文摘

客观的。探索Cryptotanshinone对扭转的影响生殖和代谢紊乱在多囊卵巢综合征(PCOS)模型大鼠和可能的调节机制。方法。PCOS模型大鼠皮下注射诱导的脱氢表雄酮(DHEA)组织学检查和验证的阴道脱落细胞。Cryptotanshinone干预后,大鼠的体重和卵巢形态学观察;血清生化评估分析放射免疫检定法(RIA)和相关的关键基因和蛋白质与雄激素合成代谢和胰岛素被实时PCR和免疫组织化学检测(包含IHC)。结果。发情PCOS的旋回性模型大鼠被Cryptotanshinone明显恢复。体重、卵巢系数和卵巢形态学和血清生化指标的改善包括睾酮(T)、雄烯二酮(A2)、促黄体激素(LH)、LH /促卵泡激素(FSH)、性结合球蛋白(SHBG),低密度胆固醇(低密度脂蛋白)、空腹胰岛素(鳍)后被逆转Cryptotanshinone干预。具体来说,细胞色素P450的水平,只有17羟化酶/ 17日20裂合酶(CYP17)和雄激素受体(AR)大幅下调。结论。我们的数据表明,Cryptotanshinone可以平衡生殖和代谢紊乱在PCOS模型大鼠和可能是一个潜在的代理治疗PCOS的治疗。

1。介绍

多囊卵巢综合征(PCOS),一个复杂的遗传条件,是一个非常普遍的异构综合征的临床和/或生化雄激素过多症,oligoanovulation、多囊性卵巢(PCO)和不含其他内分泌病根据2003年鹿特丹标准(1,2]。患多囊卵巢综合征的妇女生殖异常的风险,增加和三分之二的人也有代谢功能障碍,因此,会增加患2型糖尿病(T2DM)病人体内的风险和心血管疾病(CVD) (3]。所以扭转高雄激素水平的治疗和改善PCOS患者的胰岛素敏感性是重要的。

Cryptotanshinone,传统上称为tanshinone,原本孤立的干燥根茎丹参Bunge (4]。在传统中药中,Cryptotanshinone广泛规定几个病态,包括痤疮、心血管和内分泌代谢疾病如糖尿病(5]。我们的研究努力探索影响机制即Cryptotanshinone,改善了雄激素过多和脱氢表雄酮引起的胰岛素抵抗在PCOS大鼠模型。

2。材料和方法

2.1。动物

SPF级女性Wistar鼠(年龄21 d;身体wt 35 - 40克; )购自上海松弛实验动物有限公司有限公司(许可证:SCXK(胡),2007 - 0003年),在第二军医大学动物中心,25°C恒定的温度(湿度50%),12 h: 12 h黑暗的周期性交替。综述了这里描述的所有程序和第二军医大学伦理委员会批准。

2.2。药物

Cryptotanshinone(纯度99%)购买从上海章子怡生物科技有限公司有限公司(批号:E - 0024);脱氢表雄酮(纯度 99%)购买从σ(批号:D4000);芝麻油(注射用)购买的σ(批号:S3547)。

2.3。大鼠模型

PCOS大鼠模型,根据安德森et al。6,7),是由皮下注射诱导脱氢表雄酮和组织学检查证实的阴道脱落细胞。具体来说,23岁的d, 40老鼠(DHEA-ed集团)皮下注射脱氢表雄酮6毫克/公斤/天(溶解到0.2毫升麻油),而另一10 (oil-ed集团)皮下注射香油0.2毫升/天。两个组管理20天;阴道脱落细胞的测试被连续10天,选择成功PCOS大鼠模型。oil-ed组大鼠正常发情周期。

2.4。药物干预

53岁的d, 24日成功从DHEA-ed组PCOS大鼠模型选择,随机分为两组:一个是模型组( )和其他药物组( )。10正常大鼠(oil-ed集团的)被称为对照组( );模型组大鼠与对照组老鼠安排口头接受以下车辆:生理盐水(剂量:0.01 mL /身体wt (g) /天),而药物组大鼠口服收到Cryptotanshinone(在生理盐水溶解剂:0.027毫克/身体wt (g) /天)(8]。三组的老鼠都是9点到10点之间治疗4周。每天M。

2.5。RIA分析

生化RIA的鼠血清weredetected评估分析。腹主动脉血(大约4毫升)从实验大鼠麻醉获得3.5%水合氯醛(350毫克/公斤体重)。留给2 h后在室温下,整个血液离心15分钟(2500克)和血清分离并存储在−20°C冰箱前测试。最后,血清T水平,A2,雌二醇(E2)、LH、FSH、SHBG,甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度胆固醇(HLD-C),低密度脂蛋白空腹血浆葡萄糖(台塑)和鳍被RIA工具检测到。这部分的测试实验coperformed上海奥迪康生物技术有限公司中国有限公司。

2.6。光学显微镜分析

双边老鼠的卵巢组织手术分离和湿重值获得电子天平。一侧的卵巢组织立即被存储在液态氮;对方很快就在10%福尔马林固定24小时,然后脱水乙醇浓度增加,其次是沉浸在二甲苯和石蜡包埋。石蜡包埋的卵巢部分(4μ米)被苏木精和伊红染色,在传统光学显微镜分析。此外,3每个卵巢部分随机选择和毛囊的数量(包括各级卵泡)计算。两个调查员,蒙蔽了部分的独立起源,分析了部分传统的显微镜下,把可用的图片,和毛囊的数量计算。

2.7。实时聚合酶链反应分析

六个卵巢组织从每组保存在液氮中随机选择实时PCR分析。卵巢组织总RNA分离后用试剂盒试剂和制造商的指示。总RNA (3μg)与逆转录反向转录工具包(美国鞑靼)所描述的制造商。由此产生的cDNA在无菌水稀释10倍,整除受到实时PCR。PCR引物对分析设计并形成了表达载体生物科技有限公司,有限公司,上海,中国(表1)。最后,3 hsd, cyp17、cyp19 ar、igf - 1和gdf-9 mRNA水平,分别分析了定量PCR仪(ROTORGENE6000 Carbett。)。每个目标基因的相对表达相比 肌动蛋白是计算使用 方法。

表1
目标基因的引物序列。
2.8。包含IHC分析

免疫组织化学的方法是使用一个两步执行设想/合技术(Dako Cytomation,丹麦)根据制造商的指令作为描述协议引用的出版物(9]。的蛋白质包括3 羟基类固醇脱氢酶(3 hsd)、CYP17、细胞色素P450芳香化酶(CYP19),基于“增大化现实”技术,胰岛素样生长因子(igf - 1)和生长分化factor-9 (GDF-9)。表2列出了本研究中使用的抗体。两个调查人员评估被蒙蔽考试(表程度的疣状2)。

表2
本研究中使用的抗体。
2.9。统计分析

统计分析了评估使用社会科学统计软件包(SPSS 16.0版)。值表示为±SD方法。独立的 测试评估差异和单向方差分析是用来分析组间的差异。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。发情旋回性

根据获得的主要细胞类型在阴道涂片每日连续(10天)由微观分析,可以观察到老鼠的发情旋回性。注射后脱氢表雄酮为20天,25大鼠在障碍的发情周期性DHEA-ed组大鼠(40),和脱氢表雄酮引起的PCOS大鼠模型的成功率是62.50%。此外,无序发情周期的7大鼠药物组大鼠(12)被撤销Cryptotanshinone干预后28天,复苏率为58.33%,统计学意义与模型组的自然恢复率8.33%(表3和4)。

表3
脱氢表雄酮引起的PCOS大鼠模型的成功率。
表4
Cryptotanshinone干预的回收率。
3.2。体重和卵巢系数

从53岁d,每组的大鼠体重的频率一次五daysuntil结束的药物干预;平均体重值的计算和观察体重增加的趋势(图1)。


图1
三组体重增加的趋势。蓝、红、绿线代表对照组,模型组和药物组,分别。如图所示,增加重量毒品集团的价值已经下降相比,模型组大鼠。

91岁的d,所有大鼠禁食,但水12 h,然后通过电子称重和对比组。模型组大鼠的平均体重值( g)显著高于对照组大鼠( g)和药物组大鼠( g)。另外,卵巢系数=卵巢重量/体重(毫克/ 100克)。根据统计的结果数据,模型组大鼠的平均卵巢系数[( )与对照组相比显著增加的(( ));而与模型组相比,药物组的平均卵巢系数统计下降[( )(图2)。


图2
体重的比较值和卵巢率在三组;模型组( )与对照组( ):* ;药物组( )与模型组( ):Δ 。
3.3。生化评估

RIA的检测后,血清T水平有显著差异,A2, E2、LH、LH / FSH、SHBG, TC, LDH-C,高密度脂蛋白胆固醇,鳍对照组与模型组之间( )。比较模型组与药物组,血清T的浓度有明显的区别,A2、LH、LH / FSH、SHBG, LDH-C,鱼翅,而血清E2水平,两组之间TC、hdl - c是无意义的。更重要的是,没有统计学差异,血清FSH水平,TG,台塑的三组(表吗5)。

表5
血清生化评估等。
3.4。病理形态学

光学显微镜分析显示,对照组大鼠没有结构异常:卵巢组织是粉红色,毛囊(数量 /字段)和黄体在不同的发展阶段,和颗粒细胞层是正常的(颗粒细胞层的数量是6 - 8)。然而,模型组大鼠的差异是显著的:卵巢组织是更轻的颜色作为一个整体的观察;囊性卵泡的数量(一个巨大的充满液体的囊肿,是数量 /字段)增加,颗粒细胞层异常(数量。颗粒细胞层2 - 4甚至没有);此外,黄体的数量急剧下降。Cryptotanshinone干预后,药物组的卵巢病理形态学大大逆转,卵巢组织的颜色和颗粒细胞层的数量有一定程度的恢复,和囊性卵泡的数量(数量 /字段)的数量减少而语料库luteums增加(图3)。


图3
通过光学显微镜卵巢组织的病理形态学分析。如图所示,有显著差异,毛囊的数量厚(短箭头)和黄体厚(长箭头),和数量的颗粒细胞层(细长的箭头)模型组和对照组之间不仅还在药物组和模型组之间。
3.5。基因和蛋白质表达

相关的关键基因和蛋白质水平的雄激素合成代谢和胰岛素被实时PCR和包含IHC检测。ar的表达cyp17、cyp19, igf - 1在模型组显著高于对照组;Cryptotanshinone干预后,cyp17和ar的表达被撤销;然而,cyp19和igf - 1的水平是无意义的。3的水平 hsd和gdf-9没有统计学差异根据实时PCR分析。此外,包含IHC分析,除了蛋白质CYP17和AR已经大幅下调,似乎Cryptotanshinone几乎没有影响换向蛋白质CYP19和igf - 1的表达增加模型组,而蛋白质3 hsd和GDF-9几乎没有组间的显著差异,都是与实时PCR(数据的结果一致4,5,6)。


图4
卵巢组织的基因表达分析实时PCR。如图所示,3之间没有明显的差异 hsd mRNA和gdf-9 mRNA 3组。cyp17 mRNA的表达( ),cyp19 mRNA ( ),基于“增大化现实”技术的信使rna ( )和igf - 1 mRNA ( 在模型组比对照组显著增加( )。药物干预后,cyp17 mRNA的表达( )和基于“增大化现实”技术的信使rna ( )在统计学上减少,而cyp19 mRNA和igf - 1 mRNA没有统计学差异(cyp19 mRNA: ;igf - 1 mRNA: )。模型组( )与对照组( ):* ;药物组( )与模型组( ):Δ 。

图5
免疫组织化学染色3 hsd CYP17、CYP19, AR, igf - 1, GDF-9三组。如图所示,CYP17主要是局部细胞外壁厚(短箭头),基于“增大化现实”技术主要是表达在细胞外壁厚(短箭头)和在颗粒细胞(细长的箭头),而其他蛋白质的表达是不明显的。

图6
通过包含IHC卵巢组织的蛋白表达分析。如上面的柱状图所示,除了3 hsd GDF-9,的表达CYP17、CYP19,基于“增大化现实”技术,和igf - 1在模型组比对照组显著增加,而在药物组只有CYP17和AR下降据统计。模型组( )与对照组( ):* ;药物组与模型组( ):Δ 。

4所示。讨论

Cryptotanshinone,一种脂溶性的二萜类物质(10),被孤立的草丹参和确定为主要的化学成分11]。它的分子式是C19H20.O3,Mol. wt.是296.35,和化学结构如图7。


图7

现代药理研究表明,Cryptotanshinone抗菌的作用,抗炎,典型药物和抗糖尿病的活动12,13),规定了几种疾病,包括冠心病(CHD),心绞痛,心肌损伤。最近,一些学者们研究他们的利益关注Cryptotanshinone和一些内分泌代谢疾病之间的关系。例如,杨et al。8)报道,Cryptotanshinone可以扭转先天androgenized老鼠的干扰;Qi et al。14]发现Cryptotanshinone可以改善胰岛素抵抗的猪卵巢卵泡膜细胞体外培养。

在我们的实验中,我们成功地诱导的多囊卵巢综合征大鼠模型通过皮下注射脱氢表雄酮,一种外源性雄激素。大鼠模型中,一般来说,重现了人类PCOS的生殖和代谢功能,包括不规则发情周期,增加体重,和卵巢系数和血清生化异常T, A2, E2、LH、LH / FSH、SHBG, TC, LDH-C,高密度脂蛋白胆固醇和鳍。Cryptotanshinone干预后,模型大鼠的发情周期性明显恢复。此外,体重、卵巢系数和卵巢形态学PCOS大鼠模型的改进。更值得注意的是,血清生化指标包括T, A2、LH、LH / FSH、SHBG, LDH-C,鳍被大幅逆转。

卵巢是雄性激素的来源之一,人体胰岛素的合成代谢。在PCOS卵巢组织,膜细胞和颗粒细胞异常关键基因的mRNA表达雄激素合成代谢和胰岛素,包括3 hsd cyp17、cyp19, ar, igf - 1和gdp-9。我们的数据表明,cyp17和ar水平显然是由Cryptotanshinone下调;因此,这两个基因的蛋白质含量也包含IHC侦察到的表达下调。

在扭转的可能的调节机制Cryptotanshinone PCOS模型大鼠的生殖和代谢紊乱可能是如下:大量的外生脱氢表雄酮提示垂体促激素敏感(GnRH)和增加LH的分泌过多;激性腺素释放素/ LH的增加可以提高细胞色素P450和17 -的活性 羟化酶/ 17日20裂合酶(由cyp17基因编码),外壁细胞的关键酶之一,结果在A2和T的合成增加15]。卵巢雄激素过多,一方面,抑制卵泡的发展,很难形成一个优势卵泡,最后导致多囊卵巢(PCO)样品的状态(16];另一方面,小卵巢中的卵泡可以分泌E2,相当于早期的毛囊,A2可转化为雌激素酮(E1)细胞色素P450芳香化酶(由cyp19基因编码)以外的组织。持续释放E1和一定程度的E2影响下丘脑和垂体17分泌促黄体激素)做一个积极的反馈,进一步增加的幅度和频率LH分泌,并使之比LH / FSH倒生的。Cryptotanshinone可以直接和/或间接减少A2和T的水平可能通过抑制表达CYP17、减少雄性激素的生物合成。此外,我们的测试还发现,基于“增大化现实”技术的水平被Cryptotanshinone表达下调,从而降低雄激素的作用通过限制AR的表达。

现代科学研究普遍认为多囊卵巢综合征是一种代谢紊乱;大多数的PCOS患者患有胰岛素抵抗和脂质代谢障碍。高胰岛素血PCOS可能直接影响下丘脑或垂体和提高LH水平,因此间接提高雄性激素的分泌由LH (18]。与此同时,高胰岛素血症可能抑制肝脏和SHBG的合成引起游离睾酮(FT)的增加(19]。目前,相信在外周血SHBG水平可以反映出胰岛素抵抗的程度(18]。在我们的研究中,我们发现血清生化指标和鳍SHBG Cryptotanshinone干预后明显规范。此外,igf - 1水平有下降的趋势Cryptotanshinone集团,尽管没有统计学意义,但我们不能排除这种情况,Cryptotanshinone增强胰岛素敏感性,改善胰岛素抵抗通过抑制igf - 1的表达。此外,一些报告显示,雄性激素可以增强脂蛋白脂肪酶(LPL)分解代谢20.)和胰岛素对低密度脂蛋白受体的活动有调节作用[21]。有趣的是,血清生化水平的低密度也降临后Cryptotanshinone干预我们的研究。

5。结论

Cryptotanshinone能扭转PCOS的生殖和代谢障碍模型大鼠通过下调CYP17和AR的表达,它可能间接增加胰岛素敏感性。因此,它可能是一个潜在的代理治疗PCOS患者的治疗。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Dongxia翟负责手术的老鼠实验过程。张丹妮负责统计。玲玲白负责分析显微镜下的照片。

确认

这项工作是支持的863项目(2014 aa093501)和国家自然科学基金委青年科学基金项目(81001535)。