文摘

已经证明prokineticin 2 (PK2)及其受体PKR2发挥重要作用在痛觉过敏,温和灸可以减轻内脏过敏在肠易激综合征(IBS)的大鼠模型。本研究的目的是确定温和灸对PK2的表达的影响和PKR2结肠和脊髓在IBS大鼠模型中,由结直肠扩张诱导使用充气气球。温和灸治疗后,腹部撤军反射(心田)分数评估结直肠扩张;蛋白质和mRNA的表达PK2和PKR2鼠结肠和脊髓决心通过免疫组织化学和荧光定量PCR。与正常大鼠相比,心田的老鼠和PK2 / PKR2蛋白质的表达和mrna在结肠癌和脊髓组织模型组显著增加;与模型组相比,老鼠和表达式的心田;分数PK2 / PKR2蛋白质和mrna在结肠癌和脊髓组织温和灸组均明显降低。这些发现表明,温和灸的镇痛效应可能与减少有关的异常增加PK2 / PKR2蛋白的表达和mrna在结肠癌和脊髓。

1。介绍

肠易激综合征(IBS)是一种功能性肠道疾病的特征是腹部疼痛或不适伴随着排便习惯的改变(1- - - - - -3]。肠易激综合症的发病率在中国[5 - 20.72%4,5]。临床症状如腹痛和腹泻严重影响IBS患者的生活质量。研究表明,内脏过敏和肠胃蠕动异常是主要的致病因素导致临床症状如腹痛和腹泻IBS患者(6- - - - - -8]。减少内脏过敏和改善胃肠道流动性是主要的策略来改善IBS患者的生活质量。

Prokineticins (PKs)是新发现的肽家族成员在哺乳动物。PK家族主要包括PK1 PK2。PK1是无毒的人类的相同器官蛋白质命名毒液(VPRA)或曼巴肠毒素1 (MIT1)与黑曼巴毒液。PK2是人类相同器官的蛋白质Bombina使丰富多彩(Bv8)隔绝皮肤分泌物的蟾蜍。通过G protein-coupled受体称为prokineticin受体(pkr),与其在体内参与多种生物过程,包括调节胃肠移动和疼痛信号的传播9- - - - - -14]。与其最初发现肠功能的监管机构和内生监管机构是一种新型的胃肠蠕动,特别是导致胃肠平滑肌收缩,就是明证,他们特别引入回肠纵肌的收缩,基底肌肉,近端结肠在豚鼠15,16]。后续研究表明,与其调节疼痛信号传输和宣传痛觉受器。与其通过脊髓和主要敏感神经元,大力进行宣传外围热痛觉受器,化学和机械刺激和直接参与痛觉阈值变化和疼痛的反应引起的有害刺激,从而调节主和中枢疼痛敏化。因此,抑制或拮抗PKs / pkr可以减轻疼痛17- - - - - -21]。

目前,IBS的发病机制尚未完全清楚。调查PK / PKR表达式和肠易激综合症之间的关系可以进一步阐明肠易激综合症的机制,为IBS的治疗提供新的目标。我们组建立了一个新生大鼠鼠IBS模型基于结直肠扩张刺激充气气球根据Al-Chaer et al。22]。我们先前的研究表明,(1),与正常大鼠相比,痛阈下降和内脏敏感性增加以及PK1 PKR1表达显著增强在结肠癌和脊髓IBS模型大鼠;(2)温和灸是有效治疗肠易激综合症,因为它增加了疼痛阈值,改善内脏过敏,和减少PK1和PKR1表达在IBS模型大鼠结肠和脊髓(23,24]。这些表明,战,pkr与IBS密切相关;PK1 PKR1参与IBS的病理生理学和温和灸镇痛在肠易激综合症。

战,pkr主要包括PK1、PKR1 PK2, PKR2。迄今为止,报告之间的联系PK2 / PKR2和IBS稀缺。基于之前的研究,本研究进一步研究IBS的机理和温和灸治疗IBS的PK2 / PKR2。

2。材料和方法

2.1。实验动物

总共42岁男性新生儿老鼠(5-day-old)实验室动物科学学系提供的上海复旦大学医学院。动物们保持在光照条件下(12 h灯:12 h黑暗)的室温20±2°C 50 - 70%的相对湿度。本研究按照美国国立卫生研究院的执行指导实验室动物保健和使用的。

经过三天的习惯,新生儿老鼠被随机分为3组:正常组,模型组(只建模),温和灸组(建模温和灸紧随其后)。

2.2。IBS模型的建立

慢性内脏过敏鼠模型建立了根据Al-Chaer et al。22]。

一个充气的气球慢慢地插入的深度2厘米通过沿结直肠肛门生理弯曲。空气的气球膨胀与0.2毫升1分钟,然后慢慢泄气和撤回。30分钟后重复相同的刺激过程。气球刺激进行一天两次,14天。

2.3。温和灸治疗

在模型建立之后,温和灸组的老鼠开始接受温和灸治疗7周。院长艾棒的直径(南洋韩艾有限公司有限公司南阳,河南省中国)是0.5厘米。艾棒被点燃时,艾灸2厘米以上执行双边Tianshu点(圣25日5村耻骨联合上方和2村远离中线)同时为10分钟。艾灸是一天一次总共7天。

2.4。腹部撤军反射(心田)得分

根据Al-Chaer等的方法。22],心田得分是在老鼠身上进行的后90分钟内7艾灸治疗。气球慢慢地通过肛门插入降结肠,和四个强度、20、40、60和80毫米汞柱,结直肠扩张(CRD)应用。每个CRD持续了20年代每4分钟,重复5次。心田评分由两位研究者评估。平均每只动物的数据进行分析。

心田的标准评分(22)如下:0,没有CRD的行为反应;1,短暂的头部运动静止在CRD紧随其后;2、温和收缩腹部肌肉,但没有提升;3、强收缩腹部肌肉和提高的腹部没有解除骨盆结构和阴囊;4、身体拱起和盆腔结构的提升和阴囊。

2.5。制备结肠癌和脊髓组织样本

心田得分后,老鼠体重并使用3%戊巴比妥钠麻醉(0.1毫升/ 100克)。每组六个老鼠都牺牲了,他们的结肠(3厘米长,5厘米以上肛门)和脊髓组织立即收集(在腰椎扩大)。样本存储在一个−80°C冰箱后续荧光技术定量PCR (FQ-PCR)检测。剩下的老鼠在每个组快速室和250毫升生理盐水灌注直到肝脏成为白色,紧随其后的是灌注和500毫升4%多聚甲醛固定。灌注后,3厘米的结肠组织位于肛门5厘米以上和腰椎脊髓组织扩张和固定在4%多聚甲醛(不到24小时),随后的免疫组织化学检测。

2.6。免疫组织化学分析PK2和PKR2的表达式

结肠癌和脊髓组织石蜡标本,deparaffinized水。孵化后3%的H2O2在室温20分钟,部分沉浸在0.01 M柠檬酸缓冲(pH值6.0)和加热两次在微波炉用中火加热直到沸腾。然后部分被封锁使用5%牛血清白蛋白(BSA)在室温20分钟,和主要的抗体被添加一滴一滴地(PK2:兔子anti-rat多克隆抗体,1:400年,罗福斯有限公司,利特尔顿美国;PKR2:兔子anti-rat多克隆抗体,1:100年,武汉USCN生活有限公司,武汉,中国)在4°C水分室过夜紧随其后在37°C孵化器孵化2 h。相应的二次抗体(生物素化的山羊anti-rabbit免疫球蛋白g, 1: 100年,武汉博士德生物工程有限公司,有限公司,武汉,中国)然后添加一滴一滴地,在37°C和部分被孵化20分钟。孵化后streptavidin-biotin复杂(南非广播公司)(武汉博士德生物工程有限公司,武汉,中国)在37°C 20分钟,部分是使用3、3′-diaminobenzidine (DAB)(武汉博士德生物工程有限公司,武汉,中国)。与苏木精复染色后1分钟,部分脱水,清理,安装,光学显微镜下观察(BH2、奥林巴斯、东京、日本)。

积极的信号是由褐黄色的颜色表示。图像分析都使用了地中海Motic 6.0数字医学图像分析系统(Motic集团有限公司,厦门,中国)。每个样本是随机挑选的,三个不重叠的字段和数据的积极信号的积分光密度平均每个样本进行分析。在图像分析过程中,光源的强度是相同的所有样品。

2.7。FQ-PCR化验PK2 mRNA的表达和PKR2信使rna

在结肠癌和脊髓组织总RNA提取使用试剂盒和相对地转录成cDNA根据制造商的说明书。反应体系由4μL 5 x逆转录缓冲区,0.5μ0.5 L的低聚糖(dT)μ核苷酸的L, 1μL MMLV逆转录酶,10μL DEPC-treated水,和4μL的RNA模板;总量是20μl .反应条件是37°C 1 h 95°C的后5分钟MMLV逆转录酶灭活。准备的cDNA用于PCR扩增。放大系统由10μL 5 x PCR缓冲,0.5μ上游引物(F), 0.5的Lμ0.5 L的下游引物(R)μ0.5 L的核苷酸μL (TaqMan荧光探针,1μL的Taq, 32μL (ddH2啊,和5μL (cDNA模板;总量是50μl . 50°C的放大过程包括40周期为2分钟,95°C 5分钟,15秒95°C, 60°C 45 s。

探针和引物的合成和纯化Da安生物技术有限公司提供的。有限公司、青岛、中国。GADPH作为内部控制。GADPH探针的序列5′-CATCTGGGCTACACTAGGACCA-3′;的上游引物序列GADPH 5′-GCTGTTGAGTCACAGGAGCAA-3′,和下游引物5′-CCGAGGGCCCACTAAAGG-3′。PK2探针的序列5′-TTGCTGCTACCGCTGCTGCTCACAC-3′;的上游引物序列PK2 5′-CCTCCACACTGAGAGTCCTTG-3′,和下游引物5′-GTGCCCCGCTACTGCTAC-3′。PKR2探针的序列5′-TGTGCCTCCGTCAACTACCTTCGT-3′,上游引物的序列PKR2 5′-GAGGCGGTCTGGTAATTCATCC-3′,和下游引物5′-CTTTCCTGGGAGCATGGTCAC-3′。

目标基因的mRNA表达使用ABI棱镜7300 SDS软件进行了分析。相对目标基因的mRNA表达= ,ΔCT = CT值的目标gene-CT价值内部控制(GADPH)。

2.8。统计分析

使用SPSS18.0软件进行统计分析。提出了统计描述:数据为正态分布均值±SD M, min-max为非正态的分布。统计推断:单向方差分析(ANOVA)如果数据执行遵循正态分布;如果执行的非参数测试数据不服从正态分布。如果方差齐次,群体之间的差异也是比较使用最少的显著差异(LSD)测试;如果方差不均匀,使用Games-Howell测试组比较差异。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。定量分析的实验动物

总的来说,40老鼠纳入统计分析。失去了一个正常组大鼠在灌注和固定,和一个模型的大鼠组麻醉后死亡。

3.2。温和灸的镇痛效应在IBS模型大鼠慢性内脏过敏

后每组大鼠的心田;分数不同强度(20毫米汞柱,40毫米汞柱,60毫米汞柱,80毫米汞柱)CRD刺激的图所示1。与正常组相比,心田;分数的强度(20毫米汞柱,40毫米汞柱,60毫米汞柱,80毫米汞柱)的大鼠模型组显著增加, 。与模型组相比,心田;许多老鼠的强度(20毫米汞柱,40毫米汞柱,60毫米汞柱,80毫米汞柱)温和灸组显著减少, 。


图1
心田的每组大鼠。数据提出了M, min-max。在同等CRD刺激强度,与正常组相比: ;与模型组相比: 。N:正常组;M:模型组;MM:温和灸组。
3.3。温和灸的效果的表达PK2和冒号的PKR2慢性内脏过敏模型大鼠

免疫组织化学显示,与正常组相比,PK2的表达和PKR2冒号的模型组显著增加, 。温和灸治疗后,与模型组相比,PK2和PKR2结肠的表达显著下降, (数据2,3,4)。


图2
PK2表达在慢性内脏过敏模型大鼠的结肠(免疫组织化学检测)。黄色的污渍表示PK2-positive表达式如箭头所示。PK2主要是表现在粘膜上皮,腺体近端粘膜上皮细胞,间质和结肠的肌肉层。(A1)正常组,模型组(B1),和(C1)温和灸组。酒吧规模:20μm。

图3
PKR2表达在慢性内脏过敏模型大鼠的结肠(免疫组织化学检测)。黄色的污渍表示PKR2-positive表达式如箭头所示。PKR2主要是表现在粘膜上皮,腺体近端粘膜上皮细胞,间质和结肠的肌肉层。(A2)正常组,模型组(B2),和(C2)温和灸组。酒吧规模:20μm。

图4
积分光密度的表达PK2和PKR2每组的结肠。数据提出了M, min-max。与正常组相比: , ;与模型组相比: 。N:正常组;M:模型组;MM:温和灸组。
3.4。温和灸的效果的表达PK2和PKR2慢性内脏过敏模型大鼠的脊髓

免疫组织化学显示,与正常组相比,PK2的表达和在大鼠脊髓PKR2模型组显著增加 。温和灸治疗后,与模型组相比,PK2的表达和PKR2显著下降, (数据5,6,7)。


图5
PK2表达在慢性内脏过敏模型大鼠的脊髓(免疫组织化学检测)。黄色的污渍表示PK2-positive表达式如箭头所示。PK2主要表达在大、中、小神经细胞,血管内皮细胞,和脊髓的间质。(A3)正常组,模型组(B3),和(C3)温和灸组。酒吧规模:20μm。

图6
PKR2表达在慢性内脏过敏模型大鼠的脊髓(免疫组织化学检测)。黄色的污渍表明PKR2-positive表达式如箭头所示。PKR2主要表达在大、中、小神经细胞,血管内皮细胞,和脊髓的间质。(A4)正常组,模型组(B4),和(C4)温和灸组。酒吧规模:20μm。

图7
积分光密度的表达PK2——PKR2-positive信号每组的脊髓。数据PK2表达式给出了M, min-max,而PKR2表达式给出的数据意味着±SD。与正常组相比: ;与模型组相比: 。N:正常组;M:模型组;MM:温和灸组。
3.5。温和灸的效果PK2和PKR2 mRNA的表达在慢性内脏过敏模型大鼠的结肠

PK2 mRNA的放大动力学曲线,PKR2 mRNA, GAPDH mRNA(内部控制)每组结肠图所示8FQ-PCR。结果表明,与正常组相比,结肠PK2和PKR2 mRNA的表达模型组显著增加( , )。温和灸治疗后,结肠PK2和PKR2 mRNA的表达较模型组显著降低( , )(图9)。


图8
PK2 mRNA的放大动力学曲线,PKR2 mRNA, GAPDH mRNA在每组结肠。

图9
的相对表达水平PK2和PKR2 mRNA在每组结肠(%)。数据是平均数±标准差。与正常组相比: , ;与模型组相比: , 。N:正常组;M:模型组;MM:温和灸组。
3.6。温和灸的效果PK2和PKR2 mRNA的表达在慢性内脏过敏模型大鼠的脊髓

PK2 mRNA的放大动力学曲线,PKR2 mRNA, GAPDH mRNA(内部控制)每组脊髓图所示10。FQ-PCR结果表明PK2和PKR2 mRNA的表达在脊髓模型组与正常组相比显著增加( , )。温和灸治疗后,PK2和PKR2 mRNA的表达在脊髓组织与模型组相比显著降低( , )(图11)。


图10
PK2 mRNA的放大动力学曲线,PKR2 mRNA, GAPDH mRNA在每组脊髓。

图11
的相对表达水平PK2和PKR2 mRNA在每组脊髓(%)。数据是平均数±标准差。与正常组相比: , ;与模型组相比: , 。N:正常组;M:模型组;MM:温和灸组。

4所示。讨论

先前的研究表明,战,pkr参与痛觉过敏和痛觉受器的敏感和与疼痛信号的传播密切相关。注入少量的PK / Bv8进入中枢神经系统(16,25和周围神经系统26老鼠的剂量依赖性的方式产生了强烈的痛觉过敏(24- - - - - -27]。一项由Negri et al。17]表明,静脉注射,皮下,鞘内注射Bv8 (PK2青蛙同族体)系统诱导强烈的致敏的机械和热刺激大鼠痛觉受器。缺乏PKs / pkr显著减少对有害刺激的敏感性和降低啮齿类动物的疼痛感28- - - - - -30.]。胡锦涛et al。(28)报道,缺乏PK2基因的老鼠显示减少热力和化学刺激引起的痛觉过敏包括辣椒素和表现出显著降低晚期反应皮下福尔马林。在急性和慢性炎症模型,小鼠PKR-null降低了疼痛行为和显著降低炎症痛觉过敏(30.,31日]。PKR拮抗剂减少并最终废除PK1和PK2-induced hypernociception和炎症痛觉过敏在剂量依赖性的方式31日),这表明PK2 PKR2扮演重要角色在伤害感受器敏感化和痛觉过敏,以及调节周边和中枢疼痛敏化。

腹痛是IBS患者的主要症状之一。与正常个体相比,IBS患者增加了疼痛敏感性和减少疼痛阈值(32- - - - - -34]。当气球在直肠达到40毫米汞柱压力,IBS患者腹痛的90.7%,特异性为80% (35]。IBS症状的严重程度与痛阈,还有亚型之间无显著差异(36]。因此,提高痛阈和缓解疼痛治疗IBS是有效的方法。在这项研究中,在不同强度的刺激(20毫米汞柱,40毫米汞柱,60毫米汞柱,80毫米汞柱),IBS模型大鼠的心田;分数明显增加,明显不同于对照组 。这些结果表明,内脏疼痛敏感性加强和在大鼠痛阈降低模型的建立。沃森的研究等。37)表明,PK2基因表达在胃肠道溃疡性结肠炎患者的显著调节和啮齿动物模型的结肠炎引起的内脏疼痛芥子油,三硝基苯磺酸盐,water-avoidance压力,枸橼酸杆菌属rodentium感染。因此,人们认为增强PK2表达式通过PKR2通路诱导内脏疼痛。在这项研究中,IBS模型大鼠增强内脏疼痛敏感性和减少疼痛阈值;与正常组相比,他们的PK2 / PKR2蛋白质和mRNA表达在结肠癌组织中显著增加( , ),表明PK2 PKR2与增强内脏疼痛敏感性在IBS模型大鼠。

在这项研究中,免疫组织化学显示PK2和PKR2主要表达在粘膜上皮,腺体近端粘膜上皮、间质和结肠肌层。结肠是受五种不同类型的传入神经纤维支配:浆膜,肠系膜,肌肉发达,粘膜和肌肉/粘膜。不同的感觉和运动神经冲动在结肠传输从这些神经纤维传入中枢神经系统通过背根神经节(DRG) [38]。脊髓是一种感觉和运动神经冲动传导的重要途径。神经冲动传递到DRG通过脊髓传送到大脑。躯体和内脏感觉神经生理研究表明在背角神经元兴奋过度,可以发展在外围组织过敏反应或反应起源于脑干下行影响,起着核心的作用在人体的胃肠道慢性痛觉过敏(39]。棺材et al。40)证实,IBS患者脊髓兴奋过度通过研究IBS患者的疼痛的弯曲反射。在这项研究中,PK2 / PKR2蛋白质和mRNA的表达在IBS模型大鼠的脊髓与正常组相比显著增加 , ),这表明PK2 PKR2也参与IBS内脏痛模型大鼠的核心机制。

先前的研究我们的项目团队表明温和灸是一种有效的治疗肠易激综合症(23,24,41]。在这项研究中,温和灸治疗后,异常增加的心田分数在不同的刺激强度(20毫米汞柱,40毫米汞柱,60毫米汞柱,80毫米汞柱)在IBS模型大鼠明显减少 。结果表明,温和灸有效改善内脏过敏,提高痛阈与IBS大鼠,与以前的结果一致(23,24,41]。与模型组相比,PK2 / PKR2蛋白质和mRNA的表达在IBS模型大鼠的结肠和脊髓显著下降( , ),这表明温和灸抑制异常增加PK2 / PKR2蛋白质和mRNA的表达在IBS模型大鼠的结肠和脊髓。这些发现表明,PK2和PKR2参与温和灸镇痛在大鼠慢性内脏痛觉过敏。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是由中国国家基础研究计划(973计划,没有。2009 cb522900),中国国家自然科学基金(没有。81102637),教育部博士学科点基金项目中国没有。上海卫生局(20123107110008),和程序。2010 ql024a)。