文摘

本研究的目的是探索的积极作用Jian-Pi-Zhi-Dong汤(JPZDD)抽动秽语综合征(TS)通过调查氨基丁酸(GABA)的表达及其类型(GABA受体一个R)小鼠纹状体的TS模型。该模型由3、3′-iminodipropionitrile (IDPN)治疗;然后老鼠分为4组(n = 22日);控制和IDPN组与生理盐水,其余两组填喂法与tiapride和JPZDD填喂法。我们记录了TS老鼠的刻板行为,并测量了GABA在纹状体由高效液相色谱和GABA的内容一个R的表达,免疫组织化学和实时PCR。我们的研究结果表明,JPZDD抑制TS的异常行为模型小鼠和GABA水平下降和伽马氨基丁酸一个R蛋白mRNA表达的TS模型小鼠纹状体。总之,JPZDD减轻TS症状的机制可能与GABA有关一个在纹状体差别R表达对这些可能调节GABA的新陈代谢。

1。介绍

抽动秽语综合征(TS)是一个发育性神经行为障碍的特点是刻板的,无意识的,重复的动作和声音,称为长期(一年以上)电动机和直言不讳的抽搐,分别为(1]。TS通常在儿童时期就已经出现,并往往在青春期发病高峰,提高青春期结束的时候(2]。此外,TS患者也显示行为和情绪障碍包括注意缺陷多动障碍(ADHD)的症状,强迫症(OCD),和广泛性发育障碍(3]。

直到现在,TS的病因和病理生理机制仍不清楚。人们普遍认为,基底神经节,包括电路连接皮质纹状体,是不正常4]。基底神经节组成的互联网络皮层下结构,包括纹状体、苍白球、黑质和丘脑核。在cortico-striato-thalamocortical (CSTC)电路,大脑皮质纹状体提供了主要的输入;然后苍白球、黑质纹状体继电器信息通过两个途径:一个兴奋(直接通路)和一个抑制(间接途径)。这些电路的故障可能导致的行为表现为抽搐。很长一段时间,异常突触间隙多巴胺活动在TS(被认为是最重要的因素1]。大多数学者推测,多巴胺能神经元的过度活跃和/或多巴胺受体TS的病理生理学基础5- - - - - -7]。然而,在这些以往的研究结果是不确定的。DA和gaba ergic神经元对基底神经节电路的维护至关重要。因此,其他失衡,如glutamatergic或gaba ergic新陈代谢,似乎可能在TS (8]。最近,它提出了关键电路干扰兴奋性和抑制性的平衡可能会成为许多神经发育障碍包括TS (9]。多巴胺在基底神经节和gaba ergic系统交互系统;gaba ergic神经元已报告在层次的途径直接或间接激活多巴胺能系统(10]。临床研究显示,代谢紊乱的GABA参与TS的发病机理11,12]。

氨基酸神经递质GABA是主要的抑制性神经递质在中枢神经系统(CNS)。通过其GABA GABA调节大脑兴奋性一个受体(13]。GABA受体是药物设计的关键目标治疗各种抽搐,和伽马氨基丁酸一个受体系统可能发挥重要作用的病理生理学TS (14]。Levetiracetam,典型的增强GABA的活动一个受体,感兴趣的可以治疗抽搐(15]。伽马氨基丁酸一个受体是由五个单元共同组成超过19个不同的类,包括α1 - 6,β1 - 3,γ1 - 3,δ,ε,θ,π,ρ1 - 3 (16]。GABA的一个α4受体预测是拼接的病理生理学TS和抽搐12]。

一项研究证明,Jian-Pi-Zhi-Dong汤(JPZDD)能有效地抑制异常行为在TS小鼠模型,增加纹状体的多巴胺转运蛋白水平(17]。然而,这项研究并不能解释的现象高表达的DAT TS患者和不完全解释病理生理学。因此我们猜测CSTC电路的功能的异常也可能引起的病理变化在GABA受体。本研究旨在探索JPZDD GABA ergic系统的可能机制TS小鼠模型,尤其是伽马氨基丁酸一个受体。

2。材料和方法

2.1。药品和试剂

-Iminodipropionitrile (IDPN)从Sigma-Aldrich有限公司购买LLC。(圣路易斯,密苏里州,美国),和tiapride (Tia)江苏Nhwa药业有限公司有限公司(徐州,江苏,中国)。氨基丁酸(GABA, 5835)和o-phthaldialdehyde (OPA P0657)从σ,购买beta-mercaptoethanol (β我,0482)从Amresco有限公司LLC。(梭伦,哦,美国),anti-GABA一个受体α4抗体(主要抗体,1:100)从Abcam有限公司LLC。(中国香港)和poly-HRP anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体(pv - 9001)从ZSGB-BIO有限公司(中国,北京)。

2.2。制备JPZDD

十个不同的中国草药JPZDD中。他们购买的制药部门隶属于北京中医药大学东方医院(中医药大学)。导演清纯郝识别组件和凭证标本存放。JPZDD包含十个成分:10 gPseudostellaria heterophylla,10克白术macrocephalaKoidz, 10克茯苓狼,6克半夏ternata布莱特,6克试布兰科,6克Saposhnikovia衣属鸦葱Schischk、3 g作用研究,10克当归一昼夜的,6克当归chuanxiong如果短,10 g利用薄层色谱鉴别可检测出其中钩藤杰克。所有草药浸泡1 h在室温和与蒸馏水煮2 h。滤液浓缩,干燥使用vacuum-desiccator 60°C。提取的颗粒分析红外指纹图谱与标准来保证合格率90%以上,然后包装和储存在室温下。

2.3。动物

我们使用八十八雄性ICR小鼠,称重 g,年龄在4周,从重要赖夫购买实验室,北京,中国(没有。SCXK 2012 - 0001)。所有动物实验动物管理协议符合中国卫生部的规则,和动物伦理委员会批准的这项研究是中国医学科学院。动物被保存在一个标准的动物饲养房间的室温 °C和30% - 40%的相对湿度,在12 h光暗周期(光12 h: 07:00晚7:00和黑暗12 h: 19:00至07:00)和随意使用纯净水。老鼠1 w之前生成TS模型。一个星期后,小鼠随机分为生理盐水组(对照组, )和TS模型组( )。生理盐水组(i.p)注射0.9%生理盐水(15毫升公斤−1);TS模型组(i.p)注射IDPN(350毫克公斤−1)每天一次连续7天。根据行为测量用来评估等级的刻板印象,我们行为记录的TS模型组,所述的王et al。17]。TS小鼠模型组进一步分为3组:IDPN模型组( ),IDPN + Tia组( ),IDPN + JPZDD集团( )。生理盐水和IDPN组与盐水填喂法(0.9%)在20毫升公斤−1,IDPN + Tia组与Tia 50毫克公斤−1,IDPN + JPZDD 20 g集团与JPZDD公斤−1每天一次连续6周。行为记录是由两个训练有素的观察者是熟悉测量但盲目的条件。每只动物都观察2分钟(18),平均分数计算。在试验的最后一天,小鼠安乐死颈椎错位。

2.4。高效液相色谱法(HPLC)

背外侧纹状体的左右( ,每组)被解剖,冻结在−80°C。脑组织样品在700年重然后均质μL冰冷的裂解缓冲的19),包含o-phthalaldehyde 27毫克,1毫升无水乙醇,四硼酸盐缓冲9毫升,β巯基乙醇5μl

匀浆离心机在14000 rpm 15分钟0.22 4°C和过滤μm过滤器(合演,旋转x)然后离心机在7000 rpm。标准溶液或滤液从脑匀浆(20μL)注入高效液相色谱法。色谱条件如下。precolumn资生堂(保护盒,Capcell S-5 C18毫克, 毫米)。色谱柱是水域XTerra女士( 2.5毫米,嗯,没有。186000598)。流动相是由100毫米磷酸氢二钠、25%甲醇,10%乙腈(pH值6.70)。流量为0.6毫升/分钟。柱温箱保持不变在40°C。工作解决方案的GABA(40 20 8、4、2、1和0.5μg / mL)。每个化合物的校准曲线被绘制峰面积的比值确定内部标准与标准溶液浓度的越来越多。一个线性回归方程( )评估, 分析物的浓度和吗 峰面积的比率。相关系数(R2)计算。

2.5。免疫组织化学

老鼠( 灌注,每组)和固定4% PFA后用10%水合氯醛麻醉的。4%的大脑被移除和后缀PFA 14 h,然后嵌入石蜡。嵌入式的大脑被切成3μ米的部分。脱蜡后,补液,阻断α4的部分被孵化主要抗体(ab4120 Abcam,香港)的稀释1:100一夜之间在4°C (20.]。与PBS三次洗涤后,组织与二次孵化抗体(pv - 9001、ZSGB-BIO、中国)30分钟。部分被涂可视化通过孵化(1:20)5分钟,然后用中性胶盖玻片。六个视觉领域中随机挑选从双边彩色纹状体立式显微镜下20 x放大。每个字段的光学密度(OD)是计算使用Image-Pro + 6.0分析系统。GABA的值一个受体α4纹状体中蛋白质的测定每个老鼠的大脑每三片。

2.6。实时聚合酶链反应

背外侧纹状体的左右( ,每组)被解剖,冻结在−80°C。总RNA从纹状体分离试剂盒试剂根据制造商的协议(Tiangen生物技术,北京)。GABAα4引物如下:正向引物:5′-GCTGACAGAGGGAAATAAATAAAG-3′和反向引物5′-TGGATGATTCTGGTAGAGTGGG - 3′。β-肌动蛋白引物如下:正向引物5′-GCCTTCCTTCTTGGGTATGGAA - 3′和反向引物5′-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC - 3′。实时PCR的基本协议在95°C初始变性10分钟,其次是45的循环放大。互补脱氧核糖核酸扩增,变性在95°C的周期由10分钟,在95°C 15 s退火,伸长为60年代60°C。SYBR绿色信号检测使用IQ5实时PCR仪(美国Bio-Rad大力神,CA)。PCR产物进行了分析通过凝胶电泳和融化曲线分析来确认具体的放大。信使rna表达规范化使用 肌动蛋白。使用ΔΔ转录水平量化Ct值的方法。

2.7。统计分析

结果表示为均值±S.E.M.差异是使用方差分析检验的重要性,其次是Student-Newman-Keuls (SNK)测试。在所有的测试中,统计学意义的标准 。

3所示。结果

3.1。行为研究

IDPN可能诱发刻板行为与生理盐水对照组相比明显不干预。TS IDPN引起的小鼠模型显示不同程度异常的刻板印象。IDPN注入后,我们将TS鼠标模型分成三组根据分数来确保这些组之间没有统计学意义,然后我们给了不同的治疗。的IDPN JPZDD和IDPN Tia组明显下降的严重程度刻板行为治疗前后( 刻板印象的),但是分数IDPN组没有统计学意义( )(图1)。


图1
评估机械重复的TS模型小鼠在不同组治疗6周之前和之后。在所有组机械重复评分下降,但一个重要IDPN观察治疗效果 Tia组和IDPN JPZDD组。数据显示为均值±SEM ( 老鼠/组);※代表 值< 0.05。
3.2。GABA的含量在纹状体的高效液相色谱法

GABA的含量在纹状体是通过高效液相色谱法来衡量的。在治疗结束时,GABA水平IDPN组(261.24±47.31)和IDPN + Tia组(258.57±57.64)明显高于生理盐水组(200.54±23.94)( )。IDPN + JPZDD组GABA的含量(220.90±48.30)低于IDPN组( )(图2)。


图2
高效液相色谱法来评估GABA在纹状体的内容。酒吧图表表示数据从40种不同的动物。数据显示为均值±SEM ( 老鼠/组)。※代表 值< 0.05;★代表 值< 0.01。
3.3。GABA水平一个通过包含IHC R在纹状体

进一步调查GABA的活动和数量一个R在纹状体,伽马氨基丁酸一个R蛋白表达进行免疫组织化学(图3(一个))。伽马氨基丁酸一个R蛋白IDPN组高IDPN组较生理盐水组( )。此外,IDPN + JPZDD丰富的GABA减少,显著改善观察JPZDD治疗小鼠相比,生理盐水组( )。Tia对GABA的表达同样的效果一个R蛋白在纹状体JPZDD ( )(图3 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
免疫组织化学的 纹状体。(一)比较 在不同的组,(A) IDPN集团(B)生理盐水组(C) IDPN + Tia组和(D) IDPN + JPZDD组。放大20 x。(b)光密度是量化。酒吧图表表示数据来自24个不同的动物。数据显示为均值±SEM ( 老鼠/组)。※代表 值< 0.05;★代表 值< 0.01。
3.4。GABA的表达一个R mRNA在纹状体

实时定量PCR用于测量的水平 信使rna在小鼠纹状体。标准曲线绘制 α4和 肌动蛋白基因。融化曲线分析证实,没有引物二聚体PCR产品。结果表明, 信使rna表达IDPN + JPZDD集团IDPN集团和IDPN + Tia组高于对照组,但这些组之间没有显著差异( )(图4)。


图4
GABA的表达一个R mRNA表达在纹状体。酒吧图表表示数据来自24个不同的动物。数据显示为均值±SEM ( 老鼠/组)。

4所示。讨论

在中国传统医学(中医),TS列为慢性小儿惊厥或牵引和疲软。其病理基础是过度的能量肝脏和脾脏的不足。基于这一理论,我们假设脾不足可能导致肝脾痰和过多的能量会导致肝脏风。肝脏风激动和脾脏痰阻塞通道。根据这一假说,治疗的原则加强地球(脾)和抑制木(肝)。在本指南中,我们创建了一个名为JPZDD的食谱,包括两个古老的Liu-Jun-Zi-Tang公式(LJZT)和Xie-Qing-Wan (XQW)。XQW的主要功能是抑制肝脏风,虽然LJZT可以加强脾。草药在JPZDD严格基于中医理论的兼容性。JPZDD的主要药物Pseudostellaria heterophylla罗马帝国,滋养气,作用研究知母,清洗肝脏火停止肝脏风。茯苓狼和白术macrocephalaKoidz可能促使spleen-qi和试布兰科和半夏ternata布莱特可能消除痰;这四个的药草是辅助。Saposhnikovia衣属鸦葱Schischk和利用薄层色谱鉴别可检测出其中钩藤杰克可能清除肝脏火和停止肝脏风。当归chuanxiong如果短和当归一昼夜的可能滋养肝脏血液和协调肝脏;这些都是助理草药。

我们先前的研究已经表明,JPZDD是一个有效的煎煮,这可能减少自发运动过度的倍(21,22]。同时,我们关注JPZDD调节单胺神经递质及其代谢产物在TS老鼠。十倍用量,取得了满意的结果。通过包含IHC和原位杂交,我们发现JPZDD可能增加DAT蛋白质和mRNA的表达在不同程度上。其antitic效果可能部分归因于协同交互组成的抗氧化作用和认知改善(17]。

在这项研究中,我们选择使用TS小鼠模型所描述的王et al。17]。这个模型是由IDPN (3 3-iminodipropionitrile)。这个老鼠模型显示一系列的刻板行为,如横向和垂直头抽搐,盘旋,嗅探和牵绊。这些症状持续至少2个月没有任何干预。我们的行为研究进一步验证了该模型的稳定性。没有统计学差异在生理盐水和IDPN组INPN虽然有统计学差异 JPZDD和IDPN Tia组治疗前后。因此,我们推断JPZDD可以改善TS的症状。

众所周知,许多氨基酸发射器参与CSTC电路,包括GABA和GLU。GABA是哺乳动物大脑的主要抑制性神经递质。GABA是由GABA ergic神经元和GABA ergic GABA ergic神经元之间形成突触和发布他们的目标(23]。许多gaba ergic大脑皮层中间神经元的迁移无关地从同一胚胎神经节隆起地区,引起gaba ergic介质带刺的投影的纹状体神经元24]。gaba ergic中间神经元被证明起着关键的作用在调节大脑皮层的发展,纹状体、小脑、海马(25,26]。TS患者的后期分析显示数量下降的光伏积极gaba ergic中间神经元在纹状体和苍白球(增加数量27,28]。临床研究也表明,一些GABA和Ach-related基因参与的病理生理学TS和抽搐12]。我们的实验结果表明,在IDPN GABA的含量较高,IDPN Tia, IDPN JPZDD组比对照组。这个结果与勒纳的研究(14]。我们推断,GABA是由谷氨酸脱羧和Glu相对增加活动产生毒害神经的效果,因此GABA的含量增加和Glu的增加新的平衡。之前的研究也表明,高浓度的Glu增加细胞外的牛磺酸和甘氨酸,然后增加细胞外GABA (29日,30.]。

快速抑制GABA ergic传输的响应特征是由激活GABA介导的一个R受体(31日]。障碍包括伽马氨基丁酸一个R系统可能发挥重要作用的病理生理学TS (1]。巴氯芬、合成GABA模拟施加止痉挛的影响,发现了TS患儿(32,33]。因此,我们假设异常GABA的TS可能与GABA受体的异常表达。我们所知,没有其他研究相比GABA受体之间的TS模型和控制。因此,我们的研究可能揭示TS的GABA ergic机制。我们的实验结果也表明了,机械重复的行为与GABA的高表达一个受体,与生理盐水组和其他组之间的统计学意义。IHC表明JPZDD和Tia可能减少GABA的生物活性一个受体,以保持平衡。结合之前的结果,它是合理的假设GABA的减少一个受体蛋白表达在纹状体直接导致改变GABA含量是一个潜在的antitic JPZDD的效果。PCR显示这些组之间无统计学差异,所以在GABA减少一个受体主要是在蛋白质水平而不是在核酸水平。尽管没有区别JPZDD组和Tia组,JPZDD-treated动物没有显示不良的副作用,如锥体外系症状、迟发性运动障碍,嗜睡或高泌乳素血症。

然而,目前的研究有一些局限性如下。首先,人类和老鼠之间存在差异;从而进一步实验进行TS患者可以为TS治疗提供更多的临床意义。其次,本研究没有解释的现象GABA在一些患者的低表达。第三,其他类型的GABA受体可能在未来被测试。

总之,这项研究的结果表明,JPZDD可能有效地抑制刻板印象的行为和控制通过下调GABA TS症状一个受体的表达,这可能会直接减少过度代GABA在纹状体。因此治疗策略针对gaba ergic系统可以有效地治疗TS。

作者的贡献

文章,文静,Minkyoung李进行了实验。Daohan王提供了试剂和材料。李伟进行统计分析;王Sumei起草和执行关键论文的修改。作者认为他们已经阅读和批准提交给《华尔街日报》。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突的问题,没有直接金融与商业标识中提到这项工作。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金的资助。81273799,北京中医药大学。2013 - jybzz - x - 151和泰安科技局。20132090。