文摘

小檗碱、异喹啉生物碱原本孤立的中国草药黄连(黄连),已被证明显示广泛的药理活性。本研究旨在探讨小檗碱对心肌缺血的影响产生了由异丙肾上腺素在大鼠。50岁男性同样Sprague-Dawley老鼠被随机分成5组:对照组,一个未经处理的模型组,小檗碱(30、60毫克/公斤)治疗,或心得安(30毫克/公斤)。老鼠为12天,然后给定的异丙肾上腺素治疗,连续2天85毫克/公斤皮下注射。去年政府的st段抬高后测量。血清肌酸激酶同工酶(水平)、乳酸脱氢酶(LDH)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)和白细胞介素- 6 (il - 6)是测量老鼠牺牲后。心被切除确定心脏重量指数、显微镜检查,高机动组框1 (HMGB1), toll样受体(TLR4) prodeath蛋白质(伯灵顿),antideath蛋白质(bcl - 2)和肿瘤坏死因子(TNF -α蛋白质免疫印迹测定。小檗碱圣海拔引起的急性心肌缺血,降低和减少血清水平的水平,LDH, TNF -α,il - 6。小檗碱增加总超氧化物歧化酶(T-SOD)活动和心肌组织丙二醛(MDA)含量降低。小檗碱能够调节HMGB1-TLR4轴保护心肌缺血。

1。介绍

缺血性心脏病(IHD)发病率和死亡率的主要原因在西方世界;根据世界卫生组织,它将在世界死亡的主要原因(1,2]。尽管在基础研究和临床改善进展,药物治疗没有根本性的突破。

异丙肾上腺素,αβ肾上腺素能受体激动剂,产生心肌缺血由于自氧化自由基的生产(3]。Isoproterenol-induced心肌缺血导致心肌酶和氧化应激增加,异常心电图仪,和心脏功能(4]。

高机动组框1 (HMGB1) 30 kDa核蛋白质参与脱氧核糖核酸(DNA)的结构组织,作为中介后炎症坏死细胞或细胞激活后发布的各种病理条件包括各种心血管疾病和心肌缺血再灌注(I / R)损伤(5- - - - - -8]。同时,toll样receptor-4 (TLR4), HMGB1的重要受体,还参与炎症反应的诱导的炎症中断,可以减弱ligands-TLR4轴通过多种方法(9,10]。

小檗碱、异喹啉生物碱原本孤立的中国草药黄连(黄连),已经被证明可以显示一个广泛的药理作用,包括抗菌、antidiarrhoeal,治疗糖尿病药,antihyperlipidaemic、抗炎和抗增殖效果11]。此外,动物和临床研究表明,小檗碱是有益的在防治心血管疾病12]。本研究旨在评估小檗碱预处理的效果在isoproterenol-induced心肌损伤大鼠模型。

2。材料和方法

2.1。材料

本研究的实验动物中心批准中国药科大学的学院。50岁男性健康Sprague-Dawley老鼠体重从200年到220 g是购自吉林大学的动物实验动物中心。动物实验是按照吉林大学动物实验指南。动物被保持在一个温度控制在20.1 - -23.1°C和湿度40 - 50%,12 h光/暗周期,和免费的水。小檗碱的纯度超过98%是购自国家食品和药物控制机构(中国,北京)。异丙肾上腺素是购自上海Hefeng制药有限公司(上海,中国)。戊巴比妥钠从默克公司(德国)购买。普萘洛尔在西安购买的李俊制药有限公司有限公司(西安,中国)。MDA水平,LDH, T-SOD, TNF -α和il - 6测试套件都是购自南京剑程生物工程研究所(南京,中国):anti-HMGB1抗体(细胞信号技术,# 3935),anti-TLR4抗体(细胞信号技术,# 2246),anti-TNF -α抗体(细胞信号技术,# 6945),anti-Bax抗体(细胞信号技术,# 2272),anti-Bcl-2抗体(细胞信号技术,# 2876),和anti-GAPDH抗体(细胞信号技术,# 5174)。

2.2。试验协议

老鼠被随机分配到五组,每组10大鼠:(1)控制;(2)异丙肾上腺素;(3)异丙肾上腺素+心得安(30毫克/公斤,口头);(4)异丙肾上腺素+小檗碱(30毫克/公斤,口头);(5)异丙肾上腺素+小檗碱(60毫克/公斤,口头)。老鼠进行了14天,然后陶醉与异丙肾上腺素(异丙肾上腺素,85毫克/公斤对照组除外)在连续两天皮下注射。血液(3毫升)收集腹主动脉的血清酶化验。治疗后,心被切除,在冰冷的等渗盐水清洗,涂抹滤纸,均质在0.05 M冰冷的磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)生化分析。

2.3。测定的st段抬高和心率

心电图(ECG)记录的st段抬高和心率在20分钟后的最后注射异丙肾上腺素或其他药物。ecg记录在戊巴比妥钠麻醉(22.5毫克/公斤)使用电极针和bl - 420生物功能实验系统从成都Thaimeng科技有限公司购买,(中国成都)。

2.4。测定心脏重量指数

老鼠牺牲之后,心脏组织切除(不包括大血管和结缔组织)和称重后用滤纸吸去。心脏重量指数(注热水)被计算为注热水=心脏重量(HW) /体重(BW)。

2.5。水平的确定、LDH、TNF -α和血清中il - 6

水平和LDH水平是衡量一个率试验使用rt - 9600半自动生化分析仪(ShenZhenLeiDu生命科学,LLC)。肿瘤坏死因子-α和il - 6水平测定,酶联免疫吸附测定(武汉Boshide生物科技公司,武汉,中国)。所有测量都是按照设备制造商的指令执行。

2.6。组织学检查心肌

老鼠的牺牲之后,心中立即被移除,福尔马林溶液固定在10%。处理心脏组织的标准组织学切片和染色的方法。部分(5毫米,徕卡RM 2125,德国)左心室的苏木精和伊红染色())和检查光学显微镜(尼康、东京、日本)在200 x放大。

2.7。西方墨点法

心脏组织均质,用PBS和孵化裂解缓冲除了蛋白酶抑制剂鸡尾酒(σ,圣路易斯,密苏里州)获得提取肺的蛋白质。样本加载到10% sds - page凝胶和electrotransferred硝基。这些墨迹是孵化与适当的特定抗体的浓度。洗后,这些墨迹被孵化与辣根peroxidase-conjugated第二抗体。被膜和reblotted反β肌动蛋白抗体(σ)来验证等于加载每个车道的蛋白质。量化蛋白质表达的规范化β肌动蛋白使用密度计(成像系统)。

2.8。统计分析

所有的值被表示为均值±s.d和分析单向方差分析(方差分析)其次是邓肯的多个范围测试使用SPSS 13.0版软件;一个 值小于0.05被认为是显著的 被认为是统计上非常重要。

3所示。结果

3.1。小檗碱对st段抬高的影响

五分钟后异丙肾上腺素,st段是未经处理的模型组升高,但不与小檗碱治疗组。这些结果代表心肌缺血损伤模型已经建立。十分钟后,异丙肾上腺素管理、st段抬高仍在治疗组。st段抬高了小檗碱组大鼠与未经处理的模型。心率趋于稳定和近似率观察普萘洛尔治疗组(图1)。


图1
小檗碱对st段抬高的影响。C(控制);米(模型);P(普萘洛尔(30毫克/公斤);D(小檗碱(30毫克/公斤);E(小檗碱(60毫克/公斤)。值表示为±SDs。与控制相比,# ,# # ;与模型相比,∗ ,∗∗ 。
3.2。小檗碱对水平的影响,LDH, TNF -α,血清il - 6水平

显著提高心肌损伤标记酶水平,LDH治疗模型中观察到的老鼠相比,控制老鼠。预处理与小檗碱降低水平和LDH水平相比,在未经处理的模型组大鼠存在剂量依赖的相关性。与对照组相比,血清TNF -α在未经处理的模型组和il - 6水平明显增加。预处理与小檗碱降低血清TNF -α和il - 6水平与未经处理的模型组大鼠相比,在剂量依赖性的方式(图2)。


图2
小檗碱对水平的影响,LDH, TNF -α,血清il - 6水平。C(控制);米(模型);P(普萘洛尔(30毫克/公斤);D(小檗碱(30毫克/公斤);E(小檗碱(60毫克/公斤)。值表示为±SDs。与控制相比,# ,# # ;与模型相比,∗ ,∗∗ 。
3.3。小檗碱对心脏的影响体重指数

注热水在未经处理的更大的老鼠比对照组大鼠模型。与小檗碱预处理降低了注热水而未经处理的模型组大鼠(图3)。随着剂量的增加,减少注热水变得更大。


图3
小檗碱对心脏的影响体重指数。C(控制);米(模型);P(普萘洛尔(30毫克/公斤);D(小檗碱(30毫克/公斤);E(小檗碱(60毫克/公斤)。值表示为±SDs。与控制相比,# ,# # ;与模型相比,∗ ,∗∗ 。
3.4。小檗碱对心肌组织学的影响

光学显微镜控制鼠心肌组织部分显示正常肌纤维结构光条纹,扩展外观,与相邻的肌原纤维和连续性。组织从未经处理的模型大鼠给予异丙肾上腺素显示明显的心肌细胞肿胀、变性,失去横向条纹,和大量的炎性细胞浸润。老鼠用小檗碱预处理的组织显示正常,保存完好的心肌细胞组织学。组织部分从普萘洛尔组大鼠显示大约有正常肌纤维结构清晰的横条纹和一些炎性细胞(图的存在4)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
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(e)
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图4
小檗碱对心肌组织学的影响(×200)。C(控制);米(模型);P(普萘洛尔(30毫克/公斤);D(小檗碱(30毫克/公斤);E(小檗碱(60毫克/公斤)。
3.5。小檗碱对HMGB1-TLR4轴的影响

HMGB1的蛋白质的表达,TLR4、伯灵顿,bcl - 2,和TNF -α被异丙肾上腺素改变的心。如图5与对照组相比,HMGB1的蛋白质含量,TLR4、伯灵顿,TNF -α在模型组显著增加。小檗碱,HMGB1的蛋白质含量,TLR4、伯灵顿,TNF -α降低剂量依赖性的方式与模型组相比,分别;与对照组相比,模型组的bcl - 2蛋白水平的降低。小檗碱,bcl - 2蛋白水平显著增加剂量依赖性的方式与模型组相比,分别。


图5
小檗碱对HMGB1-TLR4轴信号C(控制);米(模型);P(普萘洛尔(30毫克/公斤);D(小檗碱(30毫克/公斤);E(小檗碱(60毫克/公斤)。值表示为±SDs。与控制相比,# ,# # ;与模型相比,∗ ,∗∗ 。

4所示。讨论

在这项研究中,减少了小檗碱的st段抬高急性心肌缺血引起的;减轻心肌缺血性损伤;减少注热水。也与小檗碱预处理水平下降,LDH, TNF -α和il - 6水平。小檗碱预处理增加心肌SOD活性,减少MDA水平。这些结果表明,在本研究中使用的剂量小檗碱在心肌缺血心血管效应,可以归因于他们的抗氧化和抗炎作用。

证实了异丙肾上腺素所致急性心肌缺血的心肌细胞膜的完整性损失在组织学检查,st段抬高,血清水平的高度和LDH酶。小檗碱减轻心肌组织学损伤,降低心率和st段抬高,减少水平和LDH酶剂量依赖性的方式。

异丙肾上腺素是一种合成β肾上腺素能受体激动剂,可引起严重的压力在心肌及心肌细胞坏死。然而有大量文献[1,13证明雌激素可以保护心脏免受缺血性损伤和抑制动脉硬化和心肌肥大;这意味着雌激素会影响实验结果,如果我们使用雌性老鼠。所以在当前的研究中,我们仅仅使用雄性老鼠构建异丙肾上腺素所致急性心肌缺血控制研究。证实了异丙肾上腺素所致急性心肌缺血的心肌细胞膜的完整性损失在组织学检查,st段抬高,快速心率、海拔和血清水平和LDH酶;小檗碱减轻心肌组织学损伤,降低心率和st段抬高,减少水平和LDH酶剂量依赖性的方式。

作为一个先前的研究(14染色),他是一个重要的方法来评估心肌损伤。组织病理学检查显示更高程度的心肌细胞肿胀、变性,横条纹,大量炎性细胞浸润isoproterenol-induced老鼠。在当前的研究中,用小檗碱治疗恢复的组织病理学改变。

炎症被认为是一个主要驱动力在缺血过程中,越来越多的证据表明,提高水平的炎症标记物与缺血(15,16]。促炎细胞因子如TNF -α和il - 6小分泌蛋白质调节和调节炎症。异丙肾上腺素诱导的炎症压力反映了TNF -α和il - 6高度渗透的心肌嗜中性粒细胞。小檗碱降低TNF -α和血清il - 6水平,这表明他们的心血管效应也与抗炎作用有关。

SOD和MDA的水平活动的主要病理生理参数评估自由基代谢。SOD活性反映了细胞的清除能力/猝灭自由基[17]。在这项研究中,SOD活性显著降低异丙肾上腺素治疗大鼠的心脏组织与控制。预处理与Rg1增加SOD活性和降低心肌MDA水平,这表明他们的心血管效应相关的抗氧化特性。

高机动组框1蛋白质(HMGB1),一个高度保守的核内蛋白能调节基因的转录和维护核小体结构,可能是被动释放坏死细胞或细胞凋亡或由先天免疫细胞主动分泌(如巨噬细胞和单核细胞)18]。本研究表明,HMGB1作为小说促炎细胞因子和导致心肌I / R损伤的病理生理过程(19]。HMGB1可能促进肿瘤坏死因子的释放α可以抑制il - 6, HMGB1一盒肽(一个特定HMGB1拮抗剂)和减弱心肌I / R损伤,证明抑制HMGB1表达可以抑制当地在心肌I / R损伤心肌炎症。因此,在当前的研究中,异丙肾上腺素可以激活HMGB1,小檗碱显著降低isoproterenol-induced老鼠HMGB1水平。

通常几的toll样受体)、TLR4介导心肌炎症中扮演很重要的角色和有害反应I / R (20.,21]。几项研究已经确定了高机动组框1 (HMGB1)和大热休克蛋白(HSP)作为内生TLR4活化剂在动物模型心肌I / R (22,23]。正如所料,在这项研究中,小檗碱显著降低isoproterenol-induced老鼠TLR - 4水平。

炎症参与许多心血管疾病,如心肌梗塞,动脉粥样硬化,心肌病(24- - - - - -26]。在炎症过程中,肿瘤坏死因子-α具有十分重要的意义。肿瘤坏死因子-α主要由巨噬细胞分泌,这可能会促进炎症级联通过增加其他促炎细胞因子的释放和影响中性粒细胞招募(27]。肿瘤坏死因子-α一个诱发其他炎症介质的释放,增加细胞粘附因子的表达,促进中性粒细胞粘附内皮细胞。肿瘤坏死因子-α也能导致心肌细胞凋亡,参与心室重构(28]。在目前的研究中,异丙肾上腺素能增加肿瘤坏死因子-α;小檗碱显著降低TNF -α在isoproterenol-induced老鼠。

心肌细胞凋亡参与各种心脏疾病,如心肌肥厚、心力衰竭和心肌缺血29日]。细胞凋亡是积极的和消极的监管bcl - 2蛋白家族。Bcl-XS Proapoptotic蛋白质包括伯灵顿,贝克,坏的,报价,Bik,荡妇,Hrk,博克,而凋亡蛋白bcl - 2包括(Bcl-XL Bcl-w, mcl1和A1 / Bfl-1。在最近的研究中,异丙肾上腺素减少bcl - 2和伯灵顿,虽然恢复了小檗碱伯灵顿/ bcl - 2平衡isoproterenol-induced老鼠。

总之,本研究表明,小檗碱有心血管效应对异丙肾上腺素所致急性缺血性心肌损伤大鼠。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。