文摘

的目标是。艾iwayomogi(AI)已被用于减少热,利尿,hepatoprotection在韩国。本研究进行了评估的抗炎和antiatopic皮炎效果AI同时使用在体外和在活的有机体内系统。方法。艾未未的作品是由高效液相色谱分析。确定人工智能的抗炎作用,一氧化氮(NO)的生产是用脂多糖治疗RAW264.7细胞。组胺含量化验评价抗过敏药影响MC / 9细胞刺激phorbol-12豆蔻酸盐13-acetate A23187。最后,AI(10毫克/鼠标/天)局部应用的支持和耳朵上Dermatophagoides farinae敏化数控/ Nga小鼠四个星期。结果。Isochlorogenic酸(20.63±0.26毫克/克),绿原酸(9.04±0.08毫克/克),和东莨菪亭(8.23±0.01毫克/克)是人工智能的主要组件。AI抑制NO和组胺产品RAW264.7和MC / 9细胞,分别。老鼠,AI的局部应用减少了皮炎分数的背侧皮肤和耳朵和降低了等离子体的IgE水平。结论。这些结果表明,人工智能会探索作为一个潜在的治疗治疗广告代理,使用高效液相色谱分析方法将促进质量控制对于人工智能的发展。

1。介绍

传统上,草药已被用于治疗或预防疾病。艾iwayomogi菊科(AI)在韩国已经用于治疗各种疾病,包括肝衰竭和炎症和免疫相关疾病。人工智能已经知道抑制肝纤维发生通过减少氧化应激和脂质过氧化作用[1)和预防高脂肪饮食——(HFD)诱导肥胖和代谢紊乱的差别通过对这些基因表达与内脏脂肪组织(脂肪形成和炎症有关2]。答:毛细血管(AC,菊科)之一艾草本植物,传统上用作草药在东亚和报道药典在韩国,中国和日本。然而,人工智能只是朝鲜草药药典中提到。艾城的功效比交流少报告因为艾未未不是传统上用于其他国家。

特应性皮炎(AD)是一种常见的炎症,长期慢性或复发,非接触传染的,痒的皮肤病(3]。广告通常是伴随着过敏炎症,这是由自适应免疫反应的激活。在浆细胞产生免疫球蛋白E (IgE)和绑定由肥大细胞在I型过敏反应。IgE-primed肥大细胞释放化学介质,如组胺、白细胞三烯(LTs)和前列腺素D₂(PGD₂)。这些介质导致立即反应阶段的组织,如红肿和瘙痒,不久allergen-IgE绑定。在疾病的后期阶段,细胞因子(il - 4和IL-13)和趋化因子生成和释放的几个小时后allergen-antibody交联(4]。

局部皮质类固醇(TCs)和非药物疗法,如润肤剂,一线处方治疗广告。TCs目前最有效的治疗。然而,他们长期使用也可以与显著的负面影响,如皮肤变薄、抗肾上腺抑制和治疗(5,6]。作为一个二线治疗,局部钙调磷酸酶抑制剂(tci),如他克莫司和pimecrolimus,已报告为过敏性皮肤炎是有效的。tci开发期间抑制免疫反应的结果,拒绝在器官移植受者。然而,担忧系统性毒性限制了它们的使用。外用他克莫司软膏导致瞬态燃烧在~ 60%的病人7,8]。随后,需要有效地管理广告的反应,同时减少其副作用导致替代疗法的发展。

人工智能已经用于治疗过敏性疾病;人工智能的影响在特应性皮炎(AD),炎症过敏疾病,迄今为止尚未建立。本研究进行分析的内容成分在人工智能和艾城的抗炎和抗过敏药效果评估在脂多糖(LPS)对RAW264.7细胞和phorbol-12豆蔻酸盐13-acetate (PMA)和A23187-treated MC / 9细胞,分别。此外,人工智能应用于分析这些疗法”对广告的影响反应在Nc / Nga老鼠。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂进行高效液相色谱分析

绿原酸和咖啡酸从穿越购买有机食品(美国宾夕法尼亚州匹兹堡)。东莨菪亭和光纯化学工业,是购自kouichi有限公司(日本大阪)。异槲皮苷,isochlorogenic酸和异鼠李亭来自Biopurify植物化学物质有限公司(中国成都)。六个化合物被确定的纯度≥98%,高效液相色谱分析。HPLC-grade试剂、甲醇、乙腈和水从j.t得到贝克(美国新泽西州Phillipsburg)。冰醋酸是分析试剂级和采购从Junsei(日本东京)。

2.2。高效液相色谱条件

高效液相色谱分析用日本岛津公司LC-20A高效液相色谱系统(日本岛津公司有限公司日本京都)组成的一个LC-20AT泵,DGU-20A₃在线脱气装置、SPD-M20A探测器SIL-20AC autosampler, CTO-20A柱温箱。数据处理器使用LC解决方案软件(版本1.24,日本岛津公司有限公司日本京都)。分离使用的列是双子座C₁₈(250×4.6毫米;粒度5μ米,Phenomenex;托兰斯、钙、美国)。移动阶段是由(1.0%水乙酸,v / v)和B(乙腈1.0%的醋酸,v / v)。梯度流如下:0 - 5分钟,10 - 10% B;5 - 30分钟,10 - 50% B;30至35分钟,50 - 50% B;35 - 40分钟,50 - 10% b柱温箱的温度维持在40°C。执行的分析与PDA 1.0毫升/分钟的流量检测在254,320和340海里。注射体积是10μl

标准6个化合物的股票的解决方案、绿原酸、咖啡酸、东莨菪亭、异槲皮苷,isochlorogenic酸和异鼠李亭(图1)溶解在甲醇浓度为1.0毫克/毫升,保持4°C以下。工作标准的解决方案被稀释的校准曲线的浓度范围0.78 - -50.00μ绿原酸和东莨菪亭g / mL, 0.16 - -10.00μ克/毫升咖啡酸、异槲皮苷和异鼠李亭,-150.00和2.34μ分别g / mL isochlorogenic酸。

2.3。制备的水提取物和样品溶液

提取干AI(2.5千克)与水(25 L×1时间)在100°C 2 h使用草药萃取器(宇宙- 660,Kyungseo机器有限公司,仁川,韩国)。人工智能是购自HMAX (Jecheon、韩国)在2008年6月。这些材料被证实由Je-Hyun李教授分类学的东国大学朝鲜。凭证标本(ai - 2008 st27)沉积草药配方研究集团,东方医学研究所。提取的解决方案是通过滤纸过滤和冻干(359.51 g)。提取的收益率为14.38%。冻干提取(20毫克)溶解在70%乙醇(10毫升),然后透过0.2μm膜滤器(Woongki科学,首尔,韩国)之前注入的高效液相色谱法同时测定。

2.4。一氧化氮(NO)和铂族元素₂产品在LPS-Stimulated RAW264.7细胞

命巨噬细胞细胞株RAW264.7,获得了来自美国文化集合类型(写明ATCC,罗克维尔市,医学博士,美国)和在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(DMEM Gibco BRL。美国纽约)含有5.5% (v / v) heat-inactivated胎牛血清(Gibco BRL的边后卫。美国纽约)和100 U /毫升青霉素和100年μg / mL链霉素(Gibco BRL,纽约,美国)。细胞被播种在96 -孔板(2.5×10³细胞/)的细胞毒性试验,然后孵化与不同浓度的人工智能提取(10、50和100μg / mL) 24小时。培养基的最终体积是100μ信用证。车辆控制1% DMSO溶液。治疗后,10μL细胞计数Kit-8试剂(CCK-8、Dojindo、日本)添加到每个盘子被孵化4人力资源。吸光度测量在450 nm使用标(基准+ Bio-Rad实验室Inc . PA,美国),和可行的细胞的百分比计算。细胞毒性治疗后不会发生对RAW264.7细胞AI提取10 - 100的范围内μ克/毫升。

没有和铂族元素₂化验,RAW264.7细胞被播种密度的5×10⁵细胞/在48-well盘子。16小时后,细胞被刺激与1μ克/毫升的有限合伙人在没有或AI(10 - 100的存在μg / mL) 18小时。N^G-methyl-L-arginine (NMMA;Sigma-Aldrich, Inc .)、美国密苏里州)和吲哚美辛(Sigma-Aldrich, Inc .)作为积极的控制来抑制没有和铂族元素₂分别生产。最后的成交500μ信用证。样本处理有限合伙人的细胞在同一时间。孵化后,收集细胞培养基和用于测量没有(Promega格里斯试剂系统。美国WI) [9)和铂族元素₂(铂族元素₂酶联免疫试剂盒,开曼化工有限公司、美国MI)水平根据制造商的协议。

2.5。组胺生产PMA和A23187-Stimulated MC / 9细胞

大鼠肥大细胞,MC / 9,从写明ATCC获得和培养Iscove修改杜尔贝科的介质(Gibco BRL。美国纽约)之前补充10% heat-inactivated的边后卫,青霉素(100 U /毫升),和链霉素(100μg / mL)有限公司5%₂孵化器在37°C。人工智能的细胞毒性与相同的方法如RAW264.7细胞化验。MC / 9中没有细胞毒性细胞治疗后与AI提取物浓度低于50μ克/毫升。组胺的生产试验,细胞被播种在48-well板块(2×10⁵细胞/)和培养16小时。孵化后,MC / 9细胞被刺激与佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA, 50 nM, Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)和A23187 (1μ米,钙离子载体,Sigma-Aldrich)没有或AI (25 - 50μ为24小时(g / mL)10]。最后的成交500μ信用证。样本处理PMA和A23187细胞在同一时间。收集上清液,组胺生产的酶联免疫试剂盒测定,根据提供的协议牛津生物医学研究(美国牛津,MI)。

2.6。动物和敏感

广告皮肤损伤男性生成NC / Nga小鼠(韩国首尔的中心实验室动物Inc .)使用Dermatophagoides farinae提取软膏(Biostir-AD Biostir有限公司,神户,日本)(11]。单独的老鼠被安置在一个有空调的房间保持在24±2°C 55±15%的相对湿度。所有程序涉及动物按照指南进行了机构的动物保健和使用委员会东方医学研究所(批准文号:# 10 - 052)。

十周大的老鼠被随机分为四组每组:7小鼠unsensitized(正常;200年μL 70% EtOH /鼠标/天),d . farinae敏化(控制;200年μL 70% EtOH /鼠标/天),d . farinae敏化+ Protopic ointment-treated (Protopic;50毫克/鼠标/天),d . farinae敏化+人工智能extract-treated(人工智能;10毫克/鼠标/天)组。对敏感,50毫克Biostir-AD是局部应用上背皮肤和耳朵的4周每周两次。人工智能中溶解提取车辆(70% EtOH)的解决方案。Protopic软膏作为积极的控制。车辆、人工智能提取和积极控制应用上背皮肤4周期间,每天耳朵敏感。

2.7。皮炎的分数

背侧皮肤上的皮炎分数评估和耳朵每周4周。湿疹面积和严重程度指数(EASI)评分系统用于评估的严重性皮炎。这是定义为分数之和为红斑/出血,水肿,表皮脱落/侵蚀,和缩放/干燥如下:没有症状,0;温和,1;温和,2;和严重的,312]。

2.8。组织学分析

治疗4周后,小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉的(Entobar inj。,Hanlim制药。有限公司、韩国)。从劣质收集血液样本腔静脉然后存储在Microtainers (Becton, Dickinson和公司,新泽西,美国)包含K₂edta。血浆样本收集在10000转离心后10分钟和存储−80°C。一个完整的观察进行所有终止动物。背侧皮肤和一只耳朵的老鼠被固定在10% (v / v)中性缓冲福尔马林24小时。组织被嵌入在石蜡,然后分段在4μ米厚度。组织部分被苏木精和伊红染色(H和E)来估计表皮炎症(肥大和炎症细胞的浸润)。肥大细胞真皮与甲苯胺蓝染色,在显微镜下观察。肥大细胞的平均数字测量通过计算三种不同地区每个幻灯片的皮肤(×100),意思是细胞的数量计算。

2.9。等离子体的IGE水平和组胺

等离子体的IgE水平(美国Bethyl实验室Inc .)和组胺(美国牛津大学生物医学研究)量化使用ELISA包根据制造商的指示。

2.10。统计分析

数据分析使用一个单向方差分析Bonferroni多重比较检验紧随其后;所有的日期都表示为±SEM的手段。一个值< 0.05被定义为具有统计学意义。所有统计分析使用SYSTAT 8.0程序(SYSTAT Inc .,埃文斯顿,美国)。

3所示。结果

3.1。在人工智能定量的成分

的色谱使用HPLC-PDA AI中提取得到。在优化的色谱条件下,6个化合物中筛选了35分钟的样品分析使用移动阶段包括溶剂(1.0%,v / v,醋酸水)和溶剂B (1.0%, v / v,醋酸乙腈)。

峰面积的线性()与浓度(,μg / mL)曲线为每个组件是用来计算人工智能提取的主要组件的内容。相关系数()校正曲线的六个主要成分是≥0.9999。线方程和总结了校正曲线的值表1。保留时间的绿原酸,咖啡酸,东莨菪亭、异槲皮苷,isochlorogenic酸,异鼠李亭分别为11.63,14.80,15.55,19.78,21.63,和30.53,分别。图1显示了高效液相色谱色谱标准溶液和水提取物的人工智能。Isochlorogenic酸是一个主要成分(20.63±0.26毫克/克)在我们的分析系统,和六个成分的内容范围从0.64至20.63毫克/克。总结了为每个组件分析结果确认表2。

3.2。抑制效应的人工智能不,铂族元素₂和组胺生产

人工智能是抑制炎症和过敏反应在体外系统。LPS-induced生产被AI提取物显著降低剂量依赖性的方式相比,有限合伙人单独治疗组(,图2(一个));然而,在铂族元素没有差别₂生产(数据未显示)。组胺生产被AI PMA和A23187-stimulated MC / 9细胞(,图2 (b))。

3.3。皮炎的分数在Nc / Nga老鼠

每组的代表照片,老鼠开发宏观损伤背部皮肤上和耳朵开始启动后的第二个星期d . farinae提取治疗(图3(一个))。背侧皮肤和耳损伤严重程度的AI组与对照组相比显著降低在第三和第四个周()。然而,皮炎Protopic-treated阳性对照组的成绩比对照组没有不同。最大的皮炎分数记录后的第四个星期d . farinae提取应用程序在所有组。每组的得分如下:0.0±0.00(正常),7.1±0.43(控制),8.1±0.54 (Protopic)和4.9±0.60 (AI)(图3 (b))。

3.4。组织学观察

对照组显示显著的背侧皮肤和耳损伤和出血,肥厚,表皮角化过度的背区域(图3 (c))。这些变化是AI组显著提高;然而,Protopic组没有变化。肥大细胞的渗透是减少了人工智能的应用在背侧皮肤(图3 (c))。

3.5。血浆组胺和IGE水平

血浆组胺水平升高d . farinaeextract-sensitization(对照组,39.85±5.44 ng / mL)相比正常组(28.56±2.56 ng / mL)。人工智能中的组胺含量减少治疗组(27.83±4.60 ng / mL);然而,与对照组相比没有显著差异()。Protopic治疗组,组胺水平(25.54±1.93 ng / mL)下降,而对照组(,图4(一))。

此外,总血浆IgE水平在对照组显著增加(211.3±13.4 ng / mL)比正常组(41.56±7.02 ng / mL,)。AI治疗抑制血浆IgE水平增加(139.0±27.6 ng / mL)d . farinae致敏小鼠()。然而,Protopic组无显著性差异(175.4±20.4 ng / mL,图4 (b))。

4所示。讨论

过敏反应,包括特应性皮炎(AD),由于开发的不平衡Th1、Th2细胞所介导的IgE和组胺水平。广告的特点是过度的炎性细胞因子il - 10和IgE水平高。Th2细胞的参与都有助于解释的共同参与IgE-producing B细胞(通过il - 4和IL-13),肥大细胞(通过il - 4和il - 10)和嗜酸性粒细胞(通过IL-5)过敏炎症过程和其他病理生理的特性的过敏13]。

艾有草药,包括人工智能、肝脏疾病和炎性疾病。我们调查了抗炎和anti-AD AI治疗使用的影响在体外和在活的有机体内系统,因为广告是与炎症反应密切相关。AI抑制生产的没有LPS-stimulated RAW264.7细胞巨噬细胞。组胺生产也抑制了人工智能在PMA -和A23187-stimulated MC / 9肥大细胞。数控/ Nga小鼠具有广告皮肤损伤和血IgE水平升高。皮肤变化,开发数控/ Nga老鼠密切模仿人类广告,而传统发展后感染螨虫(14]。最重要的过敏原与人类相关的广告是屋尘螨过敏原,和d . farinae是最常见的屋尘螨的环境。肥大细胞的渗透是广告发展的另一个重要因素15]。AI治疗减少了皮炎分数后的第三周d . farinae敏化数控/ Nga老鼠。此外,AI抑制疾病的组织学特征,包括水肿,表皮的角质化,和背侧皮肤肥大细胞浸润和耳朵。此外,AI治疗降低了血浆组胺和IgE水平d . farinae敏化数控/ Nga老鼠。

Protopic组、阳性对照组皮炎得分与对照组相比没有减少。作为Protopic药膏的副作用之一,患者皮肤过敏和燃烧的应用程序(6]。因此,我们预计高皮炎Protopic组的分数会增加引起的瘙痒行为应用领域的药膏。然而,血浆组胺和IgE水平降低的小鼠。

在目前的研究中,人工智能提取的化学内容分析了使用高效液相色谱法(HPLC)系统。Isochlorogenic酸,绿原酸,东莨菪亭发现人工智能提取的主要化合物。Isochlorogenic酸已报道有王亚南效果和抗氧化性能通过感应HO-1 [16)和immunopotentiation属性通过NF -介导的κB-induced从巨噬细胞释放的17]。据闻绿原酸抑制炎症介质和细胞因子的生产18,19]。此外,绿原酸具有抗菌、抗氧化、antihepatic损伤和抗过敏药活动(20.,21]。李等人报道,东莨菪亭已表现出抑制osteoclastogenesis RAW264.7细胞(22通过清除活性氧(ROS)。IL-5,东莨菪亭显著抑制interleukin-4 (il - 4)和il - 10的生产(23]。东莨菪亭的抗过敏药性质的差别可能由对这些Th2细胞中细胞因子的表达。因此,使用高效液相色谱法的分析方法来区分的主要成分AI, isochlorogenic酸,绿原酸,和东莨菪亭,可能是一个有用的质量控制方法,这些AI的补救措施。

5。结论

这些结果表明,人工智能抑制广告皮肤损伤减少代IgE,皮肤的炎症反应,释放的介质,如组胺、d . farinae敏化数控/ Nga小鼠模型。我们认为人工智能应该探索作为一个潜在的治疗剂治疗过敏疾病,包括广告。

利益冲突

没有利益冲突存在于本文。

承认

这项研究受到了资助“建设科学证据的草药配方(K13030),“从东方医学研究所(KIOM)。