文摘

急性淋巴细胞白血病(ALL)是一个不成熟的白细胞的癌症持续过度生产的骨髓。这些细胞排挤正常细胞在骨髓损伤和死亡。氨甲叶酸(简称MTX)为甲酰药物用于治疗各种癌症和自身免疫性疾病。特别是,治疗儿童急性淋巴细胞白血病,它有显著的影响。MTX竞争性抑制二氢叶酸还原酶(DHFR),一种酶,这种酶参与tetrahydrofolate合成抑制嘌呤合成。此外,其下游代谢物甲氨蝶呤polyglutamates (MTX-PGs)抑制thymidylate合成酶(TS)。因此,MTX可以抑制DNA的合成。然而,MTX细胞毒性和神经毒素可能引起多器官损伤,可能是致命的。因此,低毒性药物开发是必要的。最近,疾病治疗与中药(TCM)补充得到越来越多的关注。 In this study, we attempted to discover the compounds with drug-like potential for ALL treatment from the components in TCM. We applied virtual screen and QSAR models based on structure-based and ligand-based studies to identify the potential TCM component compounds. Our results show that the TCM compounds adenosine triphosphate, manninotriose, raffinose, and stachyose could have potential to improve the side effects of MTX for ALL treatment.

1。介绍

二氢叶酸还原酶(DHFR)在细胞代谢和细胞生长至关重要。它催化二氢叶酸的转换成tetrahydrofolate甲基的载体。甲基由tetrahydrofolate从头合成所需品种的重要代谢产物包括氨基酸、脂类、嘧啶和嘌呤。叶酸拮抗剂氨甲叶酸(简称MTX),逮捕DHFR细胞生长有竞争力的绑定,从而阻止核苷酸从头合成的前体,抑制DNA合成(1]。MTX被发现是有用的作为一个抗肿瘤药和免疫抑制物质,因为它会抑制恶性(快速分裂的扩散2]。

MTX DHFR紧密绑定是一种最广泛使用的药物在癌症治疗和特别有效的治疗急性淋巴细胞白血病(3]。此外,它的叶酸类似物广泛用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL) (4],卵巢癌[5),骨肉瘤(6),类风湿性关节炎7],牛皮癣[8),炎症性肠病(9和移植后移植物抗宿主病的预防10]。

在细胞,MTX作用通过抑制两种酶。首先,作为一个模拟的叶酸,MTX是一个强大的竞争性抑制剂与1000倍比DHFR的天然底物更有效。DHFR负责转换二氢叶酸(FH2中)的活性形式tetrahydrofolate (FH4),这是一种基质thymidylate合成酶(TS)。第二,MTX转化为积极的甲氨蝶呤polyglutamates (MTX-PGs) folylpolyglutamate合酶(11,12]。MTX的polyglutamated形式直接抑制TS。由于这些禁忌,细胞无法从头合成嘌呤和thymidylate,从而会抑制DNA合成(13]。

MTX的主要作用是抑制酶DHFR,把二氢叶酸(FH2中)tetrahydrofolate (FH4) [11,14]。MTX-PGs发挥更强的抑制DHFR和TS (15- - - - - -17]。因此,通过直接抑制MTX和由于缺乏FH4 FH2中积累,脱氧胸苷一磷酸合成和嘌呤从头合成受阻,最终导致白血病细胞死亡,骨髓抑制、胃肠道粘膜炎、肝毒性,而且,很少,脱发14,15,18,19]。事实上,MTX和天然的叶酸接受polyglutamylation folylpolyglutamyl合成酶的酶催化。MTX-PGs确保细胞内保留,而且,增加亲和力MTX-sensitive酶(16,18,20.)(图1)。


图1
MTX在DNA合成途径的抑制机制。MTX:甲氨蝶呤;台塑:folylpolyglutamate合成酶;MTX-PGs:甲氨蝶呤polyglutamates;DHFR:二氢叶酸还原酶;TS: thymidylate合成酶;FH4: tetrahydrofolate;FH2中:二氢叶酸;10-methylenetetrahydrofolate Methylene-THF: 5;Methyl-THF: 5-methyltetrahydrofolate; dUMP: deoxyurindine-5′-monophosphate; dTMP: deoxythymidine-5′-monophosphate; MTRR: methionine synthase reductase; SHMT: serine hydroxymethyltransferase.

然而,MTX可能导致急性肾细胞毒性(21]这是严重和致命的后可能出现椎管和神经毒性的管理(22- - - - - -25和血液毒性26)引起的动物体细胞和人类骨髓染色体病变(27)导致造血系统异常(28),胃肠道毒性(29日)使multiorgan功能障碍(30.),肾毒性(31日)使肾功能衰竭(31日,32),和肝毒性肝纤维化(33]。更高浓度的长链MTX-PGs一直在胃肠道和肝脏毒性的风险12,34,35]。因此,低毒性药物开发是必要的。最近,越来越多的不同疾病的机制进行了分析检测有用的靶蛋白疾病治疗(36- - - - - -49),和疾病治疗与中药(TCM)补充得到越来越多的关注。从中药中提取的化合物也显示他们潜在的铅化合物对肿瘤(50- - - - - -54)、中风(55- - - - - -58),病毒感染(59- - - - - -63年),代谢综合征(64年- - - - - -66年)、糖尿病(67年),炎症(62年),和其他疾病(68年,69年]。对于这种趋势,我们试图发现药物样的潜力和低毒性的化合物在中医治疗的组件。

2。材料和方法

2.1。虚拟筛选

受体,人类二氢叶酸还原酶(DHFR)和人类thymidylate合成酶(TS)蛋白质从蛋白质数据银行1下载u72 (PDB ID: 1 u72) (70年)和1 hvy (PDB ID: 1 hvy) (71年]。我们采用中药配方,治疗急性淋巴细胞白血病从数据库“上海中药创新研究中心”(http://www.sirc-tcm.sh.cn/en/index.html)[72年]。这些公式的组件化合物与中医草药数据集成(电子邮件保护)(73年),成为所有针对疾病的化合物库。虚拟筛选的候选人从化合物库进行了使用LigandFit模块下的DS 2.5哈佛大学高分子化学力学(CHARMm)力场。DockScore被选为输出值。候选人排名根据DockScore和药代动力学特征包括吸收、溶解度、血脑屏障(BBB)和血浆蛋白结合含量预测由ADMET协议为每个候选人。

2.2。2 d-quantitative结构活性关系(2 d-qsar)模型

在这项研究中,45候选人(图2)与已知实验pIC50值(74年),抑制活动向DHFR定量构效关系研究(表中使用1)。45已知的抑制剂被随机分为36个候选人的训练集和测试集的9候选人。这些候选人的化学结构是由ChemDraw超10.0(美国CambridgeSoft Inc .)和转换为三维分子模型Chem3D超10.0(美国CambridgeSoft Inc .)。为每个候选分子描述符计算使用DS 2.5计算分子属性模块。遗传函数近似(GFA)模型用于选择代表相关的描述符 生物活性(pIC50)也被用来构造2 d-qsar模型。训练集是用于构造多元线性回归(高)、支持向量机(SVM)和贝叶斯网络(BN)模型。测试集是用来测试这些模型的准确性。

表1
实验pIC50值DHFR抑制剂(40]。

图2
化学结构DHFR抑制剂(40]。
2.2.1。看不到多元线性回归(MLR)模型

多元线性回归(75年]试图模型之间的关系两个或两个以上的解释变量和响应变量的拟合线性方程来解释观察到的资料。该模型是建立方程的形式如下: 在哪里 代表了 th分子描述符和 是它的拟合系数。生成的高钙模型验证与测试数据集。广场的相关系数 训练集的预测和实际pIC50之间被用来验证模型的准确性。这个建筑模型应用于预测的pIC50值中医候选人。

2.2.2。支持向量机(SVM)模型

支持向量机实现分类或回归分析与线性或非线性算法(76年]。该算法识别最大边际仿真区分两类训练样本。样品的边缘被称为支持向量。介绍了拉格朗日乘数法和内核,形成最终的模式分离回归模型。在这项研究中,LibSVM [77年- - - - - -79年)包被选中来构建我们的回归支持向量机模型。选择的内核是高斯径向基函数内核方程:

交叉验证的支持向量机模型也进行了在LibSVM(默认设置后80年]。生成的回归支持向量机模型验证和测试数据集。广场的相关系数 训练集的预测和实际pIC50之间被用来验证模型的准确性。这个建筑模型应用于预测的pIC50值中医候选人。

2.2.3。贝叶斯网络模型

我们使用了贝叶斯网络工具箱(BNT)在Matlab (https://code.google.com/p/bnt)建立贝叶斯网络模型81年由训练数据集]。数据离散化后,我们应用线性回归分析每个pIC50类别的训练数据集。为 th pIC50类别与 候选人,让 和 代表pIC50价值和 描述符的价值 配体,分别。回归模型的数据集 是制定 在哪里 和 和 回归系数和误差项吗 th pIC50类别。我们使用普通最小二乘估计未知的回归系数 :

班卓琴(贝叶斯网络推理与Java对象)是学习软件结构的静态贝叶斯网络(BN) [82年]。它是用Java实现的。我们使用训练数据集发现BN结构之间的关系描述符和班卓琴的pIC50包。之后,我们使用测试数据来评估算法的准确性。的测试数据 ,pIC50类别 预计由以下公式: 在哪里 代表了 th pIC50和类别 代表pIC50类别的总数。边际概率 可以通过BNT计算模块。最后,pIC50值计算如下:

广场相关系数( )之间的预测和实际pIC50训练集是用于验证模型的准确性。这个建筑模型应用于预测的pIC50值中医候选人。

2.3。3 d-quantitative结构活性关系(3 d-qsar)模型

比较分子场分析(CoMFA)和比较分子相似性指数分析(CoMSIA)是由Sybyl-X 1.1.1(优等考试Inc .,圣路易斯,密苏里州,美国)DHFR抑制剂。Lennard-Jones潜力和库仑势了计算空间和静电相互作用的能量。两个3 d-qsar模型被旨在进一步评估相关系数 和non-cross-validated相关系数( )。力场和生物活性之间的关系计算了偏最小二乘(pls)方法。

整个实验过程的流程图中医候选人筛选如图3。


图3
实验流程图。

3所示。结果与讨论

3.1。虚拟筛选

虚拟筛选是由LigandFit模块DS 2.5 CHARMm的力场。受体结合位点被绑定的位置定义MTX DHFR蛋白质和绑定的位置MTX-PGs TS蛋白质。我们图书馆的化合物被停靠到两个受体。在这个协议,受体是固定的,补充的配体结合位点在能量最小化过程灵活。本研究中使用的控制复合MTX含有芳烃和杂环戒指(图中4)。

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图4
(a) (b)的化学支架MTX, MTX-PGs,中医候选人急性淋巴细胞白血病的治疗。

顶部十八DHFR对接结果分数都列在下表中2。十八岁的TS对接得分候选人也列在下表中2。所有十八岁中医候选人码头得分高于控制甲氨蝶呤(MTX)和MTX-PGs。化学支架MTX, MTX-PGs,十八岁中医候选人如图4。吸附、溶解性、肝毒性和血浆蛋白结合的评估评价药代动力学性质选定的候选人(表3)。考虑到肝毒性的因素,我们选择了中药化合物三磷酸腺苷,甘露三糖、棉子糖和水苏糖先进研究。MTX和中医候选人非常可怜的人类肠道吸收。粘结强度的配体结合到载体蛋白血液由血浆蛋白表示绑定(含量值(21]。MTX拥有超过十亿分之90%但三磷酸腺苷,甘露三糖、棉子糖,水苏糖含量小于90%。

表2
DHFR和TS对接中医候选人的分数。
表3
预测中药候选人和MTX的药代动力学特性。

中的交互对接过程中数据所示5和6。MTX停靠在DHFR(图5(一个))通过四氢结合Glu30 Gln35 Lys68, Arg70。Adenosne三磷酸形成三H-bonds Glu30, Gln35, Arg70(图5 (b))。甘露三糖形成与Arg28 H-bond(图5 (c))。棉子糖形成H-bonds Asn64和民主党(图5 (d))。水苏糖形成与Lys63 H-bonds Asn64, Lys68(图5 (e))。MTX-PGs停靠在TS(图5 (f))通过单一H-bond Arg50。Adenosne三磷酸、甘露三糖和水苏糖停靠在TS(数字5 (g),5 (h),5 (j))通过单一H-bond Arg50。棉子糖停靠在TS单一H-bond Met309(图5(我))。

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图5
对接构成MTX和中医治疗的候选人DHFR (a)、(b)、(c), (d)和(e),对接构成MTX-PGs TS (f), (g), (h),(我),(j)。中医候选人青色所示。代数余子式的紫色所示。在H-bond交互,氮原子所示蓝色,氢原子以灰色显示,氧原子所示红色,氢键是红色虚线所示,π键橙实线所示。(一)MTX, (b)和三磷酸腺苷(g), (c)和(h)甘露三糖,(d)和棉子糖(我),(e)和(j)水苏糖,MTX-PGs (f)。
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图6
Ligplot分析DHFR之间的疏水相互作用和中医候选人和TS和中医的候选人。(一)MTX DHFR, (b) (g)和三磷酸腺苷DHFR和TS, (c)和(h)甘露三糖DHFR和TS (d)和(i)棉子糖DHFR和TS (e)和(j)水苏糖DHFR和TS和(f) MTX-PGs DHFR和TS。债券:配位键,nonligand债券,氢键,疏水所示紫色,橙色,橄榄绿色,分别和砖红色。原子:氮、氧、碳和硫所示蓝色,红色,黑色,黄色,分别。

疏水相互作用分析表明,MTX对接在DHFR比中医更稳定的候选人。与中医候选人的化学结构,它可以归因于MTX对接的大DHFR(数字6(一),6 (b),6 (c),6 (d),6 (e))。然而,中医候选人对接TS比MTX-PGs更稳定由于疏水相互作用(数字6 (f),6 (g),6 (h),6(我),6 (j))。

3.2。生物活性预测定量构效关系模型使用

构象模型构造使用已知DHFR抑制剂(40)和申请预测中药配体的分子性质。分子描述符与生物活性包括BD_Count、Num_RotatableBonds CHI_V_1, IAC_Mean, JX,客户至上,SC_3_C, Jurs_FNSA_1, Jurs_RPCS, Jurs_SASA,和Shadow_Xlength用于构造高模型,支持向量机模型和贝叶斯网络模型。

看不到我们的MLR模型如下。

GFATempModel_1 = 31.623 + 2.5173 HBD_Count−0.47471 Num_RotatableBonds−1.7664 CHI_V_1−12.997 IAC_Mean−45.669 JX + 36.62 司法院+ 0.11612 SC_3_C + 18.941 Jurs_FNSA_1−4.8012 Jurs_RPCS + 0.029451 Jurs_SASA−0.084377 Shadow_Xlength。

在CoMFA模型中,空间领域的主要因素。在CoMSIA,各种因素被认为是和建模。最优CoMSIA模型“EHA模式”和“EHDA模型”基础上高 、高 ,和较低的值(表4)。“EHA模式”是由静电场和疏水性和氢键受体。“EHDA模式”是由静电场和疏水性和氢键供体和氢键受体。CoMFA模型和CoMSIA EHDA模型和EHA ONC 7、11和12。

表4
偏最小二乘法(PLS)分析CoMFA和CoMSIA模型。

pIC50实验值与预测值的45 DHFR抑制剂使用CoMFA和CoMSIA模型如表所示5。残差计算从pIC50观测值与预测值之间的差异范围CoMFA−0.3655和0.4311之间,为CoMSIA−0.411和0.589之间“EHA模型”和−0.431和0.569之间CoMSIA与“EHDA模式。”

表5
pIC50实验值与预测值的45 DHFR抑制剂使用构造CoMFA和CoMSIA模型。

预测和实际生物活性之间的相关性为DHFR抑制剂如图7。的 为高值是0.936,0.734为贝叶斯网络,对支持向量机0.884,0.957 CoMFA, CoMSIA EHA模型0.977,0.978 CoMSIA EHDA模型涉及高度相关。高相关系数验证构建CoMFA和CoMSIA模型的可靠性。中医候选人的预测生物活性值2 d-qsar和3 d-qsar模型表中列出6。

表6
预测生物活性MTX和中医治疗(pIC50)候选人使用高钙,贝叶斯,支持向量机,CoMFA和CoMSIA模型。
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图7
观察到的相关性和预测活动(pIC50)使用2 d-qsar模型和3 d-qsar模型。高钙、贝叶斯网络和支持向量机2 d-qsar模型。CoMFA CoMSIA_EHDA, CoMSIA_EHA 3 d-qsar模型。
3.3。轮廓的地图CoMFA和CoMSIA模型

配体MTX和中医治疗活动的候选人可以预测基于3 d-qsar等高线地图,包括特性在空间领域、疏水,和H-bond供体/受体的特征。MTX和中医候选人波状外形的CoMFA图的空间特征8。CoMSIA地图提供了更多的信息关于生物活性差异“EHA模式”和“EHDA模式”的数字9和10,分别。从一致的结果观察3 d-qsar模型验证中,我们推断,三磷酸腺苷,甘露三糖、棉子糖,水苏糖中医候选人DHFR可能具有良好的生物活性。

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图8
DHFR CoMFA等高线地图。(一)MTX, (b)三磷酸腺苷,(c)甘露三糖,(d)棉子糖和水苏糖(e)。绿色和黄色轮廓表示地区支持和不赞成空间领域,分别。蓝色和红色轮廓表示地区支持和不赞成静电领域,分别。
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图9
DHFR EHA CoMSIA等高线地图的模型。(一)MTX, (b)三磷酸腺苷,(c)甘露三糖,(d)棉子糖和水苏糖(e)。蓝色和橙色区域轮廓表示支持和不赞成静电领域,分别。黄色和白色轮廓表示地区支持和不赞成疏水领域,分别。绿色和红色轮廓表示地区支持和不赞成H-bond受体,分别。
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图10
DHFR EHDA CoMSIA等高线地图的模型。(一)MTX, (b)三磷酸腺苷,(c)甘露三糖,(d)棉子糖和水苏糖(e)。蓝色和橙色区域轮廓表示支持和不赞成静电领域,分别。黄色和白色轮廓表示地区支持和不赞成疏水领域,分别。绿色和红色轮廓表示地区支持和不赞成H-bond受体,分别。青色和紫色轮廓表示地区支持和不赞成H-bond捐赠领域,分别。

轮廓立体观察支持和疏水有利于区域为三磷酸腺苷,甘露三糖、棉子糖和水苏糖。与对接构成轮廓(数据一致8,9,10),我们建议这四个中医候选人可能保持生物活性DHFR在动态条件下的生理环境。

4所示。结论

DHFR和TS蛋白质是关键嘌呤和thymidylate监管者的从头合成。Inhibiton这些蛋白质有可能治疗急性淋巴细胞白血病。在这项研究中,我们应用虚拟屏幕定量构效关系模型的基础上,基于结构和ligand-based方法以识别潜在的中药化合物。中药化合物三磷酸腺苷、甘露三糖、棉子糖,水苏糖可以绑定DHFR和TS和肝毒性较低。这些中药化合物有可能改善MTX对所有治疗的副作用。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突有关的出版。

确认

支持的研究是由美国国家科学委员会的台湾(nsc102 - 2632 - e - 468 - 001 - my3 nsc102 - 2325 b039 - 001和nsc102 - 2221 - e - 468 - 027),亚洲大学(101年101 -亚洲- 24日-亚洲- 59,ASIA100-CMU-2,和ASIA101-CMU-2),和中国医科大学医院(dmr dmr - 103 - 001 - 103 - 058,和dmr - 103 - 096)。这项研究还支持部分由台湾卫生部临床试验和研究卓越中心(doh102 - td - b - 111 - 004)和台湾卫生署癌症研究中心卓越(mohw103 - td - b - 111 - 03),和结算的目的顶尖大学教育部计划,台湾。