文摘
在这个工作我们有检查的能力从六个不同的药用植物中提取的精油(尤金尼亚caryophyllata,牛至属植物vulgare,迷迭香属officinalis,薰衣草花officinalis,白千层属灌木alternifolia,胸腺寻常的)抑制18细菌的生长类型属于18株已知物种的伯克不过复杂的(Bcc)。这些细菌是机会主义的人类病原体,可以引起严重的感染在免疫功能低下的患者,特别是那些受囊性纤维化(CF),并经常对多种抗生素耐药。aromatograms由6个油的分析显示,尽管不同的化学成分,它们能够对比Bcc成员的成长。然而,三个人(即尤金尼亚caryophyllata,牛至属植物vulgare,胸腺寻常的)和Bcc菌株尤为活跃,包括那些表现出高度或对环丙沙星的耐药性,治疗Bcc感染最常用的抗生素之一。这三个油也积极对环境和临床菌株(孤立的CF患者),这表明他们可能会用于未来的战斗不过复杂的感染。
1。介绍
精油(EOs)由一个复杂的混合挥发性芳香物质通常由所有植物器官合成次生代谢产物和水或蒸汽蒸馏萃取,溶剂萃取,表达式的压力下,超临界流体,亚临界水萃取(1]。EOs包括两个biosynthetically相关组织,主要是萜烯和萜类化合物,其次,芳香族和脂肪族的选民,他们的特点是低分子量。EOs萜类的生物属性并不阐明但保护植物免受食肉动物和微生物病原体的函数假设,他们可能是重要的植物与其他生物之间的相互作用(例如,传粉者的吸引力)。相同的植物可以产生不同的EOs是否会(即。化学成分)。例如,胸腺寻常的与核型稳定形态相同的物种,包括七个不同是否会取决于精油的主要成分是麝香草酚,香荆芥酚,芳樟醇,香叶醇,桧烯水合物,α松油醇、桉油精。
近年来,细菌抵抗多种抗生素的出现急剧加速。喹诺酮类或氟喹诺酮类原料药、唑和多烯类抗菌剂通常是治疗感染的最后;因此获得抵抗这些抗菌素更高的机会(2]。EOs和其他植物提取物具有抗菌、抗真菌、抗病毒性质和全球已筛选的潜在来源小说抗菌化合物(3]。因此EOs和他们的选民希望可以考虑在未来更多的临床评估和可能的应用程序和为佐剂当前药物(4]。EOs的抗菌性能在一些研究已报告。抗菌活性高胸腺和牛至属植物物种已被归因于他们的百里香酚和香芹酚等酚类组件的尤金尼亚caryophyllus,气味清香植物,罗勒属basilicum丁香酚(1]。事实上,百里香和牛至EOs可以抑制等致病菌株大肠杆菌,肠炎沙门氏菌,沙门氏菌cholerasuis,鼠伤寒沙门氏菌,香芹酚和百里香酚的抑制直接相关5]。精油可以抑制微生物的机制涉及不同的行动模式,在一定程度上可能是由于其疏水性。结果,他们分区进入细胞的脂质双分子层膜,使其更多的渗透,导致泄漏至关重要的细胞内容(6]。有更少的报告机制的作用EOs和对微生物的净化组件组合。包括常见的生化过程的顺序抑制,抑制保护酶,和使用细胞壁增强其他抗菌素的吸收的活性成分。碳氢化合物的能力与细胞膜相互作用促进香芹酚的渗透进入细胞。在许多情况下,活动之间的复杂的相互作用的结果不同种类的化合物如酚类、醛类、酮类、醇类、酯类、醚类、碳氢化合物中发现EOs (1]。很可能会比较困难,对细菌产生耐药性的多组分EOs比常用抗生素往往只有一个分子组成的实体(3]。例如茶树油的多组分性质可以发生自发减少潜在的阻力,因为多个同时突变可能需要克服所有的抗菌的每个组件的行为。这意味着大量的目标必须适应克服石油的影响(7]。
临床研究与EOs稀缺。局部使用是目前最有前途的战略,对皮肤和粘膜。对吸入使用存在一些希望,但临床评估是必要的。没有信息安全与口服EOs,所以增加药物动力学知识,药效学,EOs的潜在毒性由这条路是必需的(3]。
从这个观点特别有趣的是囊性纤维化的治疗感染的可能性(CF)的病人。最重要的一个机会CF病原体由细菌属于表示伯克不过属于非常复杂(Bcc)异构属洋葱目前包括超过七十种,隔绝广泛的领域。许多成员属的感染可引起植物,动物,和人类,大多数研究都集中在这些病原物种由于其临床重要性8]。然而,最近,越来越多的洋葱物种与环境相关的植物或能够固氮,结瘤豆类或促进植物生长,描述(8]。致病性的物种中,bbc细菌,一群遗传学上截然不同的但现在表型相似的细菌,包括18细菌种类密切相关(9,10),被称为人类机会致病菌。虽然他们并不被认为是正常的人类人口的重要病原体,其中一些被认为是严重威胁等特定病人组的CF患者(11]。CF是最致命的遗传性疾病的高加索人(9),患者的发病率和死亡率的主要原因是慢性肺部感染(主要是涉及不同种类的细菌铜绿假单胞菌)、真菌和病毒(12]。关于Bcc物种,慢性感染的患病率(2009和2010)据报道,在0到12%之间的CF人口参加各种CF中心(13]。虽然不高与其他CF病原体,Bcc感染与预后差,延长住院时间,增加了死亡的风险(14]。
的原因之一引起的感染的高的死亡率Bcc物种高耐药性:它们在本质上是对许多抗生素和可以开发在活的有机体内(基本上所有类抗菌药物的耐药性14,15]。这么高的抗生素耐药性的机制对某些类别的抗生素和特定的一种内在的阻力,革兰氏阴性细菌的特点是,由于合作外膜屏障和流出的表达系统(14,16]。耐多药流出系统之间的固有耐药性革兰氏阴性细菌主要是归因于RND (resistance-nodulation-cell分裂蛋白家族)类型药物出口商(17]。这些蛋白质的存在和分布在一些可用洋葱基因组是已知的(18,19),这些系统也被实验的特点(20.- - - - - -23]。
新抗菌药物总是需要抵消Bcc耐药突变体,继续目前的治疗方案选择。细菌耐药性往往导致治疗失败,导致严重的后果,特别是在危重患者(24]。不恰当或不必要的抗生素处方,过度使用抗生素在农业和畜牧产业,而缺乏耐心坚持完整的抗生素治疗,似乎所有这些选择耐药细菌,抗生素耐药性的出现的关键因素。耐药细菌也可能传播,成为更广泛的感染控制问题,不仅在医疗机构,社区内。出于这个原因,迫切需要开发新的抗菌疗法不仅对Bcc细菌,也对其他不同的人类病原体25]。在这种情况下最重要的方法之一是寻找新的天然药物所代表的“不寻常的”来源;特别有趣的可能是精油,因为它们是多组分的,原则上,细菌产生耐药性的可能性的混合物质可能比单个分子小得多。
因此,这项工作的目的是探索六种不同的精油的抗菌活性与小组Bcc细菌,其中一些展示multiresistance不同药物和临床或环境来源,为了检查的可能性使用精油来对抗Bcc CF患者的感染。
2。材料和方法
2.1。菌株和生长条件
菌株用于这项工作表中列出1。他们生长在胰蛋白胨大豆琼脂(TSA, Oxoid公司。,Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Italy) medium at 37°C for two days or in liquid Tryptone Soya Broth (TSB, Oxoid S.p.A., Strada Rivoltana, 20090 Rodano, MI, Italy) medium at 37°C with shaking.
2.2。Aromatograms
2.2.1。微生物悬浮液的制备和媒体
每个菌株生长在液体培养基中37°C (TSB)用颤抖;经济增长以固定时间间隔检查(在OD光谱光度测量的阅读600年),直到结束的指数增长阶段。连续稀释1:10到10−5每个细菌悬液镀在TSA培养皿为了计算微生物,并验证样品的细菌数量是合适的性能测试。
TSA,用于执行琼脂扩散试验、富含适当体积的二甲亚砜(DMSO,卡洛Erba Reagenti公司。6/7,道路Rivoltana公里,20090 Rodano MI,意大利),消毒过滤通过过滤器孔径为0.22μ米(缝匠肌意大利Srl Viale a Casati 4, 20835 Muggio, MB,意大利),从而获得0.5% (v / v)解决方案被DTSA的缩写。添加DMSO,非质子有机溶剂属于亚砜的类别,有促进精油的溶液化的目的在水介质媒体所代表的文化。
2.2.2。准备稀释的精油
在这项研究中使用的精油(尤金尼亚caryophyllata,牛至属植物vulgare,迷迭香属,薰衣草花矮牵牛,白千层属灌木alternifolia和胸腺寻常的)都是用水蒸气蒸馏法提取方法,从相同的零售商(购买装饰Phitocosmetici Dott。Vannucci di Vannucci Daniela e c . Sas通过洛杉矶Cartaia尤文图斯3,59021 Vaiano (PO)、意大利)。所有的EOs和EOs稀释使用前被储存在4°C。
2.2.3。磁盘琼脂扩散试验
洋葱细胞悬浊液DTSA培养皿上飞跑。无菌滤纸磁盘(Oxoid SpA。道路Rivoltana 20090 Rodano MI、意大利)的6毫米直径10湿透了μL每个不稀释EO,放在盘子的表面。此外,积极的和消极的控制应用于琼脂板的表面;他们分别抗生素环丙沙星(3μ克/ 10μ20090 L) (Oxoid公司道路Rivoltana Rodano, MI,意大利)和DMSO溶液无菌去离子水的0.5%。盘子被孵化°C 48 h耗氧。孵化后,抑制区域的直径以毫米,包括磁盘的直径。EOs的敏感性被抑制的直径区域分类如下:不敏感的总直径小于8毫米,敏感的总9-14毫米直径,非常敏感的总直径15 - 19毫米,极其敏感总直径大于20毫米(26]。每个试验在三个独立的实验运行表现一式三份。
2.3。测定植物精油成分
气体cromatographic (GC)分析hp - 5890系列二世来完成仪器配有HP-5毛细管柱(30μm×0.25毫米,0.25μ膜厚度),使用以下温度程序:60°C 10分钟,坡道的5°C /分钟到220°C;注入器和检测器温度,250°C;载气、氮(2毫升/分钟);探测器、双火焰离子化检测(FID);分流比,1:30;注入,0.5μl .执行组件的识别为两列,相比之下他们的保留时间与纯粹真实的样品和通过线性的保留指数(LRI)相对于一系列碳氢化合物。气体chromatography-electron影响质谱(GC-EIMS)分析瓦里安CP 3800气相色谱仪(瓦里安公司帕洛阿尔托,CA)配有DB-5毛细管柱(安捷伦科技惠普(hewlett - packard)、Waldbronn、德国;30米×0.25毫米,涂层厚度0.25毫米)和瓦里安2000年土星离子阱质量检测器。分析条件如下:注射器和传输线温度在250 - 240°C,分别烤箱温度从60到240°C编程3°C /分钟,载气,注射器氦1毫升/分钟,离了。识别的成分是基于比较保留时间与真实的样品,比较LRI相对的系列n碳氢化合物和计算机匹配对商业和自制的质谱由纯物质和组件库的已知样本和文献数据(女士27- - - - - -32]。此外,所有确定的分子量物质经气体chromatography-chemical电离质谱(GC-CIMS),使用甲醇作为化学电离气体。
2.4。统计分析
抑制区Bcc菌株的不同分析了EOs通过使用主成分分析实现过去软件(33]。克鲁斯卡尔-沃利斯检验与Bonferroni错误保护申请比较不同EOs的总体抑制区通过分析它的软件(分析它软件有限公司)。
3所示。结果与讨论
3.1。精油的成分
精油是非常复杂的天然混合物20 - 60组件可以包含不同的浓度。他们的特点是两个或三个主要组件在相当高的浓度(20 - 70%)比其他组件出现在微量。萜类化合物(主要是monoterpenoids和倍半萜类化合物)通常表示主成分但有些精油的特点是芳香(糖类)和脂肪成分的存在,所有低分子量的特征。
精油是商业样品测试和分析了GC使用作为双氢火焰检测器和电子轰击质谱分析。相比,选民被确定的保留时间两列与纯粹真实的样品和通过线性的保留指数(LRI)相对于一系列碳氢化合物和数据从女士自制图书馆质谱和文学。
几乎100%的挥发物的牛至精油,77.2%的含氧单萜,主要由香荆芥酚代表总数的71.8%精油;19.2%的成分是由单萜碳氢化合物,主要是甲基异丙基苯;2.9%是倍半萜烯碳氢化合物,0.6%是含氧倍半萜烯。
还在迷迭香精油的情况下所确定的挥发物99.9%,主要成分是由含氧单萜(64.6%)是主要挥发性1,8-cineole (43.9%)。单萜烃是25.9%,而且主要是后者α蒎烯。倍半萜烯碳氢化合物和含氧9.1%倍半萜烯只有0.3%。
总确定石油99.5%的百里香。这些挥发物在53.7%的单萜烃被47.9%的特征p甲基异丙基苯和含氧单萜45.6%,主要是百里酚(43.1%)。只有0.2%的挥发物是倍半萜烯碳氢化合物。
大约98%的选民确定丁香油和主要代谢物是丁香酚(85%),一个典型的phenylpropanoid,而11.2%的选民被公认为倍半萜烯碳氢化合物β石竹烯的主要分子(9%)。
大约所有(99.1%)的组分m . alternifolia被识别;主要是含氧化合物单萜4-terpineol校长一个(39.9%)。剩下的油主要是由单萜烃(41.4%)γ萜品烯(14.4%)和α萜品烯(8.8%)的主要分子。
3.2。精油的抗菌活性伯克不过复杂的(Bcc)菌株
六种不同的抗菌活性EOs (大肠caryophyllata(Ec),o . vulgare(Ov),r . officinalis(Ro),l .矮牵牛(Lh),m . alternifolia(马),作物(电视))检查versusthe 18 Bcc类型菌株中列出的表1和18个已知Bcc物种的代表;这个小组由株临床或环境的起源。
获得的数据在图1并显示以下。(我)所有18个菌株,从临床和环境起源,展出,虽然在不同程度上对每个六个EOs测试。(2)根据庞塞et al。26),三种精油,Ec,电视,和Ov,表现出很高的抑制能力与所有的Bcc压力测试。事实上,所有的人极其敏感这三个EOs。(3)很有趣的是,这三个EOs给出了抑制光晕远远大于由环丙沙星,这表明它们比这更活跃的抗生素。(iv)其他三个EOs (Ro、Lh和Ma)表现出一定程度的抑制Bcc增长低于由上述三个EOs展出;然而,抑制晕他们生产的相似,在很多情况下大于所表现出的环丙沙星。(v)很明显,临床和环境压力没有表现出不同的敏感性给定EO EOs(或一组),但他们对环丙沙星(表不同的敏感1)。其中的两个,即液化沼气14294 (b . stabilis)和液化沼气18943 (b . dolosa),对抗生素耐药b . cenocepaciaJ2315,代表Bcc模型系统研究的CF患者感染,对环丙沙星表现出较低的敏感度。这三个菌株有临床起源。尽管如此,同样的三个菌株对三个最活跃的EOs非常敏感。(vi)环境Bcc菌株对环丙沙星临床同行相比更敏感。证实了微分灵敏度EOs和环丙沙星主成分分析(图2)。所示biplot向量占环丙沙星的EOs是面向不同的比(C +)。此外,Ov和电视在很大程度上造成的向量微分灵敏度模式,从而确认,最活跃的精油作物和o . vulgare。最后两两比较(克鲁斯卡尔-沃利斯检验)的抑制EOs和环丙沙星(图的模式2)表明,大差异抑制晕不同EOs和环丙沙星的存在,强调观察(表1,图1)六个EOs的抑制能力的差异。
(一)
(b)
4所示。结论
在这个工作我们已经进行了初步分析的六种不同的精油的抑制能力属于菌株的生长不过复杂,其成员是危险的CF患者;的确可以引起严重的职业感染的病人,如囊性纤维化的影响。这个想法依赖于先前的研究结果证明精油能够抑制一些人类病原体的生长,如大肠杆菌,美国肠炎,美国choleraesuis,美国沙门氏菌感染(5]。然而,我们所知,没有什么是已知的对这些化合物的混合物的能力抑制Bcc成员的成长。
为此我们选择了六个不同的精油(大肠caryophyllata,o . vulgare,r, l, m . alternifolia,作物),进行测试与小组中嵌入的类型菌株已知18 Bcc的物种。
六个EOs的构成是完全不同的,但尽管如此,他们都表现出抑制活动与所有18 Bcc菌株,表明一种化合物或(更有可能)不止一个化合物(见下文)出现在每个精油可能干扰Bcc细胞生长。然而,六个精油表现出不同的抑制活性和根据庞塞et al。26他们可能会分裂成两个不同的集群;第一个包括o . vulgare作物和大肠caryophyllata,而另一个嵌入r ., m . alternifolia和l . officinalis(表2)。事实上,Bcc压力非常敏感属于第一组EOs和其他三个敏感。
然而,他们所有的人都能够抑制Bcc菌株的生长;特别有趣的和有趣的发现产生的抑制性晕大部分EOs(更)比那些由环丙沙星,CF感染治疗中使用的抗生素之一。我们完全意识到,对一个给定的药物或复杂的抗菌化合物的混合物可能强烈不同菌株之间也属于相同的细菌物种。然而,在我们看来,这个工作的初步数据报告特别令人鼓舞,因为他们证明使用精油可能代表一种抵御Bcc增长。也很有趣,尽管大量的实验进行这项工作,没有Bcc突变抵抗任何测试的精油都是独立的(数据没有显示)。这代表了一个非常重要的发现,它强烈表明,精油的能力抑制Bcc细胞的生长可能很可能由于石油的同时存在不同的分子(其作用机理仍然未知),可能工作协同的方式来对抗Bcc增长。除此之外,在我们看来,这些化合物的组合不应该作用于一个目标,但在不同的Bcc细胞内的分子靶点。如果是这样,同时块不同的分子靶点应该强烈的活动减少变异的出现的概率能够抵抗精油。如果这种情况下是正确的,这些数据可能铺平了道路的使用精油来对抗Bcc CF患者的感染。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
马可Fondi和艾琳娜佩兰经济支持《先进奖学金(快2012)和“Buzzati-Traverso”基金会奖学金,分别。