文摘

大多数假丝酵母种虫害感染与宿主表面生物膜的形成有关。细胞在这些社区中显示一个表型耐抗菌素和宿主防御,所以biofilm-associated感染很难治疗,代表再感染的来源。本研究评估的影响丁香酚的依从性属性和生物膜的形成能力假丝酵母dubliniensis和假丝酵母tropicalis孤立的口腔感染艾滋病毒的病人。所有隔离能够在不同的衬底表面形成生物膜。丁香酚显示抑制浮游和固着细胞的活动假丝酵母spp。没有检测到生物膜内的代谢活动经过24小时的治疗。扫描电镜表明丁香酚大幅减少固着在义齿材料表面细胞的数量。大多数假丝酵母物种显示疏水行为和显著差异在暴露后观察细胞表面疏水性的浮游细胞丁香酚1 h。丁香酚也显著减少粘连引起的最多假丝酵母种虫害HEp-2细胞和聚苯乙烯。这些发现证实了丁香酚对的有效性假丝酵母以外的物种白念珠菌,加强其潜在抗真菌应用于限制浮游细胞的生长和生物膜的形成在不同的表面。

1。介绍

口服殖民的患病率假丝酵母种虫害不同人群之间的不同(1,这些真菌共生体的人类微生物群的存在是念珠菌病的一个重要诱发因素(2]。依从性微生物的宿主细胞和组织是第一个事件所需初始殖民或建立感染。此外,微生物表面接触会引发各种细胞行为,包括生物膜的形成(1],也与念珠菌病密切相关[3]。

细胞的生物膜可以被定义为不可逆翼板对社区(无柄细胞)嵌入在一个自产exopolymeric矩阵,显示独特的表型与自由浮动(浮游细胞)同行相比(4]。值得注意的是,无柄细胞更容易受到各种各样的抗真菌剂(5- - - - - -7)和宿主防御(8]。生物膜从而难以根除,代表再感染的来源。因此,迫切需要新的抗真菌药物,特别是那些antibiofilm活动,进行有效的管理假丝酵母种虫害感染。

一些研究人员已经表明反假丝酵母生物膜的潜在植物的化合物,如类黄酮(9和精油10,11]。丁香酚的主要活性phenylpropanoid组件从许多芳香植物精油12]。丁香酚的抑制作用[13- - - - - -17),结合氟康唑和两性霉素B (18对浮游细胞)假丝酵母种虫害之前已经报道过了。此外,丁香酚可以干扰生物膜形成的初始阶段,以及成熟的生物膜的可行性白色念珠菌(10,11]。

虽然白念珠菌仍然是最常见的人类念珠菌病的病原体,其他物种假丝酵母已经成为此类感染的一个重要原因19,20.]。假丝酵母tropicalis和假丝酵母dubliniensis被视为高生物膜生产商,和固着细胞内发现了这个社区是抗真菌剂(5- - - - - -7]。因此,我们分析了影响丁香酚的疏水性和人类上皮细胞粘附和聚苯乙烯的浮游细胞这些物种。此外,抑制活动对生物膜的形成对聚苯乙烯和义齿材料也进行了分析。

2。材料和方法

2.1。假丝酵母spp。隔离和生长条件

的假丝酵母用于这个研究包括三个物种c . dubliniensis(菌株131、219和248)和三个c . tropicalis(菌株23日,150年和176年)与艾滋病病毒感染者的口腔。物种鉴定口腔隔离是由标准的真菌学的方法(21,22]。物种鉴定证实了使用特定引物pcr方法如前所述[23,24]。c . tropicalis写明ATCC 28707和c . dubliniensis写明ATCC米娅- 646型菌株(请提供FIOCRUZ,里约热内卢,巴西)作为质量控制。隔离和菌株都存储在Sabouraud葡萄糖(SD)琼脂和亚文化每月。酵母也维持在−80°C。研究方案是按照大学的伦理委员会Estadual de Londrina (CEP /联合环境。036/10)。从患者获得书面知情同意的出版这份报告。

2.2。生物膜的形成

假丝酵母分离培养的SD肉汤和孵化37°C 18 h。酵母被离心收获和洗两次无菌0.15磷酸盐,pH值7.2 (PBS),这些细胞被计入hemocytometric室(纽鲍尔改善室)。一个20μL SD肉汤暂停6×10⁵酵母放入每好平底96 -好微量滴定板包含180(电子塑料制品、瑞士)μL (SD肉汤。板块在37°C孵化24 h。之后,井与无菌蒸馏水洗一次,细胞的代谢活动是量化使用2,二(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl) 2 h-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT)还原试验。一个100μL整除XTT-menadione(0.1毫克/毫升XTT, 1μ米甲萘醌,西格玛化工有限公司、美国)被添加到每个好,盘子都在黑暗中孵化为2 h 37°C。的XTT甲瓒490 nm产品测量微量滴定板读者(通用标ELx 800年Bio-Tek仪器,美国)(6]。分析义齿材料表面生物膜的形成,井是无菌涂以有机玻璃(PMM OrtoClass,干白、巴西)和陶瓷(Noritake Shofu牙科Corp .)、美国)在试验之前。

2.3。抗真菌敏感性测试

丁香酚的生长抑制作用(SSWhite、巴西)浮游细胞假丝酵母隔离是由汤采用根据临床和实验室化验标准协会(25]。股票的解决方案的丁香酚制备水含有10%二甲亚砜(DMSO v / v,σ化工有限公司,美国)。最后DMSO浓度化验不超过1.0%。这种物质是连续稀释2倍与拖把RPMI缓冲,pH值7.0 (3000 - 5.85μg / mL丁香酚)。质量控制c . dubliniensis写明ATCC米娅- 646和c . tropicalis写明ATCC 28707和氟康唑(512.0 - -0.5μg / mL,辉瑞中央研究,英国)包含在每一个实验。两个井的板作为增长和不育控制。的最小抑制浓度(麦克风)测定总抑制后的视觉增长比未经处理的浮游细胞24小时孵化。确定抗真菌药物敏感性的无柄细胞,生物膜形成聚苯乙烯,如上所述。生物膜的形成1到24 h后,媒介是吸气和每个好与无菌PBS洗了三次。一个200μL整除的RPMI 1640中包含连续2倍稀释的丁香酚和氟康唑是补充道,和板块进一步孵化24小时在37°C。控制包括antifungal-free井和biofilm-free水井。固着麦克风测定100%抑制(中芯国际_{One hundred.})相比,使用XTT-reduction antifungal-free控制井试验(6]。探讨丁香酚的时间效应,24小时的生物膜假丝酵母与中芯国际物种形成的聚苯乙烯和治疗_{One hundred.}丁香酚如上所述。在确定时间点(3、6、12和24 h),固着细胞的代谢活动。所有的实验都是在三个不同的场合进行了一式三份。

2.4。细胞表面疏水性的决心

未经处理的疏水性和eugenol-treated(0.5×麦克风1 h)浮游细胞是由两相的烃/水方法根据Anil et al。26]。细胞表面疏水性(CSH)表示为水相的比例降低光密度的测试与控制相比,在水相的吸光度变化越大,越疏水酵母样本。每个试验进行三次,每次一式三份的决定。

2.5。酵母HEp-2细胞的粘附和聚苯乙烯

HEp-2细胞(人类喉部表皮样癌)在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(DMEM Gibco)补充10%胎牛血清,2毫米谷氨酰胺,100 U /毫升青霉素,100μ2.5 g / mL链霉素,μg / mL两性霉素B在湿润有限公司5%₂气氛在37°C。附着力化验,HEp-2细胞被播种在24-well板块为4.010⁵细胞每口井和孵化18 h。中被移除,每个与无菌PBS洗了三次。新鲜的培养基-添加抗菌素和注射治疗和eugenol-treated的油井假丝酵母spp。(0.5麦克风与大约2.0 1 h)10⁶细胞,在37°C和盘子孵化2 h有限公司5%₂的气氛。不依从酵母与无菌PBS被洗涤。附着酵母被治疗的单层细胞收获1毫升0.5% (v / v)特里同x - 100(西格玛化工有限公司)10分钟在冰上。可行的酵母是枚举SD琼脂稀释电镀。实验在三个不同的场合进行复制。依从性百分比计算的方程:% = (cfu的坚持_120年/ cfu₀)100年,cfu_120年是指坚持每毫升细胞2 h和cfu之后₀初始接种细胞的数量。描述的执行在聚苯乙烯表面粘附的生物膜的形成小的修改。简单地说,治疗和eugenol-treated (0.5麦克风1 h)浮游细胞被放置在每个好,盘子被孵化2 h。贴壁细胞的代谢活动决心使用XTT-reduction分析如上所述。

2.6。扫描电子显微镜(SEM)

光盘(0.8厘米)直径PMM和陶瓷无菌放在井24-well组织培养板(电子塑料制品、瑞士)。3.0的标准培养液10⁶酵母细胞,一夜之间从文化,准备在1毫升的RPMI 1640培养基,pH值7.0,用于在这些表面形成生物膜。光盘被静态地沉浸在这些细胞悬液和孵化24小时37°C。后来,不依从生物和PBS被轻轻清洗三次。一个毫升含有丁香酚的RPMI(中芯国际_{One hundred.})添加和板块进一步孵化24 h。生物膜上形成这些条固定为2.5% (v / v)戊二醛在0.1米甲次砷酸盐缓冲(pH值7.2)在室温下。固定后,一系列的细胞脱水乙醇洗(15、30、50、70、80、90、95和100%),临界点干燥在有限公司₂涂上金和检查,日本岛津公司ss - 550扫描电子显微镜。

2.7。统计分析

结果被学生的评估t以及使用软件GRAPHPAD PRISM 5.0版本(GRAPHPAD软件,圣地亚哥,CA)。P值小于0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。在非生物表面生物膜的形成

生物膜的形成,假丝酵母物种在聚苯乙烯,PMM,陶瓷是使用XTT-reduction分析监控。所有隔离能够形成生物膜在24 h,在这些不同的衬底表面的固着细胞的代谢活动(表1)。之间没有显著差异的代谢活动观察菌株和隔离在每个基质进行了分析。然而,一个显著差异()基板之间的观察,发现最高的生物膜的形成对聚苯乙烯表面,其次是PMM和陶瓷。的意思是(光密度在490海里标准偏差)聚苯乙烯,PMM,对陶瓷表面。

3.2。抗真菌活性对浮游和无柄细胞

中等收入国家和中芯国际的丁香酚和氟康唑假丝酵母种虫害隔离和类型菌株被发表在表2。浮游细胞的分离和应变的类型c . dubliniensis对氟康唑敏感。然而,观察氟康唑的敏感性的变化c . tropicalis,引用类型菌株耐176(写明ATCC 28707)和隔离,隔离150剂量依赖性敏感,和隔离23对氟康唑敏感,按照CLSI [25解释断点。的生物膜假丝酵母物种表现出高耐氟康唑。中芯国际的_{One hundred.}这种化合物的分离和类型菌株高于512μ克/毫升。丁香酚的MIC值c . dubliniensis和c . tropicalis浮游细胞从375年到750年不等μ克/毫升。落后于经济增长观察氟康唑对所有测试时c . tropicalis菌株,丁香酚完全抑制浮游细胞的生长。丁香酚也表现出对成熟生物膜的抑制作用假丝酵母物种,这似乎是剂量依赖(图1(一))。有80%以上降低24小时无柄细胞的代谢活动与丁香酚浓度为187.5 - 750μ克/毫升。没有检测到的浓度代谢活动从375年到1500年不等μg / mL,这些值被认为是中芯国际_{One hundred.}。丁香酚对24小时无柄细胞的抑制作用也与时间有关的(图1 (b))。减少代谢活动范围从11.1到31.6%,76.6 - 85.5%和90.6 - 93.5%在孵化中芯国际的存在_{One hundred.}丁香酚为3、6和12 h,分别。没有可检测代谢活动24小时后观察治疗。丁香酚也干扰生物膜的形成,因为治疗1 h附着细胞导致剂量依赖性降低其代谢活动(数据没有显示)。中芯国际的_{One hundred.}1 h附着细胞从375年到750年不等μ克/毫升(表2)。

3.3。扫描电子显微镜的假丝酵母tropicalis生物膜对义齿材料

丁香酚的影响c . tropicalis150年(隔离,麦克风氟康唑= 32μg / mL)生物膜上形成PMM和陶瓷表面由SEM(图监控2)。未经处理的细胞的成熟生物膜的分离是由密集的网络细胞,由一层异构的酵母,假菌丝,菌丝(数字2(一个),2 (c),2 (e),2 (g))。生物膜的治疗与丁香酚大幅减少固着细胞的数量c . tropicalis在义齿材料表面(数字2 (b),2 (d),2 (f),2 (h))。

3.4。丁香酚对细胞表面疏水性的影响和粘附HEp-2细胞和聚苯乙烯

探讨丁香酚对CSH和附着力的影响哺乳动物细胞和聚苯乙烯,浮游细胞假丝酵母物种暴露在丁香酚subinhibitory (0.5MIC)浓度化验前1 h。大多数假丝酵母种虫害隔离显示疏水行为由两相的烃/水方法,意思是相对CSH从84.59±4.32。除了c . tropicalis176年,一个显著差异(在CSH)假丝酵母物种浮游细胞接触后观察丁香酚1 h(表3)。有一个范围的减少42.3到75.1%的CSH eugenol-treated细胞比未经处理的对应的细胞。丁香酚也显著减少粘连引起的最多假丝酵母物种HEp-2细胞()和聚苯乙烯()。粘附比例没有显著差异的隔离的176c . tropicalis要么表面,虽然减少了20%粘细胞暴露于哺乳动物细胞被认为在丁香酚。另一个假丝酵母隔离显示一系列的46.9 - 68.9%和27.4 - 67.8%减少粘附HEp-2细胞和聚苯乙烯,分别。

4所示。讨论

丁香酚已广泛应用于医学及牙科由于其杀菌、抗菌、麻醉、镇痛,抗氧化,抗炎,和心血管属性(27,28]。这个phenylpropanoid化合物被报道对浮游细胞有抗菌活性白念珠菌,c . dubliniensis glabrata,c . guilliermondii,c . krusei,c . parapsilosis和c . tropicalis(13- - - - - -17,29日]。此外,这种化合物显示了在体外协同与氟康唑和两性霉素B白念珠菌(11,18]。正如之前报道的(14- - - - - -17),我们的研究结果表明,丁香酚对浮游细胞真菌的活动c . tropicalis,包括那些被列为fluconazole-resistant和酵母存在剂量依赖的相关性,这种效应也被观察到c . dubliniensis。

之前的研究在文献中报道都集中在确定丁香酚的antibiofilm活动白念珠菌。他等。10]显示剂量依赖性降低代谢活动48 h在聚苯乙烯表面生物膜的形成和丁香酚处理另一个48 h。在500年的存在μ克/毫升和2000年μg / mL丁香酚,50%(中芯国际₅₀(中芯国际)和超过80%_80年分别减少)被发现。汗,艾哈迈德(11)的影响评估phytocompounds(丁香酚、肉桂醛、柠檬醛和香叶醇)对48 h的生物膜白念珠菌和他们的研究结果也显示,丁香酚的剂量和时间抑制活动。中芯国际的_80年治疗后48 h的化合物从100年到400年不等μ克/毫升。这一研究获得的结果表明,丁香酚显示对生物膜抑制活动c . dubliniensis和c . tropicalis毫不奇怪,非常耐氟康唑。丁香酚抑制生物膜的形成,以及减少代谢活动的成熟生物膜上形成聚苯乙烯,剂量依赖性的方式。SEM分析进一步揭示了减少生物膜上形成义齿材料(PMM和陶瓷)。

丁香酚诱发死亡的机制假丝酵母种虫害不是完全理解。这种化合物导致浮游细胞形态的深刻变化和泄漏的细胞质成分,表示动作在细胞信封(13,14]。事实上,一些作者表明,丁香酚的抑菌浓度白念珠菌导致细胞麦角固醇含量显著减少(15,16,30.)和干扰腺苷三磷酸酶活性(31日]。此外,广泛的损伤细胞膜(15,30.)可能是由于氧化应激介导的活性氧(29日]。

微生物粘附基质表面的生物膜形成的初始事件,信封和细胞介导微生物和环境之间的交互。CSH、特异性的因素,被认为是导致依从性的一个重要特征假丝酵母种虫害在不同表面(32,33]。此外,它已被证明,CSH浮游细胞白念珠菌从不同来源分离与生物膜形成相关积极聚苯乙烯(34]。在这项研究中,丁香酚(0.5的存在MIC)引起显著减少CSH和粘附聚苯乙烯和HEp-2几乎所有浮游细胞的细胞c . tropicalis和c . dubliniensis。这些结果表明,丁香酚可能会干扰的粘附性能假丝酵母物种。这是以前报道,白念珠菌粘附聚苯乙烯(35和上皮细胞36)是减少后在体外接触subinhibitory氟康唑的浓度,干扰的抗真菌麦角固醇的生物合成。

总之,这里的研究报道证实了丁香酚对浮游和固着细胞的有效性假丝酵母以外的物种白念珠菌,加强这种化合物作为抗真菌的潜力,表明这phenylpropanoid可能有额外的有益影响当地治疗念珠菌病。因此,最初的在活的有机体内研究已经证明了局部使用的安全性和有效性的丁香酚治疗阴道(37)和口头(14念珠菌病的老鼠。进一步的研究是必要的来确认其有效性biofilm-associated的预防和/或治疗念珠菌病的人。

5。结论

这一研究获得的结果表明,除了真菌的活动,丁香酚能够改变CSH和浮游细胞的粘附能力c . dubliniensis和c . tropicalis。此外,这个phenylpropanoid化合物抑制生物膜的形成和成熟生物膜上形成聚苯乙烯和义齿材料假丝酵母物种。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究支持由项目尽管对位o SUS: Gestao Compartilhada em Saude (PPSUS) / Fundacao南洋杉/ SESA-PR /女士/ CNPq和项目Pos-Graduacao em Microbiologia da大学Estadual de Londrina。Suelen Balero德波拉是由一个学生奖学金从Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(披肩)。作者感谢a·瓦博士英语编辑的手稿。这项工作是女士的一部分论文的Suelen Balero德波拉。