文摘

咖啡酸苯乙基酯(角)是一种活性成分的蜂胶有多种潜在的药理作用。尽管我们以前证明蜂胶抗抑郁活性,斗篷的效果在这个活动仍然未知。本研究评估是否治疗角(5、10和20µ摩尔/公斤21天)具有抗抑郁作用对小鼠受到慢性不可预知的压力通过尾部悬吊(TST)和强迫游泳(置)测试。角政府诱导行为与抗抑郁药物的效果一致,就是减少静止浮置板轨道独立于任何影响结核菌素和血清皮质甾酮分泌。西方的屁股,随后的行为进行评估,表明角明显减少糖皮质激素受体磷酸化在S234 (pGR (S234)),导致增加pGR (S220 / S234)比例。pGR之间我们也观察到负相关性(S220) / (S234)和p38增殖蛋白激酶磷酸化p38MAPK,减少了治疗角。这些发现表明,角治疗会产生一个抗抑郁效应的差别通过对这些p38MAPK磷酸化,从而增强GR函数。

1。介绍

抑郁症是最常见的一种,在当今社会严重的心理健康问题。抑郁症的病理生理学是假定涉及功能交替在糖皮质激素受体(GR)信号。临床研究表明,皮质醇过量(hypercortisolism)经常在抑郁症患者中被发现,这归因于不良反馈调节肾上腺皮质(HPA)轴(1,2]。这可能是由于在海马体GR功能受损,下丘脑和脑垂体(3]。符合这一点,人类后期研究表明GR表达(信使rna和蛋白质)在海马体中表达下调自杀受害者儿童期虐待史的(2,4,5]。除了GR表达下降,最近的一项研究报道,GRs的磷酸化状态的改变是参与抑郁症的发病机制。研究白细胞GRs的重度抑郁症患者(MDD)已经表明,增加磷酸化GR在哪里,在较小程度上,在S211导致减少pGR (S211) /(较)比6]。因此,抑郁症的病理生理学也可能受到交替GRs的磷酸化状态的影响。

在我们之前的调查中,蜜蜂的乙醇提取蜂胶有很强的抗抑郁效果在老鼠受到强迫游泳测试(置),提取(i)调制的微分GRs的磷酸化,S220和S234之间,从而增加了pGR (S220) / (S234)比,和(2)恢复cAMP-responsive元素绑定(pCREB)的磷酸化蛋白在S1337]。这些结果暗示GR磷酸化参与蜂胶的抗抑郁活性。蜂胶包含超过200个天然成分,包括茶多酚、酚类醛,sesquiterpene-quinones,香豆素类,氨基酸,脂肪酸,类固醇,无机化合物(8]。其中,咖啡酸苯乙基酯(角)作为代表组件的蜂胶显示药理作用在中枢神经系统9]。例如,斗篷被证明有局灶性脑缺血大鼠的保护作用后(10,11和兔子12]。角也保护培养的小脑颗粒神经元免受glutamate-induced神经毒性(13]。此外,最近的一项研究报道,角直接激活分子(14),与我们之前的研究中发现蜂胶,具有神经保护作用通过脑源性神经营养因子(BDNF),目标基因的分子信号(15]。从这些观察,将为改善角活动通过调制GR信号对抑郁症。

在目前的研究中,研究角的小鼠的抗抑郁效果受到慢性不可预知的压力(CUS)。生化分析也进行调查GR函数通过检测pGR (S220) / (S234)比例三个亚科的增殖蛋白激酶(MAPKs),包括细胞外signal-regulated激酶(erk) c-Jun伴激酶(物),和p38 MAPKs代表的主要信号通路调节GR函数(16,17]。

2。材料和方法

2.1。动物

六个cd -雄性老鼠(韩国首尔的东方有限公司)被安置每笼(5)实验开始前1周在温控(22 - 24°C)的房间里,12 h光/暗周期。喂饲h和20:00之间的灯光在h。小鼠接受至少1周之前适应环境的实验。韩国制度动物保健和使用委员会基本科学研究所(KBSI)审查和批准了本研究(KBSI-AEC 1109)。所有动物程序依法进行“指导护理和使用实验动物”KBSI实验动物资源委员会颁发的。

2.2。压力过程和药物管理局

老鼠受到客户一天两次(上午和下午)连续21天被Ducottet集团略微修改(18]。以下使用压力:2 h克制,24小时照明,24小时食物不足,12 h水不足,2分钟冷游泳(在4°C), 2分钟热游泳(45°C), 24小时湿锯末、0.5 mA足底电击(最大冲击持续时间10 s),反转光/暗周期,1分钟尾夹(从尾巴的尖端1厘米),和12 h笼倾斜。每天CUS、小鼠被随机分配和点压力。

根据我们的初步研究和之前的研究19)的治疗只有角显示则无显著变化行为,小鼠随机分为六组(每组):天真,相应的治疗模型与车辆;车辆(阿明费)组、CUS模型处理车辆(1%二甲基亚砜/玉米油);三个角组、CUS模型处理角(5、10和20μ摩尔/公斤汽车解决方案;σ,圣路易斯,密苏里州,美国)20.- - - - - -22];和氟西汀(FLX)组、CUS模型处理FLX(10毫克/公斤,在生理盐水溶解;由大宇制药、釜山、韩国)。药物和车辆都是腹腔内接种(i.p)卷1毫升/公斤的体重每天9小时。

2.3。强迫游泳测试

浮置板轨道Petit-Demouliere和他的同事所描述的修改(23)是用于这项研究。短暂,老鼠被迫游泳6分钟玻璃烧杯(13厘米直径;高度,19厘米)14厘米的深度装满了第23 - 25°C水。一只老鼠被认为是固定在浮不尝试游泳。6分钟测试会话期间,最后4分钟不动是衡量两个训练有素的观察者盲目治疗。

2.4。尾巴暂停测试

尾巴悬挂测试(TST)是根据先前所描述的方法(24]。总之,每个鼠标悬浮在杆58厘米的边缘在桌面使用胶带放置大约1厘米从尾巴的尖端。一只老鼠被认为是固定在挂被动和完全不动。静止的总持续时间被蒙蔽在6分钟内测量观察者。

2.5。皮质甾酮测定

皮质甾酮测定一直在前面描述的(25]。皮质甾酮血清水平(每组)= 7 - 9测定使用商用酶免疫测定(EIA)工具包(研发系统,Inc .,明尼阿波利斯,美国),根据制造商的指示。

2.6。免疫印迹分析

免疫印迹分析提取的冷冻海马组织(如前所述(执行每组)26]。蛋白质浓度测定用bicinchoninic酸(BCA)蛋白质化验(美国皮尔斯生物技术,罗克福德,IL),和主要的抗体使用特定的GR (1: 1000;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),phospho-GR (S220) (1: 500;细胞信号技术,Inc .,贝弗利,妈,美国),phospho-GR (S234) (1: 500;Abcam,剑桥,英国),p38 MAPK (1: 500;细胞信号技术),phospho-p38 MAPK (Tyr182) (1: 500;圣克鲁斯生物技术)肌动蛋白(1:10000;σ)。检测是通过使用辣根peroxidase-conjugated免疫球蛋白g (1: 5000;圣克鲁斯生物技术)和可视化使用电化学发光(ECL)试验设备(Amersham,小都,白金汉郡,英国)。带强度测定使用ImageJ程序(开源ImageJ软件可用http://rsb.info.nih.gov/ij/)。

2.7。统计分析

数据分析使用单向方差分析(方差分析),其次是沙迪克事后测试,使用棱镜4 (GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)对多组比较。皮尔森相关系数是计算每个pGR (S220) / (S234)比静止时间,p-p38MAPK / p38MAPK比率。统计学意义是水平。结果表示为意味着±标准错误的意思(SEM)。

3所示。结果

3.1。抗抑郁行为角的影响

在实验的开始,角的抗抑郁活性评估小鼠受到CUS通过测量静止时间在置和结核菌素(图1(一))。角的显著影响治疗观察结核菌素(= 4.59,)和事后测试表明,角治疗显著降低静止时间剂量依赖性的方式(图1 (c))。置(= 11.77,),意思是静止的时间治疗组角以剂量依赖性的方式也减少了。氟西汀(10毫克/公斤),用作抗抑郁的活动,积极控制结核菌素显著减少静止时间但不是置。

3.2。角对血清皮质酮水平的影响

尽管在基底皮质甾酮水平显著差异(图中观察组2;= 4.56,),一个CAPE-treated和阿明费组之间不存在差异,表明角治疗慢性压力下不影响皮质甾酮分泌物。皮质酮水平基底CUS组相应的天真组相比均有显著增加。

3.3。角对GR磷酸化的影响

我们之前的研究表明,增强GR函数,通过微分磷酸化S220和S234之间,与蜂胶提取物的抗抑郁活性(7]。因此,我们研究了磷酸化状态S220和S234调查角治疗是否会影响GR功能(27]。免疫印迹分析整个海马pGR溶解产物显示无显著影响(S220) CAPE-treated组(图3(一个);= 1.24,)。相比之下,pGR (S234)显著低于CAPE-treated组相比VEH组(图3 (b);= 3.64,)。因此,pGR的比率(S220) / (S234)显著不同组(= 5.07,CAPE-treated集团),显示比例增加220%相比VEH组(图3 (c))。此外,发现了显著负相关的比率和静止时间之间的结核菌素(图3 (d),= 0.42,)。这表明更高的pGR (S220) / (S234)比例与抗抑郁行为治疗角的影响。

3.4。减少p38 MAPK磷酸化和之间的关系p-p38 MAPK和pGR (S220) / (S234)比例

MAPKs ERK等物,p38MAPK使磷酸化GR,从而调节其转录活性。因此,我们接下来检查激活这三个MAPKs调查可能联想到角的抗抑郁活性。免疫印迹分析显示治疗角没有影响激活ERK1/2和物的小鼠的海马中受到CUS(数据4(一)和4 (b);= 0.85,ERK1/2;= 1.82,JNK1/2)。然而,一个重要的抑制效果为p-p38MAPK被发现(图4 (c);= 15.01,)。ERK1/2、物和p38MAPK表达没有明显不同群体(数据未显示),和相关分析表明p38MAPK激活与抑郁有关的行为(图5(一个);= 0.55,)。此外,强烈的负面p38MAPK激活和pGR之间的线性相关性被发现(S220) / (S234比率(图)5 (b);= 0.41,)。这些数据表明,增强GR功能是参与的抗抑郁活性斗篷的差别通过对这些信号。

4所示。讨论

我们检查了角的抗抑郁效果,这是蜂胶的主要组成部分。我们以前演示了粗蜂胶提取物的抗抑郁性能通过增强GR海马的功能,所反映的增加pGR (S220) / (S234)比7]。与这些结果一致,在本研究发现角减弱抑郁行为浮置板轨道,也增加了TST和pGR (S220) / (S234)比例。此外,我们发现一个角色p38MAPK信号调制的GR函数。具体来说,我们发现磷酸化p38MAPK是负相关的pGR (S220) / (S234)比例与抑郁行为呈正相关。这些发现表明,角恢复通过p38MAPK GR功能,这可能与改善抑郁有关的行为。

我们使用氟西汀作为一个积极的控制cd -小鼠暴露于CUS为了确认我们的动物模型是适合的调查可能的抗抑郁效果。尽管角治疗显著减毒CUS-induced类似抑郁行为置和结核菌素,氟西汀治疗在两个测试结果不一致。置和结核菌素被广泛用作行为屏幕在啮齿动物和敏感和选择性临床有效的抗抑郁药物。然而,微分灵敏度的immobility-reducing影响各种抗抑郁药物,包括剂量反应曲线的特点,曾被报道(28]。例如,在一项研究中,抗抑郁药物丙咪嗪展出一个u型的浮置板轨道但剂量反应函数的线性模式测试活动在同一剂量范围(29日]。因此,我们的浮置板轨道和结核菌素可能解释不一致的结果不同的剂量反应曲线的特征。积极的控制的最佳剂量药物前应确定新型抗抑郁药物的筛选,特别是对置。另一种解释为什么我们没有看到对氟西汀治疗可能是由于不同的鼠标菌株。部分差异可能来自不同的遗传背景不同的菌株,这是至关重要的在确定基线性能和敏感性不同类型的抗抑郁药物。与氟西汀结果一致,Lucki组没有氟西汀对行为的影响在cd -小鼠不动30.]。然而,cd -老鼠时可以有用调查治疗是否具有抗抑郁活性(23]。

它也是有趣的,没有治疗角被认为对皮质甾酮分泌的影响在这项研究中,而在之前的研究蜂胶显著抑制皮质甾酮分泌(7]。一种可能为不同的皮质激素分泌调节之间的差异可能是由于急性和慢性应激模型。更具体地说,在我们之前的研究中我们使用了一个急性应激模型,我们采用慢性应激模型在当前的研究中。符合这一点,众所周知,HPA轴被激活在急性应激反应,抑制的抗抑郁药物治疗(31日]。相比之下,没有明显的激素水平发生变化后的抗抑郁药治疗慢性轻微慢性压力(32,33]。然而,我们不能排除其他组件的蜂胶(CAPE除外)影响皮质甾酮的分泌。

确定角的抗抑郁作用的分子基础,我们研究了肾上腺酮分泌的变化,GR表达,和磷酸化状态的主要影响GR神经生物学因素的函数。人们普遍认为GR障碍涉及抑郁症的发病机理(34]。此外,抗抑郁治疗报道规范化HPA轴活动增加GR表达和功能(35),表明改进的抗抑郁药(GR信号可能代表一个重要的目标36]。按照这种想法,我们先前表明,蜂胶的抗抑郁性能(7)、桑白皮萃取液(25)与增强GR函数通过增加pGR (S232) / (S246)比例。在目前的研究中,我们还观察到增强的GR函数通过角治疗,就是明证pGR (S232) / (S246)增加比例。此外,比例是固定在测试时间呈负相关,表明这一比率可能是一个神经生物学的生物标志物的抗抑郁治疗。然而,有趣的是,皮质甾酮含量没有影响角治疗在目前的研究中,而我们之前研究蜂胶皮质甾酮抑制分泌物。这些结果可以解释为一种机制ligand-independent GR激活,诱导肾上腺素能受体受体激动剂,抗炎行动(37]。在支持这一概念,一些抗抑郁药物已被证明有效的,即使没有恢复改变HPA轴响应率(38]。因此,它可能是有益的调查是否诱发角GR激活没有激素在体外。

许多临床研究表明慢性抗抑郁治疗激活MAPK信号级联(39]在p38MAPK调节GR函数通过三大网站在其N末端(17]。我们目前的研究结果还表明,p38MAPK信号与抗抑郁活性的斗篷,在治疗角减少p38MAPK磷酸化。此外,p38MAPK磷酸化与pGR负相关(S220) / (S234)比率,表明p38MAPK磷酸化的抑制海马可能在GR活动起着关键的作用。然而,我们不能排除其他信号通路参与抗抑郁药物的药理作用,因为积累了大量的数据表明抗抑郁药物激活各种途径包括MAPK [40,41),丝氨酸/ threonine-specific蛋白激酶(一种蛋白激酶,42]),钙/ calmodulin-dependent激酶(CaMK, (43,44]),营反应元件结合蛋白(分子,45- - - - - -47])通路。特别是mRNA和蛋白表达减少ERK1/2通过减少p44/42 MAP激酶活动报道海马的自杀与抑郁症的受害者48]。功能变化ERK1/2信号由慢性氟西汀治疗大鼠中也发现了(49),这表明一个动态调制ERK1/2参与的病理生理学和治疗抑郁的影响。也有趣的相声特有的磷酸化和MAPK级联之间扮演着一个重要的角色在GR函数(25,50- - - - - -52),GR耦合CaMKII-BDNF-CREB通路的激活调解记忆巩固(53]。此外,GR函数的功能障碍会导致改变的敏感性通过CaMK抗抑郁行为信号分子(54),暗示可能GR信号在抑郁症的治疗效果。因此,它很容易推测角治疗可能会如何影响CaMK信号通过GR函数。

总之,本研究首次证明角的抗抑郁活性,这可能是由增强GR函数即循序,p38MAPK信号。虽然需要进一步的研究来确定ligand-independent GR函数的机制,我们的研究表明,可能代表一种新的药理角选择患者神经精神疾病,包括抑郁症。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

首歌她和Insop垫片的构思和设计实验。Mi-Sook李,年轻的汉金,Seung-Hae Kwon,李Bo-ram进行动物实验。Mi-Sook Lee Seung-Hae Kwon,年轻的汉Kim Yun Seon歌曲进行生化实验。盛田昭夫,Kyoji Won-Jin月亮,和李Mi-Sook分析数据。歌,Mi-Sook Lee Kyoji盛田昭夫,Won-Jin月亮写论文。歌她,Mi-Sook Lee Dae Hyun Hahm,年轻的汉金设计的研究。Mi-Sook李和年轻的汉金同样贡献了这项工作。

确认

本研究支持韩国基本科学研究所资助(T34438)和一个博士后奖学金授予庆熙大学在2011年(khu - 20110693)。