文摘
脊髓胶质细胞活化在神经性疼痛的发病机制中扮演着关键角色。铂的政府,一个重要的抗癌药物,常常诱发急性神经性冷超敏反应和/或机械过敏症患者。Gyejigachulbu-tang (GBT)草药配方组成肉桂的皮层,Paeoniae基数,Atractylodis Lanceae根茎,Zizyphi果实,Glycyrrhizae基数,Zingiberis根茎,和率块茎在东亚,已经用于治疗各种疼痛症状,特别是在寒冷的病人。本研究调查是否以及如何GBT减轻oxaliplatin-induced冷和机械过敏症的老鼠。冷和机械的行为迹象过敏进行评估的尾巴在冷水中浸泡试验(4°C)和冯·弗雷头发测试,分别。重要的冷和机械过敏症铂注射后观察3天(6毫克/公斤,i.p)。每日口服GBT(200、400和600毫克/公斤)5天明显减毒冷和机械过敏症。免疫反应性胶质原纤维酸性蛋白(GFAP,星形胶质细胞标记)和OX-42(小胶质细胞标记)在脊髓背角铂注射液显著增加,由GBT恢复管理。这些结果表明,GBT缓解oxaliplatin-induced冷和机械过敏症的老鼠可能通过抑制脊髓胶质激活。
1。介绍
铂是一种第三代铂类化疗药物,获得了治疗晚期大肠癌的重要性(1,2]。与其他铂化合物(如顺铂)、铂不引起肾毒性但往往诱发急性痛苦的神经病变甚至从一个政府(3]。急性神经毒性副作用,唯一主要dose-limiting毒性与铂使用[4),特点是自发的迅速出现严重的疼痛和冷敏感的手,脚,口周的区域,或喉咙5- - - - - -7]。之前的动物研究还表明,一个注射6毫克/公斤铂繁殖的特定感觉神经毒性,特别是冷过敏,没有痛觉过敏或对热刺激触诱发痛(8,9]。然而,这些神经性症状的机制和治疗尚未确定(10),这表明小说治疗选项是非常必要的。
二十年前,在脊髓胶质细胞已被证明有助于周围神经性疼痛(11,12]。许多证据表明,脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞改变其形态和功能后周围神经损害。这些激活的胶质细胞释放一些细胞因子和分子直接影响突触传递和邻近神经元的兴奋性,导致行为超敏反应(即。,触诱发痛)11- - - - - -14]。尽管最近的一项研究[15]显示卫星胶质细胞激活oxaliplatin-treated背根神经节的老鼠,它仍然是未知的脊髓神经胶质激活是否扮演了一个角色在这个oxaliplatin-induced神经性过敏。
在传统草药在东亚包括中国、日本、和韩国,GBT由几个“热”的草药一直被用于治疗多种疼痛症状,特别是在寒冷的病人。有趣的是,Buja(木鱼在日本,一个处理率块茎),一个关键的组件在这个草药配方,最近被抑制脊髓胶质激活和神经性疼痛后周围神经损伤(16]。在目前的研究中,我们调查是否GBT缓解oxaliplatin-induced冷和机械敏感,如果是这样,这种antiallodynic是否影响GBT调制相关的脊髓神经胶质激活。
2。材料和方法
2.1。动物
男性Sprague-Dawley老鼠(160 - 210克;Daehan Biolink、来自韩国忠北、韩国)被安置在笼子里每笼老鼠(4)与水和食物随意。房间保持12 h光/暗周期(光周期;08:00-20:00,黑暗周期;20:00-08:00)和保存在°C。所有动物都适应了他们的笼子前1周任何实验。老鼠用于本研究的总数是77。机构批准的所有程序涉及动物动物保健和使用委员会庆熙大学(KHUASP (SE) 13 - 047],并按照指南进行痛苦的国际研究协会(17]。
2.2。铂管理
诱发神经性冷触诱发痛大鼠(18,19美国),草酸铂(σ),溶解在5%葡萄糖的浓度(美国σ)解决方案2毫克/毫升,腹腔内注射6毫克/公斤。同样体积的5%葡萄糖溶液腹腔注射的对照组。
2.3。行为测试
如前所述(20.,21),寒冷异常性疼痛的行为迹象是由尾巴用冷水浸泡试验。短暂,每个动物都固定在一个塑料夹,尾巴低垂的适当应用冷水刺激。老鼠适应持有人2天前启动行为测试。尾巴是沉浸在4°C水,然后尾巴撤退延迟测量的截止时间15秒。尾巴浸渍试验以5分钟的间隔重复了五次。在计算平均延时,截止时间被分配到正常的反应。的平均延迟被作为衡量冷触诱发痛的严重程度;短尾撤军延迟被视为一种更严重的异常性疼痛。所有行为测试进行盲评。
对于机械触诱发痛,我们测量了尾巴的撤军阈值以应对一系列冯·弗雷毛(日志单元:3.61,3.84,4.08,4.31,4.56,4.74,4.93,和5.18;等效弯曲力的0.4,0.6,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,和15.0克;美国Stoelting)。50%的提款使用上下阈值确定方法(22]。简单地说,动物被放在一个塑料夹尾巴露在外面。测试开始的头发弯曲力为2.0 g。最敏感的尾巴是第一个由探索各个领域对1 - 2 s弯曲的头发。如果突然尾观察(即撤军。,positive response), the filament with the next lower bending force was applied. When no response was observed, the next higher filament was applied. This testing procedure continued until a response to the fifth von Frey hair stimulation from the first change of response was measured. The responses were converted into a 50% threshold value using the following equation: 50% threshold,在那里最后的值是冯·弗雷灯丝(日志单位),从表校准校正因子(),然后呢δ是刺激之间的平均差的日志单位(23]。一套15.0 g压力作为截止值。
2.4。GBT实验组和治疗
GBT (Keishikajutsubuto日本),由Tsumura & Co .),日本(301年TJ-18很多:GBO),是一个干煎草药(表七的混合物1)。这种草药配方的质量受到严格控制的制造商。此外,分析了试样三维高效液相色谱法(HPLC)和成分检查(见补充图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/436482)。这个GBT暂停和生理盐水稀释和注射的老鼠口服口服填喂法200的浓度,400,或600毫克/公斤/天铂注射后5天。GBT的浓度在这项研究是类似于其他草药配方用于我们的先前的研究24和Buja的别人的研究16]。
老鼠被随机分成以下六组(冷,每组n= 3 - 5每组机械测试):(1)NS /车辆(腹腔注射5%葡萄糖溶液+每日口服生理盐水),(2)GBT400 /车辆(腹腔注射5%葡萄糖溶液+每天口服400毫克/公斤GBT), (3) NS / Oxali (ip注入铂+每日口服生理盐水),(4)GBT200 / Oxali (ip注入铂+每天口服200毫克/公斤GBT), (5) GBT400 / Oxali (ip注入铂+每天口服400毫克/公斤GBT),和(6)GBT600 / Oxali(铂注射液+每天口服600毫克/公斤GBT)。0天,尾巴浸执行测试或•冯•弗雷头发测试然后铂(6毫克/公斤)或车辆(5%葡萄糖溶液)腹腔注射,紧随其后的是一个口服GBT或盐水。从第一天到第五天,行为测试日报GBT或生理盐水后30分钟进行管理。
2.5。免疫组织化学
动物与异氟烷麻醉与50 mM灌注transcardially磷酸盐(PBS)和固定刚做好的解决方案组成的4%多聚甲醛在100毫米磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)。脊髓骶段在S1水平提取和后缀在一夜之间相同的固定剂和转入cryoprotection蔗糖30%解决方案。组织切片在30岁米在一个冷冻切片机(德国徕卡)。部分在PBS孵化了10分钟,用PBS洗了三次,然后孵化1%过氧化氢(H2O230分钟)。接下来,一夜之间,部分被孵化的鼠单克隆抗体anti-GFAP(美国Chemicon)的稀释1:500年与鼠标anti-OX-42可视化的星形胶质细胞或抗体的稀释(Chemicon) 1: 500小胶质细胞的可视化。部分被孵化1 h和anti-mouse二级抗体(1:200;向量实验室、美国)和绑定二级抗体与矢量放大精英ABC工具包(向量实验室)。随后被孵化avidin-biotin-peroxidase复杂的部分(1:100;在室温下向量实验室)1 h。免疫反应性被孵化可视化解决方案中的部分组成的3 0.05%,3-diaminobenzidine (DAB)和0.01% H2O2在50毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH值7.6)约3分钟。部分被安装在gelatin-coated玻片脱水在室温下过夜。盖玻片是使用Permount安装。确定意味着反应小胶质细胞和星形胶质细胞的数量,每四到五部分动物被随机选择进行评估。之前的图像分析,光源的亮度调整产生积极和消极之间最好的对比染色小胶质细胞和星形胶质细胞。OX-42-positive小胶质细胞的数量和GFAP-positive星形胶质细胞在脊髓背角量化包括薄层I-IV由一个观察者(蒙蔽了25]。
2.6。统计分析
所有的数据了(平均数标准误差)。统计分析和图形作品用Prism 5.0(美国图垫软件)。单向或双向方差分析(方差分析)其次是Dunnett事后测试是用于统计分析。在所有情况下,被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。GBT对Oxaliplatin-Induced冷的影响和机械过敏症
所有组的老鼠,一般没有异常的临床体征和恶化状况和体重增加的实验观察。类似于我们的以前的结果(19),对冷刺激响应的延迟撤军是近截止值(15秒)前一个铂(6毫克/公斤,i.p。)注入(图1(一),天0),显著降低了至少3天至5天注射后(图1(一)NS /车辆与NS / Oxali,)。机械阈值的时间进程在铂注射也表现出相似的变化(图1 (b))。
(一)
(b)
GBT antiallodynic效果的oxaliplatin-injected老鼠如图1。GBT不同剂量(200、400和600毫克/公斤)口服铂后每天注射。行为进行了测试后30分钟口服GBT每天实验。铂注入后第三天,没有显著差异在寒冷和机械敏感性之间的正常saline-administered对照组和GBT-administered组,虽然轻微增加尾巴撤退延迟和机械阈值GBT治疗后观察。最后,在第五天,所有剂量的GBT明显减毒的冷和机械过敏(,与NS / Oxali),表明累积效应的GBT冷触诱发痛。当动物的一个小子集(每组)测试GBT政府之前,类似的累积效应的GBT oxaliplatin-induced观察冷过敏(补充图2)。在vehicle-injected正常老鼠(即。,no oxaliplatin injection), GBT treatment induced no change in cold and mechanical sensitivity (NS/Vehicle versus GBT400/Vehicle,)。
3.2。GBT对脊髓神经胶质激活的影响
的行为实验从铂注射5天,从动物获得脊髓部分加工星形胶质细胞和小胶质细胞激活的免疫组织化学分析(图2)。GFAP免疫染色结果表明,脊髓星形胶质细胞在NS / Oxali组(即形态学激活。肥厚性与厚过程;图2 (b)),而那些在NS /车辆对照组显示静息状态的形态学与小soma和薄的过程(图2(一个))。铂注入也显著增加的密度GFAP-positive脊髓背角细胞薄片I-IV (,细胞在NS / Oxali组对比细胞在NS /车辆集团;图2 (d))。每日口服GBT(400毫克/公斤)恢复了oxaliplatin-induced形态脊髓星形胶质细胞的激活NS(图/车辆控制水平2 (c)),并显著抑制脊髓GFAP-positive细胞的数量增加(与NS / Oxali;图2 (d))。GBT600 / Oxali组显示类似的抑制对脊髓星形胶质细胞活化的影响(细胞;与NS / Oxali),但GBT200 / Oxali组没有(细胞;与NS / Oxali)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
OX-42疣状数据显示,在NS / Oxali组脊髓小胶质细胞形态(即激活。肥厚性变形形状与短流程;图2 (f)),而那些在NS /车辆对照组显示分歧的静息状态的形态学与小soma和长流程(图2 (e))。OX-42-positive细胞的数量在脊髓背角薄片I-IV也显著增加了一个铂注射液(,细胞在NS / Oxali组对比细胞在NS /车辆集团;图2 (h))。GBT(400毫克/公斤)治疗恢复了oxaliplatin-induced形态脊髓小胶质细胞的激活控制水平(图2 (g)),并显著抑制脊髓OX-42-positive细胞的数量增加(与NS / Oxali;图2 (h))。GBT200 / Oxali和GBT600 / Oxali组显示类似的抑制对脊髓小胶质细胞活化的影响(细胞和细胞,分别地;与NS / Oxali)。在vehicle-injected正常老鼠(即。,no oxaliplatin injection), GBT treatment induced no change in spinal glial cells (NS/Vehicle versus GBT400/Vehicle:与细胞(GFAP-positive星形胶质细胞);与细胞(OX-42-positive小胶质细胞),)。
4所示。讨论
铂一直用于治疗晚期和转移性结直肠癌患者与其他癌症也有影响,包括卵巢癌、乳腺癌和肺癌1,2]。然而,急性神经毒性,表现为冷过敏在外围,即使开发单个铂管理(8,9]。因此如果oxaliplatin-induced周围神经病变可以缓解,病人可能克服癌症没有停止化疗。
虽然脊髓胶质激活的重要作用是现在被广泛接受的在周围神经性疼痛的发病机制,有矛盾的结果在化疗所致周围神经病变(CIPN)。例如,Peters等人。26)报道,紫杉醇诱导脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞的激活,但另一组(27)显示,只有脊髓小胶质细胞,而不是星形胶质细胞被激活。郑et al。28]进一步报道,常用化疗药物紫杉醇、长春新碱、铂不能诱导脊髓小胶质细胞的激活。最近的一项研究[29日)还表明,铂诱导瞬态脊髓小胶质细胞的激活,但更长期激活脊髓星形胶质细胞。因为这些研究采用不同的过程(例如,剂量、频率和持续时间)对化疗药物灌注,这可能是合理的认为CIPN脊髓胶质激活的贡献是根据动物模型。在这项研究中,我们发现脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞明显激活一个铂注射液(6毫克/公斤,i.p。),这是与急性冷的发展和机械过敏症。这些结果表明,脊髓神经胶质激活可能发挥作用在老鼠oxaliplatin-induced急性神经性疼痛。
因为有趣的特点oxaliplatin-induced周围神经病变是一种强大的冷过敏,我们认为GBT作为潜在的替代治疗选择,基于传统医学理论在东亚以及最近的临床证据。GBT有它的基础唱汉伦和略修改在日本江户时期(30.]。正如前面提到的,它主要由“hot-character”中药材,如肉桂的皮质,Zingiberis根茎,和率块茎。因此,传统上用来对付“冷”全身的疾病包括普通感冒、流感、关节炎、神经痛,痛苦的痉挛。这可能是临床上重要的传统概念。最近的临床研究的确表明,政府GBT和Buja GBT的关键组成部分,极大地提高了冷stimuli-evoked oxaliplatin-administered结直肠癌患者的周围神经性疼痛或postherpetic神经痛患者31日,32]。我们之前的研究中使用相同的鼠模型中使用这项研究还表明,甜蜂毒,传统上认为是“hot-character”,有效地缓解了oxaliplatin-induced冷触诱发痛(18]。此外,小泉和他的同事们证明Buja强烈抑制脊髓胶质激活后周围神经损伤,导致antiallodynia [16]。
受这些研究的启发,我们这里证明GBT可以抑制脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞的激活在铂注入和缓解oxaliplatin-induced急性冷和机械过敏症。自从vehicle-injected正常控制老鼠表现出没有改变尾巴延迟撤军以及脊髓胶质细胞GBT治疗后,我们的研究结果表明,GBT不影响正常伤害感受但变弱oxaliplatin-induced病理过敏症。然而,它仍然是未知的分子机制负责GBT的抑制效应或Buja脊髓胶质激活oxaliplatin-injected或nerve-injured动物,分别。除了这个问题之外,GBT能否调节外围瞬时受体电位锚蛋白1 (TRPA1)或瞬时受体电位melastatin 8 (TRPM8)频道,著名的介质为oxaliplatin-induced冷和机械过敏(33,34),是我们正在进行的调查研究。
5。结论
总之,我们的发现在这个研究表明GBT强有力地减轻oxaliplatin-induced急性冷和机械过敏通过抑制脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞的激活。因此,GBT治疗可以另一种治疗选择oxaliplatin-induced周围神经性疼痛。
利益冲突
作者声明没有竞争的经济利益。
确认
这项工作是由韩国国家研究基金会(NRF)授予由韩国政府最高明的(没有。2012 - 0005755)。作者感谢Giseog Lee Munsoo吉尔,Dae-Il Lee Bong-Soo Lim Hak-Jin月亮,和最小胆小鬼你们优秀的技术支持和讨论。