文摘

阿尔茨海默病(AD)是一种神经退行性疾病,其特征是进行性记忆丧失和认知障碍。胆碱酯酶抑制剂被广泛用于治疗阿尔茨海默病症状增强中枢胆碱能传播。bioactivity-oriented筛选平台在这项研究中,基于一种修改Ellman的方法和HPLC-QTOF MS技术是快速开发的屏幕上活跃的代理人考察知母知母。60%的乙醇分数从乙酸乙酯提取物表现出最潜在的抗胆碱酯酶活性。15个甾体皂甙被质谱鉴定,标准和文献报告。25个化合物孤立的从活动的一部分。结果表明,化合物的C₆- c₃- c₆骨架可能有疼痛和大餐抑制活动。氧杂蒽酮和苯衍生物表现出没有或很少活动。木酚素显示弱大餐抑制活动。甾体皂苷显示中度或弱疼痛抑制活动。

1。介绍

阿尔茨海默病(AD)是一种进行性神经退行性疾病的中枢神经系统(CNS),表现为存款的异常蛋白质,即淀粉样蛋白(),蛋白质、突触,胆碱能神经元的死亡,和氧化应激1,2]。AD的发病机理仍然未知,虽然神经退化导致显著减少突触神经递质乙酰胆碱的结晶(3,4]。一个有效的策略来减缓恶化的发展广告患者使用抗胆碱酯酶抑制剂。

乙酰胆碱酯酶(疼痛)和butyrylcholinesterase(大餐)构成的胆碱酯酶。疼痛水解乙酰胆碱(ACh),主要是与神经和肌肉,通常发现在突触。疼痛抑制剂被广泛用于广告,加强中央的症状治疗胆碱能传播。大餐水解butyrylcholine(书)和由肝脏合成,被发现在血清中浓度(5]。在健康的大脑,疼痛水解多数ACh虽然大餐中起次要作用。然而,随着广告的发展,大餐可以弥补疼疼的活动时疼痛抑制剂所抑制。因此,大餐水解已经耗尽的ACh在这些病人6]。已经提出,个人活动大餐可以维持较低的认知功能比个体与正常大餐活动。此外,大餐抑制剂已报告产生显著增加大脑细胞外疼痛而不会引发严重的边缘或中心的副作用(7]。

考察知母知母,属于百合科,广泛分布在中国8]。的根状茎考察知母已报告知母的胆碱酯酶抑制活性与治疗相关的广告(9]。为了找到一种药物治疗的候选广告,活动的分数和化合物化验。中生物活性成分的筛选和鉴定中药(中药)的钥匙是中药的发展(10,11]。然而,中药的复杂性和可变性的识别结构提出了挑战。现在越来越多的注意力已经被吸引到bioactivity-based质/女士识别技术由于其高效和高特异性(12,13]。

在这项工作中,我们使用一个bioactivity-oriented筛选策略,基于Ellman修改的方法和高效液相色谱quadrupole-time-of-flight质谱仪(HPLC-QTOF MS)技术。60%的乙醇分数从乙酸乙酯提取物显示最潜在的抗胆碱酯酶活性。15甾体皂甙被质谱鉴定,标准和文献报告。25个化合物孤立的从活动的一部分。与C化合物₆- c₃- c₆骨架可能有疼痛和大餐抑制活动。氧杂蒽酮和苯衍生物表现出没有或很少活动。木酚素显示弱大餐抑制活动。甾体皂苷显示中度或弱疼痛抑制活动。

2。材料和方法

2.1。植物材料

的根状茎考察知母从北京同仁堂药店购买。Jincai教授发现的植物材料,传统中药学、沈阳药科大学。

2.2。通用仪器设备

高效液相色谱系统(美国安捷伦)G1276A泵由一个模型,模型G1367B Autosampler和模型G1316A紫外检测器。色谱仪是配备一个优雅Alltima反相C18柱(250毫米×4.6毫米,5μ德国米)。QTOF-MS系统(力量)用ESI源。高效液相色谱法分离进行了日立655 - 15系列泵系统配备了日立l - 2490示差折光检测器使用YMC-Park ODS-A列(250×10毫米。D, S-5μm, 12海里)。核磁共振光谱进行力量arx - 300, arx - 400和arx - 600光谱仪使用三甲基氯硅烷作为内部标准。柱层析法进行200 - 300目硅胶(青岛海洋化工工厂,中华人民共和国)。柱层析法进行使用YMC ODS-A凝胶(12海里s - 75μ米,YMC有限公司、日本)和d - 101大孔吸附树脂(上海华凌树脂厂、中华人民共和国)。薄层色谱进行预镀硅胶的女朋友_254年盘子(青岛海洋化工工厂,中华人民共和国)。标仪(Thermofisher科学、芬兰)被用来测试活动。Acetylthiocholine碘,碘化S-butyrylthiocholine、疼痛和大餐从σ公司购买。

2.3。提取过程

根状茎干的考察知母被粉碎机粉成均匀大小知母然后已筛(60目)。材料是由三种不同的提取技术(超声、加热回流和冷浸技术)。各种溶剂包括石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇和水被用于准备活动分数。准确的5.0 g考察知母粉末知母加权成十厄伦美厄烧瓶内包含单独提到十溶剂500毫升,然后用超声波协助提取方法(每30分钟)的两倍。过滤后,滤液合并,蒸发干燥,旋转蒸发器(50°C)。热回流,5.0克的粉浸泡在不同溶剂的50毫升每30分钟。然后,在水浴加热回流提取实验(90°C) 2 h。解决方案被过滤时仍然是热的。拔牙进行了三次和滤液蒸发干燥。最后,5.0 g的粉末是准确称重和浸泡在500毫升溶剂在一夜之间,然后蒸发干燥的滤液。

2.4。疼痛和大餐抑制试验

胆碱酯酶抑制活性评估使用Ellman的修改方法。对于疼痛抑制试验,反应混合物由50μL(100毫米PBS, pH值8.0,25岁μL(15毫米acetylthiocholine碘,25岁μL的代理(1毫克/毫升提取物、化合物0.1毫克/毫升)96孔板。混合物在4°C preincubated 10分钟,在那之后,25岁μL的疼痛(0.226 U /毫升)和125年μ添加了DTNB L(3毫米。37°C的反应是保持20分钟,然后扫描标在412海里。大餐抑制试验,一切程序都是相同的除了底物和酶的使用,和碘化S-butyrylthiocholine大餐分别使用,(14]。所有的实验至少重复三次。

2.5。活动部分的结构特征和识别

乙酸乙酯提取超声处理的方法应用到一个d - 101大孔树脂柱和筛选了用乙醇和水为0%,20%,40%,60%,80%,95%乙醇分数。活跃的组成部分被HPLC-QTOF-MS化验。高效液相色谱系统(美国安捷伦)G1276A泵由一个模型,一个模型G1367B Autosampler,和一个模型G1316A紫外检测器。色谱仪是配备一个优雅Alltima反相C18柱(250毫米×4.6毫米,5μ米)与流动相梯度筛选了。移动阶段水0.1%的甲酸(A)和乙腈(B),使用的梯度是如下:0分钟,5% B;清廉,5%到15%的B;10 - 18分钟,15%到20%的B;18 - 23分钟,20%到23%的B;23-30 min, 23%到25%的B;30-48 min, 25%到30%的B;48-55 min, 30%到50%的B;55 - 80分钟,50%到100%的b注入体积的样品是5μl .流量为0.8毫升分钟⁻¹和列温度环境温度。QTOF-MS系统(力量、德国)用ESI源进行积极的模式。电喷雾质谱的参数设置如下:毛细管电压(+ 3800 V),喷雾器气体压力(1.2条),干燥的气体流速(8.0 L min⁻¹)和温度(180°C)。女士条件修正通过直接注入甲酸钠溶液(1毫米L⁻¹)由一个注射器泵流量的3L敏⁻¹。3.4数据分析力量Daltonics数据分析软件。

2.6。分离和纯化的化合物考察知母知母

的提取考察知母(400.0 g)受到知母CC (d - 101大孔吸附树脂;梯度EtOH /小时₂O 0: 100 - 95: 5)购买六个分数(Frs。一个- - - - - -F)。Fr。D(62.0 g)受到了CC(硅胶;CH₂Cl₂/甲醇100:0 0:100)和提供五个分数(Frs D.1。- - - - - -D.5)。Fr。D.2(5.2 g)受到了CC(反相C₁₈硅胶;甲醇/小时₂O 30: 70 - 100: 0)负担三个分数(Frs。D.2.1- - - - - -D.2.3)。Fr。D.2.2(0.7克)与甲醇进一步纯化,rp / H₂O为流动相(85:15)化合物13来15。Fr。D.3(2.3 g)受到了CC(交联葡聚糖LH-20;甲醇),然后提纯,rp与甲醇/ H₂O为流动相(80:10)化合物1来7。Fr。D.4(21.0 g)受到了CC(反相C₁₈硅胶;甲醇/小时₂O 30: 70 - 100: 0)和提供四个分数。Fr。D.4.2(3.3 g)受到了CC(交联葡聚糖LH-20;甲醇),然后提纯,rp与甲醇/ H₂O为流动相(50:50)化合物8来12。Fr。D.4.4(9.7 g)受到了CC(硅胶;CH₂Cl₂/甲醇30:70 - 100:0),然后用甲醇提纯,rp / H₂O为流动相(70:30)化合物16来25。隔离程序考察知母如图1。

2.7。统计分析

数据表示为意味着±S8EM由单向方差分析和统计分析,其次是事后(LSD)测试。结果被认为是具有统计学意义价值。

3所示。结果

3.1。提取的活动

筛选的提取考察知母知母处理三种不同的技术和十种溶剂显示所有的提取证明没有疼痛抑制活动但展出大餐抑制活动。提取处理二氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮比其他人有更多的抑制率。超声波法和冷浸法优于热回流法。结果发现,考察知母知母中提取与乙酸乙酯的超声波技术最潜在的抗胆碱酯酶活性。测试结果的影响提取物对疼痛和大餐抑制活动总结表1。

3.2。筛选活跃的分数

超声波法提取处理乙酸乙酯的应用d - 101大孔树脂柱,筛选了用乙醇和水为0%,20%,40%,60%,80%,95%乙醇分数。然后他们测试在疼痛和大餐抑制活动。它表明,提取被划分为六个分数和活性化合物被集中到60%乙醇分数。结果总结在图2。多奈哌齐是作为积极的药物的抑制率为98.2%和79.8%。

3.3。活跃的结构特征和识别分数

20%,40%,60%,80%,95%乙醇分数被HPLC-QTOF-MS技术分析。水分数并不缺乏测试的活动。五个分数的总离子色谱图如图3。总结如表2,总共十五皂甙60%乙醇比例的确定和初步特征。

获取信息前体离子和特征碎片离子的化合物,六个真实标准注入质系统。这些真实的分裂模式标准在下面详细讨论。光谱女士的真实的标准如图4。

Timosaponin BII产生一个前体离子[M + Na]⁺在/943.4872 (C₄₅H_76年O₁₉Na)。的位置是一个活跃的网站,它很容易消除22-hydroxyl残渣产生热降解离子[M + H - H₂O)⁺在/903.4982 (C₄₅H_75年O₁₈),它可以生成一个离子/741.4468 [M + H - H₂O - 162]⁺通过进一步中性丢失C26葡萄糖基的位置。同时,该产品在579.3934 [M + H - H离子₂O - 2×162]⁺和417.3251 [M + H - H₂O - 3×162)⁺连续亏损,这与骨架残留的终端己糖,也可以清楚地观察到。此外,碎片离子/273.2139 (417.3251 - C₈H₁₆O₂]⁺是归因于一个骨架残留的乳沟C20-C22和C17-C20债券由于存在16日22-epoxy残渣和22日26-epoxy残渣,然后离子继续失去H₂O产生离子/255.2030 [273.2139 - H₂O)⁺。主要提出破碎timosaponin BII呈现在图5。

Timosaponin BIII了[M + H]⁺离子在/903.4941和一个[M + Na)⁺离子在/925.4793,对应于一个元素组合C₄₅H_74年O₁₈。连续亏损的一个半乳糖和两个glucosyls质子化了的离子导致产品离子/741.4482 [M + H - 162]⁺579.3948 [M + H - 2×162)⁺和417.3240 [M + H - 3×162)⁺。此外,发现碎片离子/273.2143 (417.3240 - C₈H₁₆O₂]⁺和255.2040 (273.2143 - H₂O)⁺是来自土星和H的连续消除₂O。

Timosaponin G产生一个前体离子[M + Na]⁺在/779.4194。它显示一系列的碎片离子/595.3933 [M + H - 162]⁺433.3368 [M + H - 2×162)⁺和415.3244 [M + H - H₂O - 2×162]⁺,这可能归因于损失glucosyl之一,半乳糖,H₂O从[M + H]⁺(/757.4351)。碎片离子[415.3244 - 273.2127 C₈H₁₄O₂]⁺和255.2000 (273.2127 - H₂O)⁺是由土星和H的连续消除₂O。

毛皮皂素我取得了钠的加合物离子[M + Na]⁺在/781.4350,对应其分子式为C₃₉H_66年O₁₄。的主要碎片离子/741.4505 [M + H - H₂O)⁺579.3817 [M + H - H₂O - 162]⁺417.3410 [M + H - H₂O - 2×162]⁺和399.2059 [M + H - 2×H₂O - 2×162]⁺直接从母公司离子产生,可以归因于H的损失₂啊,一个glucosyl,半乳糖,H₂o .同样,碎片离子/271.1636 (417.3410 - C₈H₁₈O₂]⁺和253.1493 (271.1636 - H₂O)⁺也被女儿连续消除离子由父离子的土星和H₂O。

Timosaponin哎显示一系列碎片离子/579.3969 [M + H - 162]⁺417.3389 [M + H - 2×162)⁺和399.3294 [M + H - H₂O - 2×162]⁺可以归因于一glucosyl损失,半乳糖,和H₂从741.4406 O (M + H)⁺。特征碎片离子/273.2230 (417.3389 - C₈H₁₆O₂]⁺和255.2105 (273.2230 - H₂O)⁺因连续亏损的土星和H₂o . Timosaponin AIV有相同的公式和类似的分裂行为Timosaponin哎。

基于精确的质量,真正的标准,碎片离子,保留时间,和结构在文献[15- - - - - -24),15个化合物的结构(图6从60%乙醇分数(图)7)推导出如下。

峰1提出[M + Na)⁺离子质量的准确性/959.4833。分子质量16岁Da重比timosaponin BII。它产生碎片离子/919年[M + H - H₂O)⁺757 [M + H - H₂O - 162]⁺595 [M + H - H₂O - 2×162]⁺433 [M + H - H₂O - 3×162)⁺415年,[M + H - 2×H₂O - 3×162)⁺,由于H的连续亏损₂啊,半乳糖,两个glucosyls, H₂o .此外,这是值得注意的碎片离子/271 (415 - C₈H₁₆O₂]⁺和253年[271 - H₂O)⁺来自土星的连续消除和H₂O在MS / MS谱观察。建议一个羟基取代基在C2位置。碎片离子和保留时间的基础上,初步确认是timosaponin N。

2,峰值主要碎片离子/901年[M + H - H₂O)⁺739 [M + H - H₂O - 162]⁺577 [M + H - H₂O - 2×162]⁺415 [M + H - H₂O - 3×162)⁺,273 [415 - C₈H₁₄O₂]⁺,255 [273 - H₂O)⁺,可以归因于H的损失₂C O,三个hexosyl残留,一个公式₈H₁₄O_2,和H₂从离子[M + Na] O⁺(/941.4726)。这件有一个双键,C27位置(8]。2被确认为timosaponin M达到顶峰。

峰3绝对是确定为timosaponin BII相比,一个真正的标准。前体离子[M + Na]⁺在/943.4886基本高峰ESI实验。山峰4和图5显示相同的公式和类似的碎片离子峰3。基于C甾体皂苷的色谱行为₁₈4列,峰值被初步确认为C25R立体异构体的timosaponin BII。而峰5被确认为25 s-officinalisnin-i或其同分异构体(8]。

第七峰,峰,峰8被确定为timosaponin BIII, timosaponin G,毛皮皂素我相比,真实的标准。

峰9显示[M + Na]⁺(/779.4189)和[M + H - H₂O)⁺(/739.4244)离子。碎片离子在/577年[M + H - H₂O - 162]⁺415 [M + H - H₂O - 2×162]⁺,273 [415 - C₈H₁₄O₂]⁺,255 [273 - H₂O)⁺生产,对应的中性损失一个glucosyl,半乳糖,土星,和H₂o .初步确定为异构体timosaponin G。

峰值10提出[M + Na]⁺离子质量的准确性/779.4184。除了脱水产品离子/739 [M + H−H₂O)⁺产品离子,一系列的特征/595 [M + H - 162]⁺433 [M + H - 2×162)⁺415 [M + H - H₂O - 2×162]⁺,271 [415 - C₈H₁₆O₂]⁺,253 [271 - H₂O)⁺也观察到。这是初步确定为25 (27)ene -毛皮皂素。

峰值计算11 C₃₉H_64年O₁₄基于精确的质量测量[M + Na]⁺(/779.4187)。离子在/757年[M + H]⁺595 [M + H - 162]⁺433 [M + H - 2×162)⁺415 [M + H - H₂O - 2×162]⁺,271 [415 - C₈H₁₆O₂]⁺,253 [271 - H₂O)⁺表示一个羟基糖苷配基的取代基。这是初步确认为timosaponin₂。

山峰12和13被确定为timosaponin AIV和timosaponin哎真实的标准。峰14了钠的加合物离子[M + Na]⁺在/763.4237。它显示一系列的碎片离子/579 [M + H - 162]⁺417 [M + H - 2×162)⁺273 [417 - C8H16O2]⁺,255 [273 - H2O]⁺。甾体皂苷的保留时间与25 r配置比那些长25 s配置。峰14初步确认为25 r-timosaponin哎。

峰15显示[M + H]⁺离子在/579.3892 (C₃₃H₅₅O₈),162达不到timosaponin哎。产品离子等/417 [M + H - 162]⁺399 [M + H - H₂O - 162]⁺,273 [417 - C₈H₁₆O₂]⁺,255 [273 - H₂O)⁺能找到MS / MS谱。从这个峰值15被确认为timosaponin -ⅰ。

3.4。分离和纯化的化合物考察知母知母

25个化合物得到多次隔离和净化。光谱分析的基础上,¹H核磁共振,¹³C NMR, DEPT135 HSQC、HMBC NOESY谱)和与之前报道的光谱数据相比25- - - - - -34),这些化合物的结构如图8。所有的隔离受到乙酰胆碱酯酶抑制活性试验(表3)。

4所示。讨论

抗胆碱酯酶活动的代理测试在一个已知的浓度。这是其中一个方法研究阿尔茨海默病的治疗效果。抗胆碱酯酶抑制率的经纪人表示为抑制率百分比是基于光学密度。疼痛的条件和大餐抑制性试验经一系列的文献和实验报告。

确定哪些部分具有抗胆碱酯酶活性,粉末考察知母是由一系列分离进一步抽取,用不同的溶剂和技术。研究结果显示,更多的生物活性成分会被二氯甲烷提取,乙酸乙酯和丙酮。超声波的提取处理和冷浸法抑制率高于热回流提取处理的方法。它提出了有效成分的分子结构可能会毁在一个较高的温度。

乙酸乙酯提取的影响超声提取的方法对抑制胆碱酯酶的活性比其他溶剂和处理的方法。的乙酸乙酯粗提物考察知母也可能包含许多化合物与不同的极性,所以它是由一个d - 101大孔树脂分离进一步列。60%的乙醇的生物活性化合物由HPLC-QTOF-MS系统部分进行了分析。

化合物的类型女士的60%乙醇分数可以推导出数据。如果离子[M + Na]⁺和[M + H−H₂O)⁺检测和[M + H]⁺离子没有观察到,皂素是furostanol皂素的羟基。如果离子/417年、255年和273年被发现,不应该有取代基sarsasaponin附加。如果离子/433年至415年观测到的,应该有一个羟基取代基糖苷配基。皂甙的保留时间会受数量的影响,订单类和连接的糖和半个羟基的数量和位置取代基糖苷配基。更重要的是,甾体皂苷的保留时间与25 r配置是超过25的年代配置C18柱。

25个化合物孤立的从活动的一部分。的结构活性关系结果的基础上探讨了胆碱酯酶抑制活性。它表明,化合物的C₆- c₃- c₆骨架可能有疼痛和大餐抑制活动。复合3显示潜在的抑制activitity大餐的抑制率为75.8%。氧杂蒽酮和苯衍生物表现出没有或很少活动。木酚素显示弱大餐抑制活动。甾体皂苷有中度或弱疼痛抑制活动。应该是哦组添加到甾体皂苷可能增加的影响。尽管一些个人的化合物表现出的潜力在体外活动,他们效果低于60%的乙醇分数,这可能是由于协同行动中活性成分或者最活跃的成分没有被美国孤立。

甾体皂甙被视为潜在的药物预防和治疗神经退行性疾病,如阿尔茨海默氏症。然而,我们发现,化合物的C₆- c₃- c₆骨架可能有疼痛和大餐抑制活动,尤其是复合3。该活动在活的有机体内在未来需要测试。

5。结论

疼痛和大餐抑制活动考察知母知母中提取与三种不同技术和十种溶剂进行了研究。考察知母知母中提取与乙酸乙酯的超声波技术最潜在的抗胆碱酯酶活性。提取后被划分为六个分数应用d - 101大孔树脂柱,和活跃的化合物被集中到60%乙醇分数。十五大主峰之一的这个分数是基于HPLC-QTOF-MS特征识别和初步技术,标准和文献报告。25化合物从60%乙醇分数获得多次隔离和净化。的结构活性关系结果的基础上探讨了胆碱酯酶抑制活性。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢金融支持从中国自然科学基金(81373925),“辽宁白钱Wan人才计划”(2011921044),辽宁科学技术委员会社会发展项目(2011404012 - 3),辽宁省博士科研启动基金(20111139)、沈阳科技项目局(f12 - 161 - 9 - 00),教育部的创新研究团队项目,并在大学辽宁创新研究团队项目。

补充材料