NIH保健指南和使用实验动物,和动物处理之后中国国家动物福利法律的规定(24,25]。

2.2。材料

卵清蛋白(OVA)获得公司西格玛(σ& Co .)、美国),包装后从北京分公司购买。地塞米松是购自永宁制药有限公司(济南,山东,中国),批号:0203131。Sihuangxiechai汤在我们医院药房提供的。放射免疫检定法(RIA) il - 4和TNF -套件α买来的解放军总医院科技开发中心。活塞式压缩机喷雾器是由圣S.A. S.A. (San、阿根廷)。环形计数器是由上海公司。

2.3。制备Sihuangxiechai煎煮

这个公式是一个干煎煮的中药材(表16的混合物1)。每个药材的质量测试按照中国药典。草药浸泡在冷水,溶解在2倍体积的水,煮30分钟,过滤,并与文火煮20分钟,倒出上清液约200毫升。然后烧渣中添加沸水一样,三次重复。所有的液体都结合起来,集中到2 g / mL。此外,蝎子和蜈蚣被磨成粉,加入液体直接。

2.4。实验组和药物治疗

实验组()被随机分为4组:正常组,哮喘组、dexamethasone-treated组(DXM组)和中药组(中药组)。除正常组,其余组动物引起腹腔内注射1毫升10%卵子在0天。14天之后,oversensitized动物显示哮喘症状而吸入气溶胶的20分钟1%卵子使用活塞式压缩机喷雾器每隔一天(图6天1)。OVA-sensitized动物服用中药(10克/公斤/天)悬浮在NS(0.9%)之前30分钟口服填喂法卵子的挑战。正常组和哮喘组治疗只有NS(0.9%, 10克/公斤/天)由口腔填喂法,和阳性对照组(DXM组)治疗DXM(2毫克/公斤/天),腹腔内注射(i.p)在卵巢的挑战[26]。

2.5。支气管肺泡灌洗液(BALF)

24小时后卵子的挑战,所有豚鼠被腹腔注射戊巴比妥麻醉(50毫克/公斤,3%)。根据标准执行开胸手术。BALF收集冲洗1毫升的NS(0.9%)后立即通过气管进入肺的牺牲。大约0.8毫升的BALF三灌洗后恢复。BALF离心机(400 g, 4°C, 5分钟),上层清液储存在−70°C到测量细胞因子。BALF细胞被洗了三次与PBS和颗粒在100年resuspendedμL的磷酸缓冲溶液(PBS)。总细胞数细胞数和微分项cytospins进行染色,染色后的解决方案。200年由白细胞形态和细胞分化细胞数的四个随机位置。

2.6。血液采集

BALF收集后,豚鼠被主动脉放血安乐死。动脉血液收集在不同管与柠檬酸钠抗凝或凝胶为不同的测试和促凝血的离心机在4°C (4000 rpm) 10分钟(27]。随后,血清是储存在−70°C的测量细胞因子(20.]。

2.7。测量的il - 4和TNF -使用放射免疫检定法(RIA)

il - 4和肿瘤坏死因子-每个样品的浓度检测到放射免疫检定法(RIA)根据制造商的指示。样品和标准产品与il - 4和TNF -混合抗体在37°C,然后孵化20分钟。离心后(3500 r / min, 4°C),每个管的浮在表面的测量计数。最后,根据标准曲线,il - 4和TNF -的浓度计算。所有样品和标准在重复化验。

2.8。组织学分析

前切除肺癌、肺组织和气管吃饱了气管内的固定剂(10%甲醛)使用结扎在气管。肺组织在10%甲醛固定。组织脱水在不同浓度的乙醇和嵌入石蜡。组织病理学检查,4μ固定组织m部分被剪掉了切片机(徕卡RM 2235、微系统胡桃胡同GmbH德国),放在玻璃幻灯片,deparaffinized,沾染了)一般形态。组织损伤和炎症细胞浸润被检查使用显微镜(27- - - - - -29日]。

2.9。统计分析

所有的定量数据分析使用统计软件SPSS 17.0。所有结果都表示为手段标准错误的意思。所有统计学意义上的差异是由单向方差分析评估学生的紧随其后测试。在所有情况下,被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。中医对OVA-Induced总数的影响和微分BALF中白细胞

如表所示2白细胞的总数,BALF哮喘组()与正常组相比显著增加(,),明显高于中药组(,)和DXM组(,)。此外,Eos(图的百分比2)在中药组()与DXM组没有显著差异(,),但明显低于哮喘组(,),高于正常组(,)。中性粒细胞的百分比,上皮细胞和淋巴细胞显著更高的哮喘组相比,中药组()和DXM组()。阳性对照组,DXM组显示白细胞涌入到BALF类似的抑制效应,这表明,中药组(治疗哮喘)是更有利的。

3.2。中医对OVA-Induced道达尔和微分的影响在血液白细胞

如表所示3与正常组相比,(),血液中白细胞总数显著增加在哮喘组(,),明显高于中药组(,)和DXM组(,)。此外,Eos(图的百分比3)在中药组()与DXM组没有显著差异(,),但明显低于哮喘组(,),高于正常组(,)。中性粒细胞的百分比,上皮细胞和淋巴细胞显著更高的哮喘组相比,中药组()和DXM组()。阳性对照组,DXM显示白细胞涌入到BALF类似的抑制效应,这表明,中药组(治疗哮喘)是更有利的。

3.3。中医对OVA-Induced EOS气道炎症的影响

可以看到大量的Eos渗入通过哮喘组的肺组织(,),与正常组相比均有显著提高(,),明显高于中药组(,)和DXM组(,)。没有不同于DXM组和中药组(图3)。

3.4。肿瘤坏死因子的水平血清和BALF中il - 4

如数据所示4和5,OVA-induced哮喘组显著增加TNF -的浓度和BALF中il - 4相比,正常组(,)。此外,TNF -的浓度和中药组血清中il - 4 (,)明显低于哮喘组(,)和DXM组没有显著差异(,)。

3.5。中医对OVA-Induced EOS的影响在肺组织活检

豚鼠肺组织部分OVA-induced沾染了),使用光学显微镜检查。组织学评价肺组织表明,与正常组相比,大量炎症细胞中观察到肺部的气管和血管周围间质哮喘组(图6 (b))。结果表明,只有少数Eos和淋巴细胞分布在小支气管的正常组(图6(一))。豚鼠接受中医治疗明显下调的积累气道粘液并阻止了Eos的积累在BALF卵子挑战(图6 (c)与哮喘组相比)。同样,DXM组显示大量减少炎症和Eos浸润肺(图6 (d))。粘膜上皮是整洁和肺组织基本正常,没有明显的病理改变。

4所示。讨论

OVA-induced哮喘是一种复杂的炎症性疾病,其特征是可逆的气道阻塞,气道重塑,气道高反应性和气道炎症。随行渗透气道炎症为特征的气道壁肥大细胞,淋巴细胞,和Eos支气管上皮细胞和薄礼节20.,30.,31日]。近年来,吸入型皮质类固醇激素,白三烯受体拮抗剂或2受体激动剂被认为是最有效的方法减少气道炎症,症状,哮喘患者的发病率。然而,这些治疗方法可以产生潜在的负面影响和不持续改善气道炎症在许多哮喘个体(26,32]。因此,需要一种安全、有效方法治疗哮喘。

草药药物在哮喘的确切机制并不完全清楚,但它被认为是依赖于许多持续的炎症细胞,包括浸润淋巴细胞,Eos,嗜碱粒细胞和巨噬细胞,激活,然后各种炎性介质和细胞因子的合成和释放(7,20.,33,34]。在这项研究中,我们演示了sihuangxiechai煎煮和哮喘之间的相关性。董et al。27]显示肺组织的组织学证据分析,不同程度的炎症出现在所有OVA-induced动物。然而,哮喘大鼠出现更严重的炎症比治疗组(炎性细胞涌入),和更严重的炎症是发现DXM组相比,中药组。我们的数据表明,BALF和血液中白细胞的总数哮喘组显著高于其他组(),和大鼠治疗药物呈现明显降低与哮喘大鼠()。这个结果表明sihuangxiechai汤OVA-induced哮喘有影响。此外,君威(35和霍尔盖特et al。36)得出的结论是,Eos气道炎症已被证明是过敏性哮喘的基本特征之一。在我们的研究中,中医组Eos浸润的比例显著降低BALF和血液在卵子挑战(图2与哮喘组相比)。同样,DXM组显示大量减少炎症和嗜酸性渗透到肺(图6 (d))。这些发现符合显著增加的证据提出中药组血清Eos水平。

关等。37]表明,充分评估炎性细胞,细胞因子,趋化因子,抗炎分子对理解至关重要,监控,和治疗肺部疾病。此外,Stow et al。38)得出的结论是,il - 1il - 4, IL-13, TNF -已发现减少炎症反应的严重程度。Larche et al。39]和Bisset Schmid-Grendelmeier [40)显示,过敏性哮喘的特征是不平衡的Th1 / Th2细胞和招募2型T辅助(Th2)细胞。主要Th1细胞分泌细胞因子- 2、干扰素-和肿瘤坏死因子-;主要Th2细胞分泌细胞因子il - 4、IL-5, il - 6, IL-9, IL-13 [27]。通过制造和释放促炎介质,Eos可以放大的表达Th1、Th2, Th17细胞因子和趋化因子建议他们[适应性免疫反应中发挥重要作用41]。激活Eos可以分泌一些基本的蛋白质,也可能与哮喘的病理生理学MBP等项目,和促红细胞生成素(8]。先前的研究已经表明,MBP可以增加血管通透性,支气管收缩,气道上皮损伤;然后重构与更严重的气流阻塞有关,和在哮喘气道高反应性。在我们的研究中,我们发现,il - 4和TNF -的浓度BALF中或血液中医组都显著低于哮喘组(,)和与DXM组没有显著差异(,)。这些结果表明il - 4和TNF -参与了哮喘的发病机理和发展。此外,这些结果表明,sihuangxiechai汤对il - 4的内容产生了抑制作用,肿瘤坏死因子-。

Sihuangxiechai汤是由Xiaoqinglong汤,Xiaochaihu汤,和蝎子和蜈蚣粉允许加法和减法。黄等。42]认为Xiaoqinglong煎煮和shegan麻黄汤被广泛应用于临床并收到良好的疗效。在这个处方,黄芪与honey-fried麻黄炮制黄芩,黄精,天蝎座,蜈蚣,和柴胡也被用来作为传统草药镇静剂,抗痉挛,增进食欲,补药,利尿剂,和局部杀菌性能,以提高抗炎的作用,抗过敏药,antirheumatism和免疫抑制。在我们的研究中,炎性浸润细胞在支气管或降低中药组哮喘组以上,表明sihuangxiechai汤对支气管哮喘炎症疗效(图6)。

总之,这项研究清楚地表明,sihuangxiechai汤不仅具有明显的退热止咳药,祛痰剂和平喘药效果还能缓解临床症状和哮喘的迹象。两个中医和DXM组表明,Eos浸润在不同程度降低,从而确认处方不仅可以降低外周血Eos数量也减少Eos招募到气道的可能性。另外,处方可以抑制毒性蛋白的损伤是发布的EOS和气道高反应性的形成。总之,OVA-induced哮喘治疗sihuangxiechai汤是通过多种机制来实现他们的好的治疗;同时,该方法为临床应用提供科学依据。

5。结论

这个研究表明,sihuangxiechai汤不仅减少白细胞的浸润(尤其是Eos)也抑制气道高反应性如气道重塑和组织病理变化。总之,结果表明,sihuangxiechai汤可能是一个新的潜在治疗哮喘的管理在人类和抑制气道炎症在支气管哮喘大鼠模型。应进行进一步的研究,阐明其具体的作用机制。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

雪萍黄和En薛涛的贡献同样工作。

确认

作者感谢慷慨的财政支持的国家关键技术研发项目科学技术部(没有。2013 ga740103),中国国家自然科学基金(没有。山东省自然科学基金,81370628),中国(ZR2012CM025),给予支持,山东省的科技开发项目(2012 yd18063)和山东省高等教育科学,技术项目(J11LF67)。