文摘

急性肝损伤引起的对乙酰氨基酚过量是一个重要的临床问题,可能受益于新的治疗策略。客观的。本研究调查了王亚南的效果胸腺寻常的精油(TEO),广泛用于各种有利影响,如杀菌、驱风剂,抗菌效果。张志贤的王亚南活动是由评估血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)的老鼠。他们的肝脏被用来确定髓过氧化酶(MPO)酶活性,进行组织学分析。体外抗氧化活性评价是评估自由基2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH•)清除张志贤和TEO-induced脂质过氧化的影响。张志贤血清标志物的水平降低酶AST, ALT,高山和MPO活性。组织病理学分析表明,张志贤阻止acetaminophen-induced坏死。精油也表现出抗氧化活性,反映在其DPPH自由基清除效果和脂质过氧化反应试验。这些结果表明,张志贤王亚南对acetaminophen-induced肝损伤小鼠的影响。

1。介绍

对乙酰氨基酚(APAP即)大剂量会导致严重的肝损伤,可能发展成肝衰竭(1]。对乙酰氨基酚引起的肝毒性发生通过生物转化反应,形成了活性代谢物N-acetyl-p-benzoquinone亚胺(NAPQI)的细胞色素p - 450混合功能氧化酶系统。代谢物是正常解毒通过共轭反应减少谷胱甘肽(GSH)。然而,在大剂量的对乙酰氨基酚,NAPQI水平增加,最终耗尽谷胱甘肽的水平。随后,巯基组肝蛋白质可能与活性代谢产物发生反应,导致肝坏死(2,3]。肝细胞变性和坏死也与高水平的酶标记,如血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)表明肝毒性(4]。对乙酰氨基酚引起的肝损伤小鼠实验模型是一种常用的筛选与潜在王亚南物质活动(5]。日益增长的兴趣一直在观察这些自然实体的分析对人类健康的潜在好处。加速在民间医学研究的植物用于治疗肝脏疾病和促进肝功能已经完成。在植物精油是天然的萜烯的混合物,主要是单萜和倍半萜烯,已被越来越多的用于补充疗法因为精油通常来源丰富的植物化学的混合物(6]。

精油提取新鲜的叶子和花可以用作香味添加剂在食品,医药,化妆品(7]。百里香的叶子(胸腺寻常的)可以使用新鲜或干香料。百里香也拥有各种有利影响,包括杀菌、驱风剂,抗菌和抗氧化效果8]。最近,在我们实验室表明选民,百里香酚和香芹酚,胸腺寻常的l .精油存在对炎症反应的影响(9]。此外,精油和酚类化合物,如百里香、麝香草酚抗氧化性质和可能王亚南属性(8,10]。据我们所知,稀缺的信息的影响胸腺寻常的精油(TEO)肝毒性实验模型。因此,本研究调查了王亚南的TEO acetaminophen-induced肝损伤小鼠。

2。方法

2.1。提取精油

新鲜的叶子胸腺寻常的l .收集从高深Irenice席尔瓦药用植物花园Maringa州立大学的校园里,巴拉那河、巴西。树叶被植物学家Maria识别和验证Aparecida泽特。凭证标本的标本存放在美国植物学、Maringa州立大学(11329)。精油是通过使用Clevenger-type hydrodistillation装置。大约556克的叶子受到蒸汽蒸馏2 h。石油在硫酸钠干燥和存储在一个琥珀瓶在4°C。张志贤收益率为1.76% v / w。

2.2。精油分析
2.2.1。气相色谱分析-质谱法(gc - ms)

气相色谱(GC)分析用热电子公司,专注GC模式,在下列条件:DB-5毛细管柱(30 m×0.32毫米,0.50毫米);柱温、60°C(1分钟)到180°C 3°C /分钟;喷油器温度220°C;检测器温度220°C;分流比1:10;载气他;流量:1.0毫升/分钟。注入量1μL稀释在氯仿(1:10)。的GC / MS分析四极质谱仪(热电子公司,DSQ II模型),在70 V操作。识别单个组件是基于比较的GC无极的列上的保留指数(RI)和比较正宗的标准从Sigma-Aldrich购买文学与质谱数据。

2.2.2。核磁共振(NMR)

1H(300.06兆赫)13C NMR(75.45兆赫)光谱被记录在氘氯仿(CDCl3)解决方案在水星- 300 bb光谱仪δ(ppm)和光谱CDCl引用3(δ7.27177.00 H和13C)作为内标。

2.3。动物

雄性Balb / c小鼠,称重 g,提供由中央Maringa州立大学的动物屋。动物们被安置 °C下12/12 h光/暗周期。实验前,动物禁食一夜之间,与水随意。实验在动物实验伦理委员会批准的协议是州立大学的Maringa (CEAE / UEM 126/2010)。

2.4。对待动物

实验动物被分成6组,每组五个动物。首先,每个小组在7天收到口头以下治疗:组我,老鼠没有接受任何治疗。在第二组中,老鼠收到TEO车辆(生理盐水中包含了0.1%的渐变80)。在团体III-V,老鼠用张志贤125剂量的预处理,250和500毫克/公斤,分别。在第六组,老鼠使用标准的药物,水飞蓟素(200毫克/公斤)。这一次后,动物禁食8 h,然后收到口头对乙酰氨基酚在第七天的剂量250毫克/公斤组族化合物。集团我口头收到盐水含有0.1%渐变80 (APAP即车辆)。12 h后,老鼠与氟烷麻醉,决心和血液收集的血清AST、ALT、碱性磷酸酶(ALP)。肝脏被用来确定髓过氧化酶(MPO)酶活性和组织学分析。

2.5。测定血清ALT、AST和高山的水平

血液样本收集和离心机在3000 g×15分钟在4°C。血清ALT、AST和高山水平然后用分析黄金酶检测组件。

2.6。MPO活性测定

肝脏被用来确定MPO中酶活性匀浆上清液的肝脏部分,它被放置在磷酸钾缓冲中含有溴化hexadecyltrimethylammonium波特均质器。匀浆搅拌在一个漩涡和离心机。10毫升的上层清液添加到每个在96孔酶标一式三份。的缓冲溶液二百毫升水中含有16.7毫克O邻联茴香胺盐酸盐(σ),重蒸馏的水90毫升、10毫升磷酸钾缓冲,50μL 1%的H2O2是补充道。酶促反应被添加醋酸钠停止。酶活性测定的吸光度测量使用Max +微型板块光谱分光光度计460海里。

2.7。组织病理学分析

肝脏清洗在0.9% (w / v)氯化钠溶液,放入10%中性缓冲福尔马林固定。随后,肝脏加工石蜡包埋,切片,均在semiserial 6μ在徕卡m厚度旋转切片机(Gladesville徕卡微系统公司、新南威尔士、澳大利亚)。部分被苏木精和伊红染色评估组织形态使用光学显微镜(奥林巴斯BX-41、东京、日本)。分级病变是主观分类为缺席,根据损伤轻微、中度或严重的区域。

2.8。脂质过氧化作用分析

进行脂质过氧化作用分析与一个小修改之前报道(11]。蛋黄匀浆lipid-rich媒体就做好了准备。简单地说,0.1毫升的TEO(5、50、500、2500和5000μg / mL)与0.5毫升的甲醇完全混合蛋黄匀浆(10%,v / v,与纯水稀释)和由1毫升纯水。硫酸亚铁(50μL, 70毫米)添加诱导脂质过氧化反应,混合是孵化为30分钟37.5°C。之后,1.5毫升的20%乙酸(v / v, pH值3.5,与纯水稀释)和1.5毫升的0.8% (w / v)硫代巴比土酸十二烷基硫酸钠1.1% (w / v,与纯水稀释)被添加,以及由此产生的混合物在95°C涡和激烈的60分钟。冷却后,5毫升1-butanol被添加到每个管和离心机每分钟5000转了15分钟。有机上层收集和测量spectrophotometrically使用贝克曼在532 nm du - 65分光光度计。精油稀释在甲醇(溶剂表示没有抗氧化活性)。抗坏血酸作为一个积极的控制。脂质过氧化的抑制是计算如下: 被认为是控制的吸光度(即。,甲醇,而不是样本)。的集成电路50值,代表精油的浓度,导致脂质过氧化的抑制铁的50%2 +/抗坏血酸盐系统,是由线性回归分析获得的抑制(%)值。

2.9。DPPH实验

免费自由基清除能力(RSC)是通过测量评估2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil TEO (DPPH)清除活动。如前所述(执行的DPPH实验12),小的修改。样品(60 - 2500μg / mL)在甲醇和1毫升的25毫米DPPH•解决方案(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),外加95%的甲醇最后一卷4毫升。最终的解决方案和空白的吸光度(即。,with the same chemicals, with the exception of the sample) were recorded against ascorbic acid (Chem Cruz; used as a positive control) after 30 min at room temperature. For each sample, four replicates were recorded. The disappearance of DPPH• was measured spectrophotometrically at 515 nm using a Beckman DU-65 spectrophotometer. The percentage of RSC was calculated using the following equation: 。的集成电路50价值,代表精油的浓度,导致RSC抑制,50%是由线性回归分析获得RSC的值。

3所示。结果

香芹酚的百里香精油表现出优势(45.54%),α松油醇(22.96%)、和endo-borneol(14.29%)为最主要的组件(数据未显示)。的急性毒性研究,张志贤口头测试显示LD50 4.000毫克/公斤的价值。本研究中使用的剂量都是最低的LD50观测值。因此,没有副作用明显行为研究中观察到的动物。高LD50值也表明TEO相对安全、无毒的动物。

我们评估张志贤对血清酶标记的影响。如表所示1,acetaminophen-induced肝损伤显著升高血清ALT, AST,高山酶水平与正常的动物。预处理与250和500毫克/公斤TEO但不是125毫克/公斤TEO 7天前对乙酰氨基酚政府明显降低血清ALT, AST,高山水平相比vehicle-treated控制。张志贤也与水飞蓟素的影响,一个标准的王亚南代理。

表1
胸腺的影响精油对肝损伤的生物标志物。

MPO的活性TEO-pretreated小鼠接受剂量的250和500毫克/公斤明显减少( 和 IU / L, resp)。相比之下,只收到的对乙酰氨基酚( 国际单位/ L;表1)。

对照组(APAP即车辆)的组织病理学分析(图没有显示肝细胞损害1(a))。然而,acetaminophen-treated组显示严重伤害表现为出血性坏死区域,炎性浸润和piknotic核,(图1(b))。考虑到sylimarin集团(标准药物),虽然肝实质不存在同质,坏死区域没有观察到。同时,嗜碱细胞细胞核是比控制老鼠和许多细胞的细胞质液泡化,显示轻伤(图1(c))。群动物对待TEO 125毫克/公斤显示点缀坏死区域与非坏死性区域,与细胞质液泡化和出血性点,中度损伤(图的特征1(d)),以不同的方式观察张志贤250毫克/公斤治疗后,观察轻度损伤,表现为嗜碱性的细胞核几乎piknotic收缩水平(图1(e))。此外,500毫克/公斤的TEO治疗组显示肝实质与对照组(图形态相似1(f))。因此,张志贤似乎提供重要的保护肝细胞损伤。


图1
显微照片的老鼠的肝脏收到口头(a)盐,(b)对乙酰氨基酚在治疗的最后一天(250毫克/公斤),(c)水飞蓟素(200毫克/公斤),和((d) - (f))对乙酰氨基酚,治疗后7天的精油胸腺寻常的(TEO), 125、250和500毫克/公斤,分别。在(a)肝脏正常的形态;(b)的坏死和出血点定义的地区(*);((c)和(e))实质是因有液泡的肝细胞(箭头);(d)观察坏死区域(*);(f)肝实质形态类似于观察到的控制。原始放大40 x (a), (c)、(e)和(f);原来放大20 x (b)和(d)部分与苏木精和伊红染色。

在DPPH测试中,张志贤采取行动的能力作为氢供体原子或电子的变换DPPH•减少的形式(DPPH-H)测量spectrophotometrically。RSC的TEO 60 - 2500的浓度μg / mL显示显著的体外抗氧化活性(IC50= μg / mL;图2(一个)、表2)。的集成电路50抗坏血酸(即价值。,积极控制) μ在DPPH实验(图g / mL2 (b)和表2)。

表2
摘要集成电路50百里香精油的值(TEO)和抗坏血酸。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图2
精油的抗氧化活性胸腺寻常的。的图中显示的百分比中和DPPH (a)的精油作物和(b)在DPPH测定抗坏血酸(µg / mL)。脂质过氧化的抑制铁(LP)2 +/抗坏血酸盐系统(c)引起的精油作物和(d)抗坏血酸在稍后通知试验也显示。

蛋黄脂质进行快速的脂质过氧化作用在孵化硫酸亚铁的存在。张志贤对非酶的过氧化反应的效果如图2 (c)和表2。5 - 5000的浓度μg / mL,张志贤显著抑制脂质过氧化反应(IC50= μg / mL)。的集成电路50抗坏血酸(即价值。,积极控制) μg / mL的脂质过氧化反应试验(图2 (d)和表2)。因此,张志贤与总抗氧化活性显著相关 ,证明TEO抗氧化活性。

4所示。讨论

在目前的研究中,它是评估的王亚南TEO使用对乙酰氨基酚引起的肝毒性模型。这种药物过量(即。,at doses that are different from analgesic doses that are safely and effectively used therapeutically) can induce severe hepatotoxicity in experimental animals and humans [13- - - - - -15]。在我们的工作中,肝毒性被明显反映出海拔血清标志物水平的酶(AST、ALT和高山),MPO活性,增加和组织病理变化。这些酶在血清是有用的定量肝细胞损伤的范围和类型的标记。高水平的AST表明肝脏的功能完整性,类似于病毒性肝炎,影响心脏违规,和肌肉损伤。ALT酶催化丙氨酸丙酮酸和谷氨酸的转换是在类似的方式发布。因此,ALT更特定于肝脏,因此是一个更好的参数检测肝损伤(16- - - - - -18]。

对乙酰氨基酚转化为有毒的活性中间叫N-acetyl-p-benzoquinone亚胺(NAPQI)代谢后的数量同功酶的细胞色素p - 450 (CYP),也就是说,CYP 2 e1 (19),CYP 1 a2 [20.),CYP 2 a6 [21),CYP 3 a4, CYP 2 d6 [22]。可以绑定共价NAPQI细胞蛋白质,包括线粒体蛋白质(23),这反过来会导致线粒体功能障碍。线粒体呼吸受到抑制,导致形成的活性氧(ROS)和线粒体(过氧亚硝基24,25]。活性物种的大规模生产(ROS)可能会导致损耗的保护性生理(谷胱甘肽和半个α生育酚),随后的烷基化的广泛传播以及过氧化反应,导致重要大分子损伤生物膜(26]。然而,减少谷胱甘肽的主要防御机制与氧化应激减少过氧化物,氢过氧化物(27]。此外,氧化应激可以诱导线粒体膜通透性转换和腺苷′三磷酸腺苷(ATP)损耗导致膜透化作用,膜破裂,细胞凋亡28- - - - - -31日]。

我们评估了王亚南的TEO acetaminophen-induced肝损伤小鼠,结果表明,预处理和TEO可以保护肝细胞的功能完整性和细胞膜毒性活性代谢物的影响所产生的对乙酰氨基酚生物转化(32,33]。

炎症也起着核心作用在花生四烯酸代谢的药物引起的急性肝炎和产品已广泛参与炎症过程(34]。肝脏的组织病理学分析从TEO-pretreated集团获得温和正弦拥堵,减少炎症细胞浸润,保存完好的肝细胞坏死的区域较少较严重的小叶中心的坏死中观察到acetaminophen-treated老鼠。这些结果表明,消炎的TEO部分参与王亚南的精油。同样,以前的研究已经表明提取物对乙酰氨基酚过量的植物保护肝脏,这表明王亚南可以被认为是一个表达式的功能改善肝细胞,加速细胞再生的结果(35,36]。因此,cytoprotective水飞蓟素的影响,天然产品,也主要是由于它的抗氧化和自由基清除自由属性。水飞蓟素可以直接与细胞膜交互组件,以防止异常脂质部分的内容,负责维护正常的流动性(37]。

此外,自由radical-initiated细胞膜脂质氧化会导致细胞坏死,现在接受的是重要的在不同病理条件。对乙酰氨基酚的剂量显著高活性氧水平升高,最终消耗的水平在肝组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽。这种氧化应激导致的肝损伤的发生和发展33]。细胞凋亡是细胞死亡的一种形式,有害的后果中观察到许多疾病,包括获得性免疫缺陷综合症,癌症,神经退行性疾病(38- - - - - -40]。细胞凋亡诱导氧化剂等不同的刺激,外源性物质,糖皮质激素,辐照41),收敛于触发细胞死亡的常见途径,激活蛋白酶caspase-3发现只在细胞发生凋亡。蛋白酶caspase-3可以分裂和核蛋白质聚灭活(ADP-ribose)聚合酶(PARP),用于DNA修复酶。许多生物活性物质在细胞周期进程发挥它们对细胞凋亡作用的影响和/或触发凋亡细胞死亡。然而,精油诱导或抑制细胞凋亡的影响通过线粒体压力和半胱天冬酶激活是有争议的42- - - - - -45]。因此,各种精油已经证实有抗氧化活性,用作抗氧化剂在许多疾病的药物(46- - - - - -48]。天然产物的能力减少acetaminophen-induced脂质过氧化可能是由于他们的抗氧化成分49]。张志贤减少自由基物种的机制及其对细胞和组织损伤的影响应该阐明。

5。结论

张志贤预处理提高了小鼠的对乙酰氨基酚引起的肝毒性。张志贤部分的影响涉及这个精油的抗氧化效果。然而,需要进一步的详细研究探讨张志贤施加其影响的机理,并确定具体的选民负责这一行动。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢Jailson Araujo Dantas本人交出密码和西莉亚Regina米兰达的技术援助。本研究支持由Coordenadoria de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(披肩),Fundacao南洋杉,和慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq),巴西。