文摘

奇效Yishen公式(BYF)一直在亚洲使用几个世纪来有效地治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者。本研究建立了一个在大鼠COPD动物模型,在三组(控制、慢性阻塞性肺病和BYF)被用来评估机制(s)和BYF的疗效。肺功能和组织形态学表明BYF对慢性阻塞性肺病有明显影响。基因微阵列是利用分析BYF在慢性阻塞性肺病的影响。ClueGO差异表达基因分析表明,BYF改善COPD通过调节表达白细胞介素,肌球蛋白丝装配组件和线粒体电子运输相关的分子。此外,ELISA显示表达的几个白细胞介素(摘要意思β白细胞介素6、IL8和IL10)降低外周血和支气管肺泡灌洗液BYF治疗。得出BYF疗效在COPD大鼠通过其对白介素表达式和/或分泌的影响。此外,药理或目标的两个差异表达基因的表达,F2R和Sprik1在小说慢性阻塞性肺病的治疗方法,可能是有用的。本研究对慢性阻塞性肺病BYF机制提供了基础和新的治疗药物靶点。

1。介绍

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一个慢慢进步,不可逆的疾病,其特征是异常肺部炎症反应(1]。慢性阻塞性肺病发展是最大的风险因素吸烟(1]。其他危险因素包括空气污染、灰尘和固有敏感性[1]。慢性阻塞性肺病的发病率一般人口正在增加,连同其伟大的公共卫生负担2,3]。尽管一些糖皮质激素和支气管扩张剂可以缓解慢性阻塞性肺病急性发作,存在明显的副作用(4]。例如,2受体激动剂可以诱发肌肉震颤、心动过速、出汗、焦虑(5];茶碱能引起头痛、恶心、呕吐、心律失常、癫痫(6];和糖皮质激素可以诱发骨质疏松症(7]。因此,开发新的持久,有针对性的治疗策略是一种巨大的紧迫感。

目前,临床试验和实验研究表明,某些中药能有效治疗慢性阻塞性肺病、改善肺功能、呼吸肌肉疲劳,免疫力,肺血流量(8- - - - - -10]。邓(11)发现了一个中药配方,可以改善慢性阻塞性肺病的病理表现在老鼠模型中,包括气道和肺血管炎症反应和可塑性。此外,与西医相比,许多中药几乎没有副作用(12]。然而,草药成分的复杂性和各种行为限制了它们的应用和阻碍了研究的潜在机制。随着高通量分子技术的发展如基因微阵列,它已成为可能的观察中药对基因表达的影响,并寻求他们的分子靶点。

作为一种传统中药配方,奇效Yishen公式(BYF)已用于世纪东亚地区有效地治疗慢性阻塞性肺病患者。BYF主要使用草药黄琦的使用(黄芪草药配方)。多中心临床研究表明,草药与黄琦公式是有效稳定的慢性阻塞性肺病(13- - - - - -18]。然而,这些研究没有质量的评估系统,并没有研究这个特殊的草药配方的分子机制进行了探讨。我们以前的研究已经表明BYF有更明显的有利影响比西医临床症状稳定的慢性阻塞性肺病。此外,明显积极的长期影响观察BYF治疗(19- - - - - -21]。在这项研究中,修改后的COPD大鼠模型建立了如前所述,陈et al。22为评估BYF (s)的影响。三个实验小组(COPD、BYF和控制)被用来比较肺功能和病理。探讨分子机械BYF对慢性阻塞性肺病的影响,筛选差异表达基因微阵列,进行浓缩和基因功能分析。

2。方法

2.1。BYF准备和动物模型建立

BYF准备在河南中医药大学第一附属医院(郑州,河南,中国)。BYF组件组成的15 g黄琦(黄芪),15克任沈(人参),15 g Shanzhuyu (山茱萸),9 g Wuweizi (五味子)。草药都是“煮水,蒸汽消毒,带到最后一个0.6克/毫升的浓度。BYF是由(9)和中国专利数量(2011101175781)。

实验协议实验动物保健和伦理委员会批准第一附属医院,河南中医药大学。两个月Sprague-Dawley老鼠从河南购买实验动物中心(河南xk2005 - 0001)的体重200±20 g。他们保持12小时黑暗/光周期25±1°C的环境温度和相对湿度50±10%,以及足够的食物(无菌鼠chow)和水(无菌)。所有的老鼠麻醉和牺牲在上述实验协议和所有的努力都是尽量减少痛苦。

六十Sprague-Dawley老鼠被随机分为三个实验组(控制、慢性阻塞性肺病和BYF)(图1),每组中相同数量的男性和女性。四十大鼠接受鼻内滴注法肺炎克雷伯菌每隔5天持续8周。老鼠被放置在一个300 L烟箱与3 h之间的间隔30分钟的烟治疗,其中八个香烟被烧死在头两个星期每天两次,每日三次,每次15香烟被烧死在周3 - 8。治疗8周后,40 COPD-induced老鼠被随机分为两组:慢性阻塞性肺病和BYF。COPD组管理2毫升胃内的盐水车(0.9%)每天两次在周9-20,和BYF组管理4.44 g / kg / d BYF周9-20期间每天两次。剩下的20大鼠作为对照组,没有治疗前8周后跟2毫升胃内的盐水车在周9-20 (0.9%)。所有老鼠重每周来确定剂量,经历了由肺组织病理检查切除(6样品/组)在21周。

2.2。准备和肺功能测定和病理学

潮汐卷(电视)、最大呼气流量(PEF), 50%的潮汐卷呼气流量(EF50)检测到的肺功能测试体积描记器(Buxco Inc .威尔明顿、数控、美国)每四个星期进行一次从0到20周。石蜡包埋的部分肺组织被苏木精和伊红染色,图像是由光学显微镜(奥林巴斯、东京、日本)。

2.3。白介素检测BALF和外周血

重复盐水后支气管肺泡灌洗(3毫升/灌洗),收集BALF接受10分钟离心(2000 r / min)和上层清液用于检测IL8和10通过ELISA(武汉博士德有限公司,中国)。所有过程都保持在4°C。从大鼠外周血收集主动脉abdominalis,用于检测血清摘要意思β、白细胞介素6、IL8,IL10通过ELISA(博士德Inc .)。

2.4。RNA提取

六个肺组织样本切除从每个三个实验小组的微阵列分析。总RNA分离骨骼肌的试剂盒试剂(表达载体,布雷达,荷兰)和使用试剂盒纯化RNeasy微工具包(试剂盒、Venlo、荷兰)。RNA质量验证了安捷伦2100生物分析仪(安捷伦科技,阿姆斯特丹,荷兰)。

2.5。微阵列处理

纯化的RNA样品(2μg ea) PCR扩增和标签使用安捷伦快速Amp工具包(美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)和杂化安捷伦整个老鼠基因组低聚糖微阵列(4×44 K)在安捷伦的钱伯斯SureHyb杂交。杂交和洗涤后,处理幻灯片由安捷伦DNA微阵列扫描仪进行扫描(零件号G2505B)使用制造商推荐的设置。

2.6。数据预处理

原始图像数据被转换为移动电话和主文件使用安捷伦10.5.1.1特征提取的软件版本。所有下游微阵列分析使用安捷伦GeneSpring GX软件11.0版。微阵列数据集在GeneSpring GX规范化使用安捷伦铁一种颜色方案(主要是中值归一化);日志2-transformed数据被分位数标准化规范化,用于比较。差异表达基因被确定通过褶皱变化(日志比| | > 1)和学生的以及筛选()。

ClueGO软件(24)是用于基因功能富集分析。我们结合基因本体论(去)和KEGG通路在ClueGO分析;去融合和限制被选出,集类别和创建一个功能性组织去类别网络基于重叠不同类别和意义。白介素表达式由学生组之间的差异进行了比较以及()。

3所示。结果

3.1。肺功能和病理改善COPD大鼠BYF治疗

20周后,对照组老鼠是活跃的和不安分的,光滑和光洁的皮毛。他们的体重逐渐增加和呼吸保持稳定。BYF治疗前,老鼠在慢性阻塞性肺病和BYF组表现出“精神萎靡,”,特点是抑制食欲和蠕动聚集毛皮前8周。这些老鼠的体重慢慢增加短呼吸伴随着频繁的咳嗽。这些症状在BYF组大鼠明显减轻后BYF治疗从周9 - 20。

肺功能检测到所有三个实验小组通过电视、PEF, EF50每四个星期20周。电视、PEF EF50被发现是稳定的对照组,但大幅下降前八周在慢性阻塞性肺病和BYF组()。BYF治疗后,电视、PEF和EF50 BYF组显著提高(所有;表1;图2(一个)大鼠的慢性阻塞性肺病组相比)。

从每个三个实验组,每组肺组织形态学的图像如图所示2 (b)。控制相比,COPD大鼠显示upregulation严重的炎症反应明显增加淋巴细胞,单核细胞和中性粒细胞。支气管和肺壁厚、支气管狭窄程度,和牙槽直径明显高于慢性阻塞性肺病组在肺泡计数单位面积控制老鼠相比显著降低。这些COPD-related现象与BYF治疗大大松了一口气。此外,BYF治疗显著减轻炎症反应,如图所示,显著降低炎性细胞在肺组织的数量。

3.2。基因微阵列数据分析

调查BYF在COPD发病的分子机制,我们随机选择了十八岁的三个实验样本组(6个样品从每个实验组)基因表达实验。使用日志比| | > 1,,42岁,到67年,(度)的差异表达基因检测控制和COPD组之间以及慢性阻塞性肺病和BYF组(图3(一个);见表S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/381976),分别。12个基因两者之间的重叠度列表(控制与慢性阻塞性肺病和慢性阻塞性肺病与BYF)。如数据所示3 (b)和3 (c),所有12重叠基因增加COPD大鼠,然后减少BYF组。去宾果的富集分析软件(23)表明,这12个重叠基因参与核糖体结构/功能,基因表达,翻译,和消极的监管RNA拼接(表2)。特别是,四重叠基因(RPL10L、RPS26 RGD1561843,和RGD1561841)位于核糖体。这表明BYF治疗可能减少慢性阻塞性肺病的信使rna编辑翻译和转化。

3.3。ClueGO分析差异表达基因

促进对生物影响的理解度,功能充实是由ClueGO [24],它包含注释基因本体和KEGG途径。ClueGO集去分类和创建功能组织类别网络基于重叠不同类别和统计学意义。与先前的研究慢性阻塞性肺病和缺氧和氧化应激25],度检测慢性阻塞性肺病和对照组之间在很大程度上涉及检测血液缺氧条件的颈动脉体化学感受器的信号,线粒体电子传递,细胞色素C氧气,苯甲醛脱氢酶(NAD +)活动(图4(一))。一个特别有趣的发现这个分析是重要的铀浓缩方面参与分娩。

重要去度慢性阻塞性肺病和BYF团体之间的通路方面呈现在图4 (b)。这些度主要是丰富参与调节白介素生产、线粒体电子传递,NADH泛醌,NAD +合酶活动,NAD生物合成,poly-ADP-D-ribose绑定和肌球蛋白丝组装。因为慢性阻塞性肺病是伴随着肺部炎症,氧化应激,肌肉纤维功能障碍(25- - - - - -27),慢性阻塞性肺病BYF治疗可能改善这些症状通过调节上述项功能。

两者之间比较ClueGO分析度列表(慢性阻塞性肺病和控制以及慢性阻塞性肺病和BYF)表明,两相对丰富度列表共享至少三个方面共同点包括白介素生产,NAD / NADH和线粒体电子运输相关函数(图5)。

3.4。白介素血清和BALF中表达水平

白介素生产和炎症功能被ClueGO评估分析(24),在几种常见的水平明显增加血清(摘要意思β白细胞介素6、IL8和IL10)和BALF (IL8和IL10通过ELISA)白细胞介素。20周结束时,血清水平的摘要意思β白细胞介素6、IL8和IL10COPD组明显高于对照组(),而那些BYF组明显低于COPD组()。类似于血清,IL8和IL10水平也降低BALF BYF治疗(;表3;图6 (b))。这些发现表明BYF可以缓解COPD炎症减少白介素水平。

4所示。讨论

虽然技术进步,仍有相当大的并发症与人体组织抽样。动物模型,模仿COPD发病机制避免人体实验的风险(28- - - - - -30.),并提供一个依据评估新的治疗策略的有效性。目前,COPD动物模型,符合人类慢性阻塞性肺病是可用的(9,10]。在这项研究中,老鼠吸烟引起的慢性阻塞性肺病是结合重复滴注法克雷伯氏菌肺炎。COPD肺组织病理学通过光学显微镜显示病变大鼠模型接近于发生在人类的慢性阻塞性肺病。

中草药的复杂性和不同动作的组件的广泛利用和有限阻碍了其内在的分子机制的研究。与高通量分子技术,如基因芯片的发展,可以检查中药对基因表达的影响。评估BYF对慢性阻塞性肺病的影响在本研究中,我们建立了三组大鼠(COPD、BYF和控制)和比较他们的肺功能和病理。结果表明,BYF治疗可以显著改善肺功能和COPD大鼠肺组织病理。基因表达谱被用来探索BYF治疗的目标特征。基因功能富集分析表明BYF可以改善慢性阻塞性肺病通过线粒体电子运输相关分子(NAD / NADH / ADP)、白介素表达式,监管和肌球蛋白丝装配组件、肌肉功能障碍有关。很多研究表明,慢性阻塞性肺病与呼吸,横隔膜,骨骼肌功能障碍(27,31日- - - - - -33]。线粒体电子运输相关分子(NAD / NADH / ADP)也在与氧化还原反应和氧化应激,这是已知的关键因素在慢性阻塞性肺病33,34]。此外,监管白介素表达,参与炎症,也是一个症状的慢性阻塞性肺病(35- - - - - -37]。

慢性气道炎症是COPD的发病机制中的一个重要方面,与几乎所有的结构和功能损伤气道和肺组织(38]。先前的研究显示,成员的中性粒细胞等炎症细胞,淋巴细胞,和肺泡巨噬细胞聚集在血液、痰、BALF和稳定的慢性阻塞性肺病患者的支气管粘膜39]。炎症细胞也释放各种细胞因子,包括摘要意思β白细胞介素6、IL8和IL10,在炎症反应中发挥重要作用。在这项研究中,我们检测到表达摘要意思β白细胞介素6、IL8和IL10在外周血和BALF。结果表明,所有四个减少BYF治疗COPD大鼠白细胞介素,这是与基因功能富集分析一致。

在基因表达谱,没有发现差异表达白介素在治疗组中。然而,表情变化的几个检测BALF和血清白细胞介素,表明BYF治疗不能表达下调白介素转录但减少翻译和/或蛋白质的分泌。基因功能富集分析12重叠度(之间的控制与慢性阻塞性肺病和慢性阻塞性肺病与BYF组)表明BYF治疗可以减少慢性阻塞性肺病的翻译和RNA拼接。确认,我们专注于两个度(F2R和Sphk1)相关的白介素的规定生产。有趣的是,研究Gigante et al。40,41)表明,F2R单体型影响血清白细胞介素6在人类和监管水平白细胞介素6在内皮细胞合成和生产。换句话说,F2R单体型可能会影响白细胞介素6合成和分泌。除此之外,人类蛋白质相互作用预测,预测(pip)数据库F2R可能身体上的相互作用IL8(42),而李et al。43)发现,Sphk1表达和活动可以减少摘要意思β和白细胞介素6血清中的浓度。因此,我们推测F2R和Sphk1可以调节的合成或分泌某些白细胞介素在COPD大鼠模型,虽然BYF治疗不影响转录但减少白介素翻译或通过调节分泌表达吗F2R和Sphk1,从而提高COPD-related炎症(图7)。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Jiansheng李、杨力平了同样的工作。

确认

作者感谢张杨帮助他们完成生物信息学分析。这项研究得到了国家自然科学基金(号。81130062,81173236,30973743)。

补充材料