文摘

肠梗阻是一种常见的疾病需要腹部手术与重大的发病率和死亡率。目前,阻塞的有效治疗,除了手术切除或减压,不存在。Si-Jun-Zi汤是一个著名的中药用于补充气和振兴脾脏的功能。现代药理研究表明,这个处方可以改善肠胃功能,增强免疫功能。在这项研究中,我们调查的影响,一个著名的中药配方,Si-Jun-Zi煎煮,恢复肠道功能缓解梗阻后兔模型。我们发现Si-Jun-Zi汤能减少肠粘膜损伤,同时促进小肠的复苏。此外,Si-Jun-Zi汤能调节肠道免疫系统。我们的研究结果表明,Si-Jun-Zi汤促进肠道功能恢复阻塞后通过调节肠道内稳态。我们的观察表明,Si-Jun-Zi汤为肠梗阻是一个潜在的治疗药物。

1。介绍

肠梗阻是一种常见的疾病需要腹部手术与重大的发病率和死亡率。肠梗阻通常发生在小肠或大肠(1]。无论初始阻塞的原因,发生的一系列病理生理变化阻塞段。这些变化负责症状,如腹胀、呕吐、腹部绞痛,便秘和可能导致肠道衰竭(2]。

小肠的功能依赖于肠道的正常和平衡体内平衡,而肠道内稳态取决于之间的复杂交互肠道上皮细胞和肠道免疫系统3]。在细胞水平,肠道上皮细胞之间的动态串扰(iec)和局部免疫细胞代表肠道内稳态的基本功能之一。这些相互作用不仅是重要的肠道疾病,如炎症性肠病的发病机制、克罗恩病、肠阻塞,但也基本维持正常肠道内稳态4]。我们之前的研究表明,肠阻塞会引起严重的功能障碍,肠道内稳态。肠上皮细胞和肠道免疫系统明显削弱了阻碍进展。因此,恢复肠道内稳态可能是一个有吸引力的人类肠梗阻的治疗策略。

中药Si-Jun-Zi汤是一个著名的草药配方组成的四种中草药:人参根,白术macrocephala、甘草和云苓根。这个公式在本质上被认为是温和的。它平衡气,并能刺激脾脏。现代药理研究表明,该处方影响其他生理功能等改善胃肠道功能(5),加强免疫系统(6,7),改善骨髓造血功能,加速红细胞的生产。这个处方也可以用于治疗消化道恶性肿瘤(8]。肖和阳发现Si-Jun-Zi汤可以提高免疫功能和生活质量和减少化疗的副作用在结直肠癌患者接受化疗7]。刘等人发现Si-Jun-Zi汤可以促进葡萄糖的复苏的小肠吸收利血平诱导Pi-qi虚证大鼠(9]。修改Si-Jun-Zi汤可以减缓prednisone-induced骨质疏松症的形成通过促进成骨细胞分化和抑制osteoclastogenesis [10]。郭等人的临床观察发现,Chenxia Si-Jun-Zi汤能促进胃肠道功能恢复,减少严重的病人的住院天数(5]。然而,Si-Jun-Zi汤的疗效肠梗阻病例是未知的。

在目前的研究中,我们调查的影响Si-Jun-Zi煎煮后恢复肠道功能缓解梗阻的兔模型。我们的研究结果表明,Si-Jun-Zi汤促进肠道功能的恢复通过调节肠道内稳态。我们的观察表明,Si-Jun-Zi汤可能对患有肠梗阻的潜在疗效。

2。材料和方法

2.1。动物和试剂

健康新西兰兔的体重3公斤2.5被用于这项研究。动物们从混合购买实验动物中心(天津)和维护在温控房间12 h与获得常规光/暗周期和食物和水。实验程序批准天津医科大学实验动物保健委员会。根据指南所有动物得到照顾的护理和使用实验动物(NIH,马里兰州贝塞斯达)。Si-Jun-Zi汤是由南开医院的医药制剂部分(天津)。这个公式是由茯苓根(Scierotium poriae可可),人参根(人参),白白术粉末根(根茎中药材白术macrocephalae)、甘草(甘草的比率)3:3:2:2(60克,茯苓根人参根60克,粉末根60克,甘草40 g),被淹没在2.2升蒸馏水为30分钟,然后“煮两次(2 h /时间),然后过滤,浓缩为1 g / mL使用常规方法,并存储在一个冰箱在4°C到使用。

2.2。描述实验的团体和兔子肠梗阻模型

36个新西兰兔随机分为六组:虚假手术对照组(假的),48 h后梗阻组(),自然复苏后48 h或96 h救援的阻塞组(,),Si-Jun-Zi汤治疗后48 h或96 h阻塞的救援组(,),(每组)。建立兔模型可控的肠梗阻,我们改变了部分输液器,广泛应用于临床应用到一个在体外拉式锁。麻醉后的输液注射聚氨酯(1克/公斤),进行剖腹手术镇静兔子和均匀可控循环阻塞成立于肠系膜nonavascular区放置夹八厘米的末端回肠。Sham-operated兔子收到模拟操纵肠道没有位置的锁。动物们被允许恢复术后3天删除任何麻醉的影响我们的测试参数。手术后三天,根据颜色标签夹是锁着的,导致肠道阻塞。的梗阻持续了48 h后肠梗阻被切断锁松了一口气。然后,动物是有或没有药物治疗(每天2次,每次5克/公斤)48 h或96 h。在实验的最后,动物牺牲进行进一步分析。

2.3。肠道损伤的量化和决心的上皮内淋巴细胞(IEL)和固有层淋巴细胞(LPL)细胞数量

2厘米或更长时间的肠段回肠(5厘米从回肠末端阻塞)切除,4%多聚甲醛固定,嵌入在石蜡块。Four-micron厚部分沾着他走时,不是使用标准协议(11]。检查使用的部分冠军- 500 w图形报告管理系统。肠道粘膜损伤评估和赵的12组织病理学分数决定。简单,组织损伤评分从0到5根据以下标准:0,年级正常绒毛结构;1级,在绒毛顶端小牙龈的发展空间;二年级,牙龈肿大空间但没有绒毛长度和宽度的变化;三年级,很少短绒毛和细胞腔的存在;4级,大部分的绒毛缩短,与地下室增生和细胞腔扩大;五年级,削弱的绒毛与细长的隐窝和大量的细胞腔。上皮内淋巴细胞的百分比(IELs)和固有层淋巴细胞(lpl)量化肠道的显微照片。IEL细胞的百分比计算使用以下公式:(总IEL数量的细胞在每节20绒毛/总细胞数在25每部分绒毛)×100。LPL细胞的百分比计算使用以下公式:(LPL总细胞的数量在每节/总固有层20绒毛细胞数量的中心轴25绒毛/部分)×100。

2.4。高效液相色谱法(HPLC)分析鸟氨酸脱羧酶活性和瓜氨酸水平

Theornithine脱羧酶(ODC)活性肠组织和血清中瓜氨酸的水平是由高效液相色谱分析所描述的其他地方(13,14]。

2.5。RNA提取和实时PCR

RNA提取从回肠肠段(100毫克)(5厘米从回肠末端阻塞)使用总RNA工具包(试剂盒)按照制造商的指示。合成第一链cDNA从1μ用逆转录酶g mRNA (Fermentas,格伦小溪,MD)和低聚糖(dT)引物。使用的引物序列如下:Claudin 1转发:5′-GTGCCTTGATGGTGATTG-3′,逆转:5′-AAAGTAGCCAGACCTGAAAT-3′。β肌动蛋白转发:5′-TGATGGTGGGCATGGGTC-3′,逆转:5′-CGATGGGGTACTTCAGGGTG-3′。实时PCR进行使用一个应用生物系统公司PRISM7300(应用生物系统公司)和SYBR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司)。试剂浓度2×实时混合10μ0.3 L,正向引物μ0.3 L,反向引物μL, ddH₂O 7.4μL, cDNA模板2μl . PCR循环条件95°C 30秒之后40 95°C的周期为30秒5秒和50°C。信使rna表达是归一化的表达β肌动蛋白看家基因。

2.6。流式细胞术分析淋巴集结(PP)淋巴细胞

人民党淋巴细胞分离(如前所述15]。短暂,切除PP淋巴细胞是在无菌条件下孵化RPMI中包含1毫米德勤(5分钟,37°C)。此后,人民党淋巴细胞与RPMI清洗介质,通过钢网。由此产生的细胞悬液洗,resuspended RPMI中含10%的边后卫。人民党与FITC-anti-rabbit CD4淋巴细胞被染色,PE-anti-rabbit CD8, Percp-Cy5.5-anti-rabbit CD3。消极的控制沾isotype-matched马伯,在4°C细胞被染色了30分钟。细胞被清洗和resuspended在PBS进行流式细胞仪分析。数据是使用FACSCalibur (BD生物科学)流式细胞分析仪使用CellQuest软件和分析。

2.7。ELISA

新的8厘米的肠段回肠(5厘米从回肠末端阻塞)获得,肠道坚实的内容被删除,和套管黏液收集通过冲洗3毫升无菌PBS。获得提取离心,收集上清液。s-IgA的水平测量使用酶联免疫试剂盒根据制造商的指示。D-lactate的血清水平是衡量酶联免疫试剂盒(ADL有限公司),根据制造商的指示。

2.8。统计分析

结果用平均数±标准差表示。使用双尾学生的数据进行了分析以及(GraphPad棱镜5)和一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。Si-Jun-Zi汤减少肠粘膜损伤

肠道粘膜屏障的第一行是肠道病原体、宿主防御和肠梗阻引起切断肠道粘膜损伤16]。肠道粘膜损伤也是一种常见的临床并发症,可能会导致肠道屏障功能障碍。这里,通过使用一个修改和可控兔肠阻塞模型,我们评估的能力Si-Jun-Zi汤减少obstruction-induced肠道粘膜损伤后缓解肠梗阻。如数据所示1(一)和1 (b),肠梗阻引起严重的肠道粘膜损伤,包括绒毛削弱和上皮脱落。整个组织病理学损伤分数肠子的骗局组在统计学上不同。解除梗阻后,损伤肠粘膜逐渐修复,而Si-Jun-Zi汤治疗组表现出显著增加水平的修复治疗组相比没有Si-Jun-Zi汤治疗。的整体组织病理学损伤评分与组织和与组在统计学上不同(),这表明Si-Jun-Zi汤治疗有着深远的保护作用对肠道粘膜损伤。证实了这种保护提供的Si-Jun-Zi汤血D-lactate水平的变化,这是一个衡量肠粘膜通透性(17),和肠道黏蛋白肠道粘膜屏障的关键组件(18]。数据显示D-lactate水平Si-Jun-Zi汤治疗后显著下降(与和与)(图1 (c)),而肠道黏蛋白水平显著增加相对于对照组(与和与)(图1 (d))。这些结果表明,Si-Jun-Zi汤能减少肠道黏膜的渗透性,提高肠道黏蛋白的分泌。综上所述,我们的研究结果表明,Si-Jun-Zi汤有利于减少肠粘膜损伤后缓解肠梗阻。

3.2。Si-Jun-Zi汤促进小肠的复苏

我们下一个评估Si-Jun-Zi汤的影响小肠的功能和完整性。我们第一次检查的变化鸟氨酸脱羧酶(ODC)的水平,这表明肠上皮细胞增殖(19]。我们之前的研究表明,ODC的水平增加阻塞后,12岁到达顶峰h阻塞后,然后迅速下降。这个观察表明,在阻塞的早期阶段,肠道上皮细胞更新快,促进肠道上皮细胞的复苏,损失和恢复平衡。然而,在后期,这种平衡被打乱由于肠道上皮损伤的严重程度。如图2(一个)ODC的水平组等于虚假的对照组,并逐渐提高阻塞后松了一口气。ODC的水平显著升高后48 h (Si-Jun-Zi汤相比组。在96 h解除梗阻后,ODC水平恢复正常,从而维持肠道内稳态。这个结果表明Si-Jun-Zi汤可以促进肠道上皮细胞的恢复。我们下量化血瓜氨酸的水平,这是小肠的吸收功能的指标(20.]。我们的数据表明,血清中瓜氨酸的水平或组显著高于或组(图2 (b)),这表明Si-Jun-Zi汤治疗促进小肠的吸收功能的恢复。因为肠道粘膜的完整性,这是由紧密连接蛋白(TJPs)和adherens结蛋白,对肠道屏障的功能[至关重要21),我们检查Claudin 1基因表达的实时PCR分析。Claudin 1是紧密连接的功能组件(TJPs)跨膜蛋白在肠道上皮细胞(22]。我们发现几乎检测不到Claudin 1基因表达水平在梗阻后48 h,表明肠上皮的完整性在后期阻塞完全失去了(图2 (c))。一旦障碍物移除,Claudin 1基因表达增加(组)。在动物的Si-Jun-Zi汤治疗48 h, Claudin 1基因的表达显著增加相比集团,增强更为明显集团与组。这个结果表明Si-Jun-Zi汤能促进小肠的完整性的恢复。综上所述,我们的研究结果表明,Si-Jun-Zi汤可以促进小肠的复苏后缓解肠梗阻。

3.3。Si-Jun-Zi汤调节肠道免疫系统

肠上皮细胞是众所周知的角色之间的边界的外部环境和肠道。除了作为一个物理屏障,肠道上皮细胞发挥关键作用,调节免疫反应以维持肠道内稳态(23]。然而,一旦发生肠上皮细胞损伤,肠道上皮细胞屏障之间的平衡和肠道免疫系统无法维持。我们之前的研究发现,肠梗阻引起肠道免疫系统功能障碍,因此我们研究是否Si-Jun-Zi汤能调节肠道免疫系统在肠梗阻松了一口气。我们第一次评估上皮内淋巴细胞的数量(IELs)和固有层淋巴细胞(lpl)和肠上皮细胞(IEC)使用PAS染色组织部分。数据显示数量的显著差异IELs Si-Jun-Zi汤治疗后(数据未显示)没有发现,而lpl减少Si-Jun-Zi汤治疗(与,)(图3(一个))。此外,我们分析了肠道流明的s-IgA水平在不同的时期,有或没有药物治疗,缓解阻塞。我们发现s-IgA水平没有明显改变,这表明Si-Jun-Zi汤不影响小肠的先天免疫。我们下一个检查改变T细胞通过流式细胞术在PP淋巴细胞亚型的百分比。如数据所示3 (c)- - - - - -3 (f)Si-Jun-Zi汤治疗可以减少CD3的百分比⁺T细胞48 h后缓解肠梗阻而无治疗组(图3 (c))。Si-Jun-Zi汤治疗可能增加CD4的百分比⁺T细胞,减少CD8的百分比⁺T细胞在不同时间有或没有药物治疗后缓解梗阻(数字3 (d)和3 (e))。CD4⁺/ CD8⁺T细胞比例也大幅提升了Si-Jun-Zi汤治疗(图3 (f))。这些数据表明,Si-Jun-Zi汤能调节适应性免疫反应降低CD3的数量⁺T细胞、CD8⁺T细胞而增加CD4的数量⁺T细胞。然而,精确的机制还需要进一步调查。基于上述数据,我们建议Si-Jun-Zi汤可以促进肠道功能的恢复通过调节肠道免疫系统。

4所示。讨论

肠梗阻是一种常见的疾病需要腹部手术与重要的发病率和死亡率1]。主要的发病率与肠梗阻与过度膨胀导致窒息和肠坏死。有效治疗阻塞,直到现在,除了手术切除或减压,是缺乏。然而,即使阻塞手术切除,许多病人继续打扰运动性函数在肠近端切除多年来的网站(24,25]。很少有药物治疗肠道的障碍物。最近Alvimopan,药物的行为作为一个次要地表演μ阿片受体拮抗剂,是FDA批准的用于治疗患者术后肠梗阻(POI)偏大或小肠切除手术后基本吻合(26]。然而,有一些副作用,限制使用这种药物(27,28]。

Si-Jun-Zi汤是一个著名的中药用于补充气和振兴脾脏的功能。使用它当有脾和胃气不足,明显的厌食症和腹泻。现代药理研究表明,这个处方可以改善胃肠道功能(5和增强免疫功能6,7]。因此,我们假设这个处方药可能有利于缓解梗阻后肠功能的恢复。

在目前的研究中,我们使用一个可控的兔子肠梗阻模型来调查的影响Si-Jun-Zi煎煮后恢复肠道功能缓解梗阻。我们发现Si-Jun-Zi汤可以减少肠粘膜损伤。Si-Jun-Zi汤治疗显著减轻肠粘膜损伤,减少肠粘膜通透性,增强肠道黏蛋白的分泌。此外,Si-Jun-Zi汤促进小肠的复苏。Si-Jun-Zi汤治疗可以促进肠上皮和复苏小肠的吸收功能通过增加ODC和瓜氨酸水平。此外,Si-Jun-Zi汤促进小肠完整性的恢复通过上调Claudin 1基因表达。最后,我们发现Si-Jun-Zi汤调节肠道免疫系统。虽然Si-Jun-Zi汤不影响小肠的先天免疫,它可能通过减少CD3调节适应性免疫反应⁺T细胞、CD8⁺T细胞数量而增加CD4的数量⁺在PP淋巴细胞T细胞。

虽然我们发现,中国著名的草药配方Si-Jun-Zi汤能够促进肠道功能的恢复通过调节肠道内稳态,确切的机制还有待阐明。Si-Jun-Zi汤作为一个潜在的治疗药物治疗肠梗阻需要未来的研究。

5。结论

目前的研究清楚地表明,Si-Jun-Zi汤促进肠道功能的恢复阻塞后通过调节肠道内稳态。我们的研究结果表明,Si-Jun-Zi煎肠阻塞可能是一种潜在的治疗药物。还需要进一步的研究来评估这种药物的副作用和限制治疗肠梗阻。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

向阳Yu和崔中国贡献了同样的工作。

确认

这项工作得到了国家重点基础研究项目(批准号2009 cb522703)。