文摘
背景。Shen-Fu注入(SFI)心脏骤停后展品神经效应,但它对神经系统功能障碍的影响还不清楚。本研究试图探讨SFI对神经细胞的保护作用在猪的心脏骤停模型。方法。八分钟后未经处理的心室颤动(VF)和基本生命支持的2分钟,24头猪被随机分为三个心肺复苏组,接受中央静脉注射Shen-Fu (SFI组;1.0毫升/公斤)、肾上腺素(EP组;0.02毫克/公斤),或生理盐水(SA组)。幸存的头猪被牺牲的ROSC和大脑被移除后24 h分析形态学改变线粒体的电子显微镜,对线粒体跨膜电位(MTP)通过流式细胞术和线粒体渗透性转换孔开放注射(MPTP药物)线粒体光散射。结果。与EP和SA组相比,SFI注射治疗减少开放MPTP药物,显示MMP的更高。此外,动物对待SFI显示轻微脑电镜下超微结构损伤。结论。Shen-Fu注入减轻脑损伤,改善神经超微结构,稳定的膜电位,注射抑制开放MPTP药物。因此,你以后可能大大减弱postresuscitation调节线粒体功能障碍脑缺血和再灌注损伤的神经细胞。
1。介绍
不到10%的住院患者成功复苏后心脏按压心脏骤停(OHCA)将离开医院主要神经障碍(1]。三分之二的患者心肺复苏(CPR)成功之后,即使积极治疗,将难以避免神经系统后遗症,包括postanoxic植物人和延迟死亡2]。虽然轻度体温过低是唯一有效的治疗方法,临床和动物实验证实,它能改善神经系统的结果在心脏骤停患者昏迷3]。到目前为止,越来越多的研究关注postresuscitation脑损伤后神经保护治疗和临床证据表明,早期药物治疗可以改善神经功能和生存出院后从心肺复苏4]。
心脏骤停(CA)导致全身缺血再灌注损伤和代表最严重休克状态,在此期间交付氧气突然停止了。神经系统缺氧缺血敏感。完成大脑缺氧发生后5分钟CA。神经元的能量将被耗尽,代谢产物积累在细胞和细胞膜泵功能的失衡。然后细胞体内平衡是严重受损,随后会导致脑细胞坏死。尽管复苏需要与富氧的血液再灌注缺血组织恢复有氧代谢和器官功能,再灌注与此同时激活多个致病机制,统称为“再灌注损伤。”的中心再灌注损伤线粒体,发挥重要作用的效果器和目标损伤(5]。线粒体功能障碍被认为是关键因素对在脑缺血损伤的程度。线粒体功能受损导致ATP生产、减少受损钙缓冲和活性氧(过度生产6]。
Shen-Fu注入(SFI)是一个著名的中国传统草药含有人参和乌头提取并在中国常用的近800年7]。Shen-Fu注射是一种典型的SFI为静脉药物煎煮,其主要组件包括人参皂苷(0.8毫克/毫升)和乌头碱(0.1毫克/毫升)7]。其质量控制严格按照中国卫生部的标准,采用和指纹技术在生产过程中,以确保其质量。SFI基于乌头碱的影响特性,辅以人参皂苷,可增加心率和心肌收缩性,促进降低血压。附子中去甲肾上腺素salsolinol,对p受体和兴奋性的影响α肾上腺素能受体,这可以大大增加脑血流量,改善平均动脉压(MAP) (8]。SFI一直是临床上用于治疗多种疾病,包括冠状动脉扩张,冲击,改善心脏功能(9,10]。先前的研究证明,你以后在postresuscitation肺保护作用和调节细胞凋亡心肌损伤(7,11]。我们先前的实验表明,SFI减少脑损伤在猪的CA模型,这可能与抑制炎症反应,降低ROSC后的脑水肿。此外,据报道,SFI脑缺血后神经大鼠(12]。
然而,负责你的神经保护作用机制不清楚。因此,在目前的研究中,我们使用一个猪的心脏骤停模型探讨postresuscitation线粒体机制和SFI猪神经细胞的保护作用。
2。方法
2.1。动物的准备
2.1.1。实验动物
三十近交五指山小型猪(12 - 14个月大的时候,公斤),购自中国农业科学院(许可证号码:SYXK(北京),2008 - 0007年),被用于这项研究。实验动物的使用符合首都医科大学实验动物使用规定和研究是在收到批准后进行首都医科大学动物保健委员会(牌照号码:2010 - d - 013)。
2.1.2。动物分组
三十头猪被随机分为四组:(1)Shen-Fu注射组(SFI,):CA 8分钟,中央静脉注射Shen-Fu注入(1.0毫升/公斤);(2)肾上腺素组(EP,):CA 8分钟,中央静脉注射肾上腺素(0.02毫克/公斤);(3)生理盐水组(SA)):CA 8分钟,中央静脉注射生理盐水(SA);(4)虚假的操作组(骗局,)。相同的程序没有CA开始实现虚假的操作组,包括诱导麻醉,电极定位,机械呼吸,和生理参数的监测。
2.2。动物模型的补偿和干预
2.2.1。术前准备
这些动物禁食过夜,但可以免费获得水。咪达唑仑的麻醉诱导了肌内注射氯胺酮(0.5毫克/公斤),紧随其后的是注射异丙酚(1.0毫克/公斤)到耳静脉注射戊巴比妥(8毫克/公斤/ h)维持麻醉。铐6.5毫米气管内管是先进到气管和动物在交织通风机机械通风(伺服900 c;西门子,柏林,德国),使用一个潮汐卷10毫升/公斤,12个/分钟的呼吸频率在室内空气。End-tidal PCO2采用直列式红外监控capnography (CO2SMO加上呼吸监测;美国宾夕法尼亚州Respironics Inc . Murrysville)。呼吸频率调整维护end-tidal PCO235 - 40毫米汞柱在VF诱导。
2.2.2。动静脉导管插入术
左股动脉被隔离层后,Swan-Ganz导管(7 f;爱德华生命科学,欧文,CA)是先进的左股静脉和肺动脉血流导引以测量心输出量(CO)。地图测量的充满液体的导管从左股动脉入胸主动脉。6 f压导管插入到右股动脉测量地图。5 f导管踱步提出从右侧颈内静脉进入右心室,引起心室颤动(VF)。心电图及血流动力学参数监测病人监护系统(M1165;惠普,帕洛阿尔托,CA)。
2.2.3。诱导的心室纤维性颤动
手术后,动物们被允许平衡休息30分钟达到一个稳定的水平。临时起搏器导线插入到右心室通过正确的隔热管和连接到一个电刺激器(gy - 600 a;开封华南设备有限公司有限公司,中国)编程S1S2模式(300/200 ms), 40 V, 8: 1的比例,10 ms步长直到VF提供持续不断的电刺激。VF被定义为心电图显示波形对应VF和平均主动脉压力快速下降(MAP)对0。通风是停止而诱导VF [8]。
2.2.4。心肺复苏术
VF 8分钟后,手动CPR是100每分钟按压的频率FiO机械通风2100%和30的compression-to-ventilation比率:2。胸外按压的质量控制由HeartStart MRx监控/除颤器Q-CPR(飞利浦医疗系统、最好、荷兰)。后2分钟的心肺复苏,猪被随机分为3组,然后收到中央静脉注射Shen-Fu注射(1.0毫升/公斤)、肾上腺素(0.02毫克/公斤),和盐。如果没有恢复自然循环,去纤颤状态进行一次复相的150 J。如果仍然没有实现自然循环,心肺复苏再持续了2分钟,直到ROSC再次去颤了。ROSC被定义为连续10分钟的维护50毫米汞柱的收缩压(13]。如果不是自发循环恢复不到30分钟,我们认为动物死亡。
2.2.5。治疗前后ROSC
头猪被注入生理盐水(10毫升/公斤·h)在操作和由盐水,5%葡萄糖,并根据术后术后氯化钠注射液中心静脉压(CVP)和尿液体积,所需的液体,此外,氯化钾3 - 5 g的生理需求,随着规模维持在5 - 12毫米汞柱。ROSC在6小时后,没有任何麻醉和镇静药物,通风机被猪和猪放在饲养笼。室温保持在20到24°C在实验的过程中。
动物安乐死有10毫升10 mol / L氯化钾静脉注射后的丸100毫克的异丙酚静脉注射在复苏后24小时。
2.3。测量
血流动力学参数包括心率、有限公司连续测量和地图。我们记录了在基线值;30分钟;和1,2,4,6 h ROSC之后。
一些大脑标本被分析通过透射电子显微镜超微结构,线粒体跨膜电位(MTP)流式细胞术,开放的线粒体渗透性转换孔注射(MPTP药物)线粒体光散射。
2.4。神经赤字分数(NDS)和脑性能类别(CPC)的分数
所有猪党和NDS是用来评估初步复苏后神经功能在24小时。中国共产党评价量表评估神经功能(由一个514]。NDS的意识水平、呼吸模式,脑神经功能,感觉和运动功能。
2.5。检测脑线粒体的功能
2.5.1。隔离的线粒体
从猪脑组织线粒体分离。在5毫升的脑组织被剁碎冰冰冷的绝缘介质,然后手动使用玻璃均质机均质。此后,匀浆加入15毫升的冰冷的绝缘介质和离心机在4°C 1500×g 4分钟。离心后,上清液过滤使用粗棉布和离心机在4°C 10000×g 10分钟。线粒体蛋白质决心采用BCA法。
2.5.2。线粒体膜电位的检测(MMP)
90年μL GENMED染色溶液含有染色溶液(试剂B)和稀释(试剂C)到每个洞96 -孔板;然后10μL纯化的线粒体样本补充道,轻轻动了一下,并放置在黑暗的房间里。线粒体被留给孵化在黑暗中在室温下10分钟。孵化后,样品的荧光立即分析荧光光谱仪(M200无限;Tecan)在490 nm的激发波长和发射波长590 nm。
2.5.3。注射测定线粒体通透性转换孔(MPTP药物)
线粒体蛋白质(0.5毫克/毫升)停牌2毫升孵化缓冲区(125 L更易与氯化钾,2 K更易/ L2HPO41 L MgCl更易2,1μ20 mol / L EGTA,更易与L三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.2,5更易与L苹果酸,5更易在37°C / L谷氨酸)水夹套小型管固定器。线粒体肿胀被添加CaCl触发2(10μmol / L)。1分钟后平衡时期,线粒体肿胀是评估在分光光度计通过吸光度下降在540海里。测量重复每30秒10分钟。
2.6。统计分析
结果表示为平均数±标准差,和学生的以及用于比较两组。组内差异在不同时间点相比,重复测量方差分析。每组的生存率差异用Fisher精确概率进行了分析。一个双尾的价值被认为是显著的。分析了实验数据通过SPSS 17.0 (SPSS Inc .,芝加哥,IL)。
3所示。结果
3.1。复苏的结果和存活率
十八24 3 CPR组动物被成功地复苏。六个动物SA组和7 EP和SFI组动物存活6小时,3和6动物心肺复苏术子组存活24小时。没有明显差异在6 - 24小时存活率CPR组之间。在每组动物存活曲线ROSC图所示1。
3.2。血流动力学状态
基线血流动力学测量图所示2在四组(每组)。地图和四组之间没有显著差异()。复苏成功之后,地图的价值明显减少SA组间基线和1,2,或6 h值()。相比之下,地图中显著增加SFI组相比,EP组在6小时()(图2(一个))。公司的价值观是SA显著下降()和EP和SFI ()组在ROSC而虚假的组。公司SFI和EP组显著高于SA组30分钟和2小时()(图2 (b))。
(一)
(b)
3.3。你以后对线粒体通透性转换孔的影响注射(MPTP药物)和线粒体膜电位(MMP)
3.3.1。你以后对线粒体膜电位的影响(MMP)
而虚假的组(图3),大脑额叶皮质神经元显示显著降低MMP的水平在所有组24小时后的心肺复苏术()。与SA组和EP组相比,MMP SFI组升高更明显,没有明显的统计SA组和EP组之间的区别。
3.3.2。你以后对线粒体通透性转换孔的影响注射(MPTP药物)
而虚假的组(图4),在大脑额叶皮质神经元显示显著降低线粒体光密度在所有组24小时后的CPR,表明线粒体明显肿胀,明显的注射的MPTP药物。此外,注射的开放程度MPTP药物SFI组比,在SA和EP组轻。
3.4。神经赤字分数(NDS)和脑性能类别(CPC)的分数
NDS和中共SFI组的得分都低于SA组和EP组(表1),但没有统计学差异()。
3.5。影响你以后在额叶皮层神经细胞的线粒体超微结构
图5(一个)(虚假的集团)显示线粒体结构和正规矩阵集成。图5 (b)(SA组)显示中度受损的线粒体表现为线粒体嵴断裂,基质肿胀和不均匀密度。图5 (c)(EP组)显示严重受损的线粒体表现为线粒体嵴断裂明显和电子密度显著降低。图5 (d)(SFI)显示轻微受损的线粒体表现为正常的线粒体,轻微肿胀矩阵和不均匀密度。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
Postcardiac逮捕脑损伤是最初的缺血性损伤的结果之后,再灌注损伤发生后几小时,几天内ROSC [14]。龚et al。3]发现明显受损的线粒体呼吸链会导致氧化磷酸化紊乱。这可能是由于以下原因。心脏骤停导致血流中断,紧随其后的是氧气供应减少大脑和全身组织缺氧。有氧代谢的急剧下降导致不足三磷酸腺苷(ATP)尽管厌氧代谢增加。此外,氧化应激以及钙超载导致氧化磷酸化障碍和ATP减少甚至枯竭;这些都导致线粒体结构和功能的变化,影响功能的细胞和器官。在目前的研究中,我们发现猪的大脑功能显著受损,表现为中共和NDS评分增加,严重损害脑组织的超微结构,减少MMP和注射加强开放MPTP药物。这可能是另一个重要机制,线粒体结构和功能的变化。
Shen-Fu注射是一种典型的SFI为静脉药物煎煮。SFI基于乌头碱的影响特性,辅以人参皂苷,可以减少炎症和脑缺血后的脑水肿15]。SFI的保护机制与脑缺血/再灌注损伤包括减少兴奋性氨基酸毒性、Ca的封锁2 +过载,提高抗氧化能力16]。张等人表明你可以减轻脑损伤后CPR通过促进特异性神经元烯醇酶的表达(11]。在本研究中,我们发现Shen-Fu注入可以通过提升对线粒体产生保护作用MMP和调整注射的MPTP药物,因此会降低大脑细胞线粒体损伤,减轻脑细胞水肿,保护大脑的功能。
线粒体不仅主要产生ATP的地方,但同样重要的能源转换细胞内细胞器。线粒体可以生成的能量转化为电化学势的形式在endomembrane并存储它。这导致不对称分布的质子和其他离子,从而形成MMP [17]。正常MMP的先决条件维持线粒体ATP生产和MMP的稳定性是有助于细胞维持正常生理功能(18]。先前的研究表明,细胞因子和介质导致细胞凋亡与MMP的衰落。这个过程是由细胞色素C在线粒体膜,紧随其后的是激活caspase-3降低DNA和细胞凋亡19]。其他研究证明MMP的衰落是细胞凋亡的重要指标之一。MMP的下降会导致线粒体呼吸链产生大量的活性氧,从而导致细胞凋亡的不可逆过程20.]。在目前的研究中,我们发现神经细胞MMP的ROSC猪显著下降,表明线粒体MMP的下降可能是ROSC后的脑损伤的主要机制。心脏骤停后神经细胞遭受了严重的缺血再灌注损伤,大量炎症介质和细胞因子的释放。这些导致下降的MMP caspase-3凋亡通路激活,大脑细胞的线粒体损伤和细胞凋亡。我们在我们的研究中发现,相比之下,SA组和EP组你可以发挥brain-protective效果显著提升MMP。这可能是解释说,你以后可以抑制炎症反应,抑制细胞因子的过度释放,抑制激活caspase-3介导的细胞凋亡途径。在我们之前的研究中,SFI的多个组件可以开发免疫调节作用;你以后可以改善细胞免疫功能的调节Th1 / Th2平衡,降低TNF的表达α阻止炎症反应的恶性循环(14]。此外,你以后可以抑制bcl - 2、Bax和caspase-3表达式和减少细胞凋亡(12]。
迄今为止,注射的MPTP药物被视为共同通路损伤后细胞凋亡和死亡(21]。压力条件导致线粒体损伤和注射的MPTP药物,从而导致增加线粒体膜的通透性和线粒体肿胀22,23]。离子梯度消失,线粒体膜电位的崩溃,呼吸链和氧化磷酸化,然后ATP合成停止。因此,注射的MPTP药物可能是决定命运的一个关键因素后受伤的神经细胞缺血再灌注损伤(24]。在目前的研究中,我们发现,与虚假的注射组增加开放MPTP药物相比可以发现猪脑皮质神经元,表明线粒体明显肿胀ROSC之后,这些可以归因于钙超载,大量的氧自由基,减少ATP (25]。此外,我们发现,SFI组注射的MPTP药物和线粒体的肿胀明显减轻,暗示你可能会影响注射的MPTP药物结构和抑制开幕。这可能是一个重要SFI对脑缺血再灌注损伤的保护机制。
肾上腺素(EP)已被用于一个多世纪,推荐的药物用于治疗心脏骤停在当前的指导方针。肾上腺素是一种肾上腺素能受体激动剂混合,付诸行动α肾上腺素(和),β肾上腺素(和)受体,现在被广泛用于治疗心脏骤停、休克、过敏和哮喘(26]。ROSC EP的重要机制是主要的α肾上腺素的途径,增加冠状动脉灌注压,保持周围血管张力,并防止小动脉的崩溃,从而增加ROSC的速率。形成鲜明对比α肾上腺素能受体的影响,β肾上腺素能受体刺激已经建议有有害的影响:增加耗氧量(签证官2)的心肌,减少subendocardial灌注,并关联postresuscitation心肌功能障碍(10,26]。由于这些影响,增加使用EP研究无法证明临床益处,甚至提出,这种形式的治疗可能是有害的。如今,越来越多的研究致力于寻找复苏替代药物。SFI,传统的中草药,常用在中国近800年。它的一个主要组件、乌头包含去甲肾上腺素salsolinol,不仅对p受体和兴奋性的影响α肾上腺素能受体也可增加冠状动脉和脑血流量,进一步有效地促进降低血压、心率和稳定(10]。在目前的研究中,SFI组最好血流动力学参数与EP和SA组。此外,在目前的研究中,EP有效减少时间ROSC与SA组相比,尽管没有影响MMP的脑水肿、脑损伤。相比之下,SFI注射注射抑制的MPTP药物和MMP的增加,从而减轻线粒体和细胞的肿胀。因为SFI的多个组件,这些影响可能是由,至少在一定程度上改善ROSC和大脑功能。
5。结论
我们的研究证明,猪脑皮质的线粒体功能障碍的早期心肺复苏术。SFI治疗不仅可以缓解postresuscitation线粒体功能障碍引起的缺血再灌注损伤,而且提高神经细胞的超微结构和缓解postresuscitation脑细胞损伤。
信息披露
魏顾和小民侯co-first作者。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
魏顾和小民侯了同样的工作。
确认
这项研究受到了北京自然科学基金的资助。7132092)和北京朝阳医院的青年科学基金。