文摘

中药配方棱角老子黄(攀钢)长期以来一直作为癌症偏方。阐明攀钢的作用方式与癌症,在目前的研究中,我们使用一个研究者用抗人结直肠癌细胞系(HCT-8/5-FU)评估工程投资的影响多药耐药性(MDR)和epithelial-mesenchymal过渡(EMT)以及TGF -的激活β途径。我们发现,攀钢剂量依赖性抑制HCT-8/5-FU细胞的生存能力,对治疗研究者用ADM、展示工程的能力克服药物抗性。此外,工程投资增加了细胞间积累罗丹明- 123和表达下调HCT-8/5-FU细胞ABCG2的表达。此外,HCT-8细胞耐药性诱导EMT的过程就是明证EMT-related形态变化和变更EMT-regulatory表达的因素,然而被攀钢中和处理。此外,攀钢抑制MDR / EMT-enhanced HCT-8细胞的迁移和入侵能力的方式存在剂量依赖的相关性,镇压MDR-induced激活TGF -β在HCT-8/5-FU细胞信号。综上所述,我们的研究表明,工程投资可以有效地克服耐多药和抑制EMT在人结直肠癌细胞通过抑制的TGF -β途径。

1。介绍

结直肠癌(CRC)是一个严重的公共卫生问题,有超过一百万新病例和全世界每年超过百万死亡半1,2]。尽管手术切除完全消除癌症预后提供了最好的长期生存,很大一部分的CRC患者不适合手术,因为转移在诊断时的表现;和手术不能总是消灭癌症的复发3,4]。因此,化疗,特别是5 -氟尿嘧啶(研究者用)方案为基础,先进的CRC仍是一项重要的治疗选择。然而,由于多药耐药性和不可接受的毒性水平正常细胞,全身化疗使用5-FU-based方案产生的客观反应率只有10 - 20%5- - - - - -8]。这些问题突出小说的发展迫切需要治疗策略和代理。

多药耐药性(MDR),细胞抵抗众多不同作用机制的药物和/或化学结构,是肿瘤化疗失败的主要原因。MDR是由多种机制,包括过度依赖资源的转运蛋白排出抗癌药物的细胞和收购epithelial-mesenchymal过渡(EMT) [9- - - - - -12]。磷酸腺苷磁带(ABC)转运蛋白家族可以泵各种外源性物质的细胞,减少化疗药物的细胞内积累(13,14]。作为half-transporter G亚科的ABC转运蛋白,乳腺癌耐药蛋白(BCRP / ABCG2)是已知的多药耐药性中发挥至关重要的作用。ABCG2的过度保护细胞异型生物质,toxin-induced损失增加流出这些化合物(15]。因此,ABC转运蛋白活性的抑制是一个潜在的方法来克服药物抗性(16]。

EMT是一个生物过程中上皮细胞失去极性,和附着力,并获得间充质细胞的迁徙和侵入性属性。EMT的过程是观察胚胎发育期间,伤口愈合、器官纤维化和癌症进展和转移(17- - - - - -21]。上皮和间质细胞表型和功能不同。上皮细胞有apical-basal极性,表达高水平的上皮标记如钙和彼此紧密相连形成上皮附着连接。相比之下,间充质细胞缺乏细胞极性,如N-cadherin和波形蛋白高表达间充质标记,显示一个纺锤状形态,并通过焦点(相互作用17]。后通过EMT过程中获得间质表型,细胞癌侵犯邻近组织,获得能力突破基底膜,最后进入血液(22- - - - - -24]。此外,越来越多的证据表明,EMT的过程也与MDR的各种类型的人类恶性肿瘤包括CRC (25- - - - - -34]。因此,EMT不仅赋予癌细胞迁移和入侵的独特优势,导致肿瘤进展和转移,而且还扮演着一个重要的角色在耐药性,临床化疗导致的失败。

EMT在癌症进展和转移是高度由不同的细胞因子和生长因子。突出在这些监管因素是转化生长因子β(TGF -β)总科12,34,35),由TGF -β,蛋白质,骨形成蛋白(bmp)生长分化因子(gdf),和其他各种多肽形态因子(36]。这个总科的成员被TGF -β1。TGF -的激活β信号通路是由绑定II型受体的配体,新兵,磷酸化,激活I型受体。然后激活I型受体磷酸化receptor-regulated SMADs (R-SMADs,例如,SMAD2/3)这反过来将coSMAD绑定(例如,SMAD4)。R-SMAD / coSMAD复杂把原子核调节靶基因的表达,包括转录因子的三个家庭,蜗牛,塔尔·bHLH家庭(37,38]。激活后,这些转录因子抑制上皮标记基因表达和调节基因表达间充质导致EMT (35]。因此,通过抑制抑制EMT TGF -β逆转MDR可能代表一种新颖的治疗策略。

自然产品,包括中药(TCM),最近收到了极大的兴趣,因为他们有相对较少的副作用比现代化疗和长期以来一直用于治疗各种疾病包括癌症(39,40]。中药许多天然产物的公式是一个复杂的组合,每一个都包含许多化合物。中医公式因此被认为是多组分和多目标的代理可能发挥他们的治疗活动以更全面的方式。棱角老子黄(攀钢)是一个著名的中药配方规定皇家医师450多年前在中国明朝(41]。攀钢也被用于中国和东南亚几个世纪以来民间治疗各种癌症。以前,我们报道了攀钢抑制结直肠癌生长在活的有机体内和在体外通过促进肿瘤细胞凋亡,抑制细胞增殖和肿瘤血管生成42- - - - - -47]。进一步阐明其抗肿瘤的机制活动,在本研究中,我们评估的影响攀钢在耐多药和EMT研究者用人类抗结直肠癌细胞系和调查行动的潜在机制。

2。方法

2.1。材料和试剂

罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI) 1640中,胎牛血清的边后卫,penicillin-streptomycin试剂盒试剂,罗丹明- 123是来自生命技术公司(美国纽约大岛)。N-cadherin,钙粘蛋白抗体购自Abcam(香港)有限公司(中国香港)。TGF -β,ZEB1 SMAD4 ZEB2,β肌动蛋白抗体和辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体提供了细胞信号技术(美国贝弗利,MA)。ABCG2抗体购自Sangon生物技术(上海,中国)。Transwell钱伯斯获得从康宁生命科学(美国纽约康宁)。BD BioCoat基底膜基质入侵室购买从BD生物科学(美国加利福尼亚州圣何塞)。PrimeScript RT试剂盒由豆类提供生物技术(大连)有限公司,有限公司(大连、辽宁、中国)。所有其他的化学物质,除非另有说明,得到从西格玛化学品(圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.2。准备工作的

工程投资是获得和认证的唯一制造商漳州棱角老子黄制药有限公司、中国(中国FDA的批准号:Z35020242)。股票的解决方案,工程被溶解攀钢粉准备使用之前在PBS(磷酸缓冲盐)20毫克/毫升的浓度。攀钢的工作浓度是由培养基稀释股票的解决方案。

2.3。细胞培养

人类大肠癌癌HCT-8细胞,研究者用耐HCT-8/5-FU细胞从南京凯基生物生物技术获得。有限公司(南京、江苏、中国)。细胞生长在RPMI 1640中含有10% (v / v)的边后卫,青霉素100单位/毫升和100μg / mL链霉素37°C湿润孵化器有限公司为5%₂。这些细胞被confluency亚文化在80 - 90%。HCT-8/5-FU细胞培养包含15 rpmi - 1640年μ研究者用g / mL。

2.4。通过MTT实验来评价细胞生存能力

的可行性HCT-8细胞和HCT-8/5-FU细胞检查了3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)比色测定。细胞被播种到96孔板的密度6×10³细胞/在0.1毫升中然后处理各种浓度的研究者用阿霉素(ADM)、攀钢表示时间的。100年μ在PBS L MTT(0.5毫克/毫升)被添加到每个好,和一个额外的样本孵化4 h 37°C。紫蓝色的MTT甲瓒沉淀于100年解散μL DMSO溶液。吸光度测量在570 nm使用ELISA读者(美国模式ELX800 BioTek)。

2.5。观察形态学变化

HCT-8细胞和HCT-8/5-FU细胞被播种到6-well板的密度5×10⁵细胞/在2毫升的媒介。用相差显微镜观察细胞形态学(徕卡,德国)。照片被放大的×400。

2.6。罗丹明- 123测量积累

HCT-8/5-FU细胞被播种在6-well板密度为2.5×10⁵细胞/毫升2毫升介质,然后显示浓度的细胞治疗攀钢(0 - 0.75毫克/毫升)24 h。1×10⁶细胞被resuspended 1毫升中5μg / mL罗丹明- 123和孵化为一个额外的10分钟37°C公司为5%₂。罗丹明- 123的积累被在冰上冷却,细胞停止洗在冰冷的PBS fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)分析。罗丹明- 123在场的积累相对价值。

2.7。测量细胞迁移和入侵Transwell化验

迁移试验和入侵检测进行了使用transwell细胞培养钱伯斯,涂层没有与基底膜基质(康宁生命科学)或矩阵(BD生物科学)。插入被放置在一个24-well室含0.7毫升rpmi - 1640为10%胎牛血清作为化学引诱物。和之前一样,HCT-8 HCT-8/5-FU细胞被播种到6-well盘子和HCT-8/5-FU细胞治疗与不同浓度的攀钢24 h。细胞(5×10⁴细胞)被播种到插入悬浮在0.2毫升的血清RPMI 1640。细胞在37°C和5%孵化有限公司₂12小时或24小时的迁移和入侵检测。的上表面过滤是去除nonmigratory细胞刮。迁移和入侵细胞被固定并与结晶紫染色。量化,每个领域迁移细胞的平均数量为评估相差显微镜下计数3随机领域(徕卡、德国)200倍的放大。

2.8。RNA提取和rt - pcr分析

HCT-8 HCT-8/5-FU细胞(5×10⁵每个)被播种到6-well板块2毫升中、HCT-8/5-FU细胞处理攀钢24 h浓度表示。总RNA分离试剂盒试剂。益生元(dT)影射RNA (1μg)与PrimeScript reverse-transcribed RT试剂盒根据制造商的指示。获得的cDNA被用来确定ABCG2的mRNA水平,N-cadherin,钙TGF -βSMAD4、ZEB1 ZEB2 PCR。GAPDH是作为内部控制。所有这些基因的引物序列表中列出1。

2.9。免疫印迹分析

HCT-8细胞和HCT-8/5-FU细胞被播种到25厘米²烧瓶密度为1.5×10⁶细胞在5毫升/瓶中。HCT-8/5-FU细胞治疗与攀钢的表示浓度24 h。治疗细胞和哺乳动物细胞溶解细胞裂解缓冲含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒。总蛋白浓度测定BCA化验。等量的蛋白质在12% sds - page凝胶和electroblotted解决。PVDF膜被封锁的5%脱脂奶和探测主要抗体ABCG2 N-cadherin,钙TGF -β,ZEB1 SMAD4 ZEB2,β肌动蛋白(1:1000)在一夜之间在4°C,随后与适当的HRP-conjugated二级抗体增强化学发光检测紧随其后。

2.10。统计分析

所有数据提出了三个决定的方式,分析了使用SPSS软件包为Windows(版本18.0)。统计分析的数据与学生的表现以及和方差分析。差异与被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。攀钢抑制耐研究者用人类结直肠癌细胞系的增殖HCT-8/5-FU

评估癌症细胞MDR活动和治疗效果,工程,HCT-8/5-FU和亲代细胞暴露于不同浓度的研究者用,ADM、攀钢48 h和MTT试验进行确定细胞的可行性。如数据所示1(一)和1 (b),父母HCT-8细胞的生存能力大大减少了治疗研究者用ADM,而HCT-8/5-FU细胞生存能力研究者用或ADM治疗后变化不明显,从而展示HCT-8/5-FU细胞MDR的特性。然而,攀钢显著和剂量依赖性减少父母和耐药的可行性HCT-8细胞(图1 (c)),这表明攀钢可能有能力克服大肠癌细胞化学抗性。

3.2。攀钢抑制药物流出和HCT-8/5-FU细胞ABCG2表达

评估药物流出工程投资的影响,罗丹明- 123积累是决定测量通过流式细胞仪分析细胞内药物的积累。如数据所示2(一个)和2 (b),与未经处理的控制相比,攀钢治疗增加了罗丹明- 123的荧光强度,表明攀钢能够提高积累罗丹明- 123和表明抑制药物流出增加化疗的细胞间积累可能是攀钢克服MDR机制之一。探索潜在的机制,我们确定的ABCG2表达HCT-8细胞和HCT-8/5-FU细胞治疗或没有攀钢用rt - pcr和免疫印迹分析。如数据所示3和6,耐药性诱导ABCG2表达显著抑制了攀钢治疗。

3.3。攀钢抑制MDR-Induced EMT在HCT-8/5-FU细胞

MDR-induced EMT是评估通过观察HCT-8/5-FU细胞形态学变化。如图3(一个)与亲代细胞相比,研究者用耐HCT-8细胞(HCT-8/5-FU)显示典型的EMT形态特征,包括损失的细胞极性、纺锤形fibroblastoid-like形态学,伪足的形成。为了进一步验证这些结果,我们确定HCT-8/5-FU EMT-related因素和亲代细胞的表达用rt - pcr和免疫印迹分析。如图3,收购耐药性的mRNA和蛋白表达水平显著降低上皮钙粘蛋白标志,而间质标记如N-cadherin ZEB1, ZEB2显著增加。然而,攀钢治疗深刻中和MDR-induced变更EMT-regulatory因素的表达在转录和翻译水平(图6)。

3.4。攀钢抑制MDR-Enhanced HCT-8/5-FU细胞的迁移和入侵

自从耐多药和/或EMT促进肿瘤细胞的转移,我们下一个执行transwell化验以确定工程投资的影响HCT-8/5-FU细胞的迁移和入侵。如图4,收购耐药性明显增强的迁徙能力HCT-8细胞约52.8% ()。然而,治疗0.25 - -0.75毫克/毫升的攀钢剂量依赖性HCT-8/5-FU细胞迁移能力减少了32.7% -85.5% ()。以一致的方式,攀钢治疗抑制MDR-enhanced入侵大肠癌细胞剂量依赖性的方式。与未经处理的HCT-8/5-FU细胞(100%)、父母的入侵能力HCT-8细胞或HCT-8/5-FU细胞接受0.25,0.5或0.75毫克/毫升的工程投资%,%,%,或分别为%(图5,)。

3.5。攀钢抑制MDR-Induced激活TGF -βHCT-8/5-FU细胞通路

探索底层机制抑制癌症攀钢耐多药和EMT的活动,我们决定其影响TGF -的激活β途径。如图3 (b),收购耐药性明显增加的mRNA表达TGF -β和SMAD4 HCT-8细胞,但是抑制了攀钢治疗剂量依赖性的方式(图6(一))。蛋白质表达模式的TGF -β和SMAD4在不同的细胞群体相似模式观察各自的信使rna(数字3 (c)和6 (b)),这表明攀钢抑制大肠癌细胞MDR / EMT可能通过抑制TGF -β信号通路。

4所示。讨论

多药耐药性(MDR)的有效性和毒性严重限制当前使用的化疗方案对许多人类恶性肿瘤包括结直肠癌(CRC) (5- - - - - -8]。因此,开发更安全的药物能够克服MDR可能是一个有前途的战略来提高抗癌疗法的有效性。中药(TCM)收到了最近的兴趣,因为他们相对较少的副作用比现代化疗,已经使用了数千年临床治疗各种疾病,包括癌症。棱角老子黄(攀钢),一个著名的中药配方第一明朝规定,长期以来一直用作癌症偏方在中国和东南亚。我们最近表明攀钢抑制大肠癌的生长在活的有机体内和在体外通过调制多个CRC-related信号通路,促进肿瘤细胞凋亡,抑制细胞增殖和肿瘤血管生成(42- - - - - -47]。这些数据表明,工程投资具有广泛的抗癌活动由于其影响多个细胞内目标的能力。为了进一步阐明攀钢的抗肿瘤机制,在目前的研究中,我们使用一个研究者用抗人结直肠癌细胞系(HCT-8/5-FU)评价攀钢对耐药性的影响。我们发现攀钢显著剂量依赖性抑制研究者用的可行性和ADM耐药HCT-8/5-FU细胞。此外,工程投资增加的积累罗丹明- 123和表达下调的耐药性诱导表达ABCG2在HCT-8/5-FU细胞,从而展示工程投资的抑制作用对结直肠癌细胞的药物抗性。

自从epithelial-mesenchymal过渡的过程(EMT)在耐药中扮演重要角色25- - - - - -33),我们对工程投资的影响在EMT HCT-8/5-FU细胞。与先前的研究一致,MDR诱发EMT-related属性在癌细胞48),我们观察到收购HCT-8细胞耐药性导致EMT-related形态变化(例如,失去细胞极性,纺锤状fibroblastoid-like形态、和伪足的形成)和变更EMT-regulatory表达的因素,包括减少上皮钙粘蛋白表达和表达的upregulation标志间充质标记,如N-cadherin ZEB1, ZEB2。然而,这些EMT-related HCT-8/5-FU细胞变化显著中和攀钢治疗。此外,我们发现耐药性的能力显著增强在结直肠癌细胞迁移和入侵。攀钢治疗显著地抑制HCT-8/5-FU细胞的迁移和入侵方式存在剂量依赖的相关性。癌症EMT是由多种细胞内途径包括TGF -β信号。进一步调查机制抑制癌症攀钢耐多药和EMT的活动,我们决定其影响TGF -的激活β信号通路。正如所料,收购耐药性明显增加mRNA和蛋白表达水平的TGF -β和SMAD4。然而,MDR-induced upregulation TGF -β和SMAD4表达显著抑制了攀钢治疗,表明攀钢抑制TGF -β在耐药结直肠癌细胞通路。

总之,我们首次展示工程投资可以有效地克服耐多药和抑制EMT的CRC细胞通过抑制TGF -β途径。连同我们的以前的研究,攀钢抑制几个CRC-related信号通路的激活包括STAT3 Akt, MAPKs,我们推测,攀钢可能发挥其抑制活动耐多药和EMT以整体的方式通过调制多个细胞信号转导途径。这个有趣的观察在以后的研究中应该解决充分阐明攀钢的杀肿瘤的活动的分子机制,这可能有助于开发更好的目标针对癌症治疗的药物。

缩写

工程投资:	棱角老子黄
中医:	中国传统医学
儿童权利公约:	结肠直肠癌
耐多药:	多药耐药性
EMT:	Epithelial-to-mesenchymal过渡
TGF -β:	转化生长因子β。

利益冲突

作者声明没有金融或商业利益冲突。

确认

这项研究是由中国国家自然科学基金会(81373819和81373819)和中国博士后科学基金会(2013 t60636)。