文摘

一个活跃的多糖的粉末白术macrocephalaKoidz (PAM)被改进和调整肠道菌群失调。高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)及气相色谱分析-质谱法(gc - ms)是用来确认组件PAM为鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖比例为0.03:0.25:0.15:0.41:0.15。PAM在胃肠道代谢孵化与人工胃和肠道果汁。厌氧孵化PAM的肠道菌群证实,PAM促进肠道细菌消化还原糖的能力。基于香农指数和相似系数指数enterobacterial重复基因间consensus-PCR (ERIC-PCR)指纹总肠道细菌的DNA,我们得出的结论是,PAM能显著改善肠道菌群失调,可以用作口腔辅助调节肠道菌群。

1。介绍

最近的研究报告说,肠道疾病发病率的上升是由于肠道微生物(1,2]。这些微生物也与许多慢性疾病如糖尿病流行[3),炎症性肠病(4),和肥胖5]。肠道微生物会受到许多因素的影响(6- - - - - -9)包括饮食、身体状态和环境,其中饮食是最主要的因素。目前,尚不清楚肠道细菌如何应对从饮食或功能性食品活性成分。肠道菌群之间的关系和活性成分的研究是必要的。

报告表明,多糖可以影响结肠微生物群(10- - - - - -12),但其机械与肠道菌群的互动仍然是未知的。进一步的研究在这样的相互作用将是有用的了解多糖的生理效益和提供适当的治疗使用说明。

多糖是重要组成部分的许多著名的功能性草药也在中国传统医学(中医)[13),如白术(14- - - - - -16),人参(17),而茯苓(18]。目前,粉末白术macrocephalaKoidz,最常见的功能性食品,调节肠道微生物,广泛用于治疗慢性肠道疾病(15]。

在这项研究中,一种新型多糖(PAM)被孤立的粉末答:macrocephala改善代谢影响肠道微生物区系与稳定人工胃肠液。利用厌氧孵化和ERIC-PCR指纹识别方法,PAM在肠道细菌的作用在体外和在活的有机体内被评估。这项研究提供了新颖的理解肠道菌群多糖的生理和疗效。

2。实验部分

2.1。材料、试剂和CAE的准备

干粉末的白术macrocephalaKoidz(批号HX20081102)的叶形线桂皮angustifoliaVahl(批号HX20081103)买了从上海华誉制药有限公司有限公司(上海,中国)。他们的植物起源被相应的作者,和凭证标本存放学院制药、上海交通大学。DEAE-52收购从绘画纸(梅德斯通,英国)和Sephacryl s - 100凝胶是由Amersham(乌普萨拉,瑞典)。Monosaccharaides买来σ(圣路易斯,美国)。引物(ERIC 1 r (5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′)和埃里克•2 r (5′-AAGTAA GTGACTGGGGTGAGCG-3′)是获得Sangon生物技术有限公司(上海,中国)。所有试剂均为分析纯。

干粉的叶形线c . angustifolia(塞纳)提取(CAE)三次与沸水(1:10)120分钟(每次40分钟)。三个滤液合并,由旋转蒸发蒸发真空60°C。最后,提取物的浓度被设定为1.0 g / mL。

2.2。动物

雄性SD大鼠(190 - 200 g和5周大)是购自上海松弛实验动物有限公司有限公司(上海,中国)。与动物及其保健相关的所有程序符合国际公认原则的指导方针中保持中国政府发行的实验动物。

2.3。多糖的提取、分离和纯化

干粉末的粉末答:macrocephala(200克)和2000毫升沸水提取三次3 h (1 h每次)。过滤水提取,结合,用旋转蒸发器浓缩到200毫升。沉淀的粗多糖,三倍体积的纯乙醇添加到提取一夜之间在4°C。由此产生的沉淀被离心收集,反复用纯乙醇(400毫升)洗净,和干下氮。20克干燥得到沉淀,在1000毫升纯水重组,脱去蛋白质的使用三倍体积的Sevag试剂( 丁醇/氯仿,v / v = 1: 4)。最后,900毫升上层清液收集,集中100毫升,冻干13.8 g粗多糖。

净化分离多糖,1 g粗多糖溶解,过滤0.45μm过滤器,应用于DEAE-52纤维素色谱柱(26毫米×60厘米)。粗多糖的分离和筛选了1000毫升蒸馏水1毫升/分钟的流量。水获得的分数据的总碳水化合物含量测定phenol-sulfuric酸方法使用葡萄糖作为标准。水洗提多糖结合,集中到100毫升,分为十10毫升整除。每个整除分馏通过凝胶排阻层析法Sephacryl s - 100凝胶色谱柱(24毫米×45厘米)筛选了400毫升纯水在0.5毫升/分钟的流量。phenol-sulfuric酸方法也在这一过程中使用。水洗脱馏分收集和集中50毫升和冻干0.05 g白色纯化多糖(PAM)。

2.4。PAM的结构分析

PAM的分子量是由高性能凝胶渗透色谱法(HPGPC) [19]。用气相色谱-质谱(PAM决心的单糖组成20.]。PAM的红外光谱确定了使用傅里叶变换红外光谱仪(IR)(美国的那些时光仪器有限公司nexus - 870, Nicolet) (21]。微观结构是由原子力显微镜(22]。

2.5。PAM的稳定性在人工胃肠液

人工胃和肠道果汁准备引用的中国药典23]。短暂,40毫升人工胃肠液或添加到40毫升PAM解决方案在纯水(1毫克/毫升)和孵化在水浴37°C。混合解决方案是在孵化期间,0.8毫升0,1,2,3,4,5,6,12日和24小时。0.4毫升溶液中多糖的浓度决定使用phenol-sulfuric酸方法(24),而还原糖的浓度进行了测试在0.4毫升溶液使用DNS方法(25]。PAM的代谢率是由下列公式计算: 在哪里 代谢率; 初始浓度的多糖; 总多糖的浓度; 是还原糖的浓度。

2.6。PAM对人类的影响/大鼠肠道细菌在体外

人类肠道细菌汁制备如前所报道(26]。简言之,PAM与人类/大鼠肠道菌群混合液体在厌氧孵化,孵化37°C。孵化期间,4毫升混合物孵化是在0、2、4、6、8、10、12和24小时。还原糖的消化是使用DNS方法决定的。还原糖消化率的计算公式给出了如下: 在哪里 是还原糖消化率; 是还原糖的起始水平; 剩余的还原糖。

2.7。PAM在肠道菌群的影响在活的有机体内

经过一个星期的适应环境,老鼠被随机分成4组(每组8大鼠),即控制(健康),模型(治疗),高(0.105 g / kg)和低剂量(0.035 g / kg) PAM处理组。模型和高和低剂量的老鼠PAM组intragastrically给定CAE 10克/公斤(每1公斤10 g原油草药鼠体重)一天两次的前10 d诱导肠道菌群的无序模型。从第十一天,高和低剂量的帕姆集团与PAM溶液治疗剂量的0.105克/公斤和0.035克/公斤每天一次10 d,分别。对照组和模型组intragastrically同样体积的蒸馏水。

三个或四个的粪球(约1.0克)/鼠直接从肛门进入无菌塑胶管和收集储存在−20°C。手术后被重复8 h。收集粪球在1日10日和17天的动物实验。

该协议从粪便中提取总DNA肠道细菌和方法执行ERIC-PCR是前面描述的27]。统计分析是利用香农多样性指数和相似性系数(相似度的两个分类单位)。香农多样性指数的值来描述社区肠道菌群的多样性,它是计算如下: 在哪里 代表的比例相对于phylotypes的总和phylotype肠道菌群。相似系数计算 ,“ ”是总数量的乐队在ERIC-PCR模式为一个示例中,“ “其他的数量, ”是共同乐队的数量的样品(27]。

3所示。结果与讨论

3.1。PAM的结构特征分析

PAM在HPGPC显示为一个单一的和对称的峰(图1)。从色谱,PAM是一个齐次多糖。PAM(图的傅立叶变换红外光谱2)显示一个主要广泛延伸峰值为3289.74厘米−1对于典型的羟基和疲软的乐队在2929.69厘米−1碳氢键的伸缩振动(21]。1651.98厘米的吸光度−1表明羰基的存在。切断拉伸的主要吸收1121.51厘米−1建议是吡喃糖糖结构配置的特点。乐队在874.45厘米−1表示在PAM甘露糖的存在。乐队在897.46厘米−1的特征峰 在PAM配置。PAM图像从原子力显微镜图所示3和PAM的模式分子链绕组线圈和球形分布和多个结节性多糖分子间相互作用相互结合。分子的直径大小为42.2 nm的放大下图像显示。PAM的分子量是28773 Da计算绘制标准曲线(图4)。单糖组成(图5)PAM的鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖,和摩尔比为0.03:0.25:0.15:0.41:0.15。单糖组成的结果表明,PAM木糖的比例非常高。以前的研究报道,人类的肠道双歧杆菌属可以激活和扩散木糖(28对人类健康和增强的好处。食用木糖能提高人体的微生物环境。因此,它提供了以下研究PAM的基础功能。


图1
高效凝胶渗透色谱法PAM。

图2
PAM的红外光谱。

图3
PAM的原子力显微镜图像。

图4
PAM分子量的标准曲线。

图5
PAM衍生气相色谱。1:鼠李糖;2:木糖;3:肌醇;4:葡萄糖;5:甘露糖;6:半乳糖。
3.2。PAM的稳定性在人工胃肠液

图6显示了PAM新陈代谢的变化在人工胃肠液/ 12小时的时间窗口。还原糖的浓度产生显著增加的1 h,紧随其后的是一个缓慢的增加,直到平衡。在12 h,还原糖的浓度在人工胃液和肠液是24.3%和18.1%,分别。结果表明,PAM在胃肠道代谢。此外,大多数PAM在肠液消化的一部分。


图6
PAM在人工肠液代谢/胃液。
3.3。的在体外PAM对肠道菌群的活动

当PAM添加和厌氧孵化与人类/大鼠肠道细菌从粪便混合物,发现还原糖的消耗速率增加。图7显示出还原糖的含量改变了人类,老鼠,和控制。PAM含量的变化可以分为三个主要时期:缓慢降低(0 ~ 2 h)急剧下降(2 ~ 6 h),和减少平滑(6 ~ 24 h)。从2到6 h,消费还原糖的比例显著下降,几乎线性(-0.3 1.2 -0.2 g和1.2 g在人类和老鼠,职责)。一般来说,人类的肠道菌群是类似于老鼠的消耗率还原糖孵化与PAM 77.9%和76.9%,分别。因此,PAM可能激活并加速肠道菌群的生长,这对PAM的进一步研究提供了线索在活的有机体内。


图7
PAM对人类的影响/大鼠肠道菌群消化还原糖。
3.4。的在活的有机体内PAM对肠道菌群的代谢活动

动物的肠道菌群失调模型建立了CAE的口服27]。水样便的症状特点显然是模型中观察到的老鼠,和其他症状也观察到在这项研究中,如驼背的,狭窄的眼睛,精神萎靡,食欲不振,体重减轻。当被PAM intragastrically,水样便的特征症状明显改善。活力增加,体重明显恢复组接收高、低剂量的帕姆(图8)。治疗组相比,所有治疗组的症状更有效地降低,但组间没有明显差异。


图8
老鼠的重量在建模和治疗的时期(前:管理;b:在管理;c:治疗后)。

ERIC-PCR概要肠道菌群粪便的DNA进行鼠(图329)。在健康状况(对照组)、香农多样性指数 32个老鼠的 ,而模型组(治疗)降至 ( )下降20%。结果表明:在大鼠肠道菌群的生态平衡被破坏和植物物种被拒绝了。当模型大鼠与PAM,管理 被增加到 ( ,高剂量组与模型组相比)。然而,香农多样性指数的低剂量的PAM组维持在一个恒定的水平,并与模型组相比无显著差异。PAM的某些内容可能是非常重要的增加模型组的多样性指数。

(一)
(一)
(b)
(b)
图9
香农多样性指数的ERIC-PCR指纹的肠道菌群失调模型大鼠治疗前后。(一)香农多样性指数的对照组和模型组。(b)香农多样性指数的高剂量和低剂量的PAM组。(P ☆< 0.05,P ☆☆< 0.01,相比之下,前番泻叶管理。)

如图10,索伦森指数(C年代)是用来比较ERIC-PCR指纹不同条件下大鼠的肠道菌群。之前和之后通过CAE接受治疗,C年代模型(组:模型、大剂量PAM和低剂量的PAM)从38%到45%不等。与对照组(58%)相比,C年代模型组明显下降( )。高和低剂量的PAM组,在每个治疗组肠道菌群提出了一定程度的复苏,特别是大剂量组(54%, 与模型组相比)。高和低剂量的帕姆可以改善ERIC-PCR指纹的相似性系数,表明PAM可以显著改善肠道菌群的结构。此外,据报道,PAM的消费显示改善肠道功能(29日]。研究肠道菌群结构的变化通过PAM治疗可以提供参考了解多糖对肠道菌群的潜在机制。


图10
相似系数指数( %)的ERIC-PCR指纹PAM治疗前后大鼠肠道菌群。控制:组1,接受了蒸馏水的诱因和治疗阶段。模型:组2,治疗期间收到塞纳政府但蒸馏水;PAM高剂量和低剂量帕姆:4组3组,获得了高和低剂量的帕姆安排治疗期间。(P ☆< 0.05,而控制;P ※< 0.05相比,该模型)。

4所示。结论

在本文中,一个活跃的PAM的多糖是孤立的粉末答:macrocephala,也确认了其结构。ERIC-PCR概要分析成功地用来研究PAM在肠道菌群的影响。我们的研究结果表明,PAM能改善和调整肠道菌群失调,这表明PAM可能有潜力作为口服肠道菌群失调的佐剂。这项研究还提供了一个新颖的概念,依据未来调查的代谢多糖对肠道菌群的影响及其治疗效果。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(30973962和30973962号)。作者感谢SJTULAB集团的研究支持。