文摘
背景。新鲜碎大蒜蒜素,主要的组成部分,是一种最具有生物活性化合物大蒜;据报道,诱导肿瘤细胞凋亡;然而,大蒜素的机制发挥其凋亡的影响并不完全理解。本研究的目的是为了进一步阐明凋亡通路的蒜素诱导人卵巢癌细胞株SKOV3。方法。细胞增殖和细胞凋亡测定细胞计数分析,流式细胞术分析。信号通路的激活是由人类phospho-kinase阵列分析,筛选和激活通路及其相关蛋白被免疫印迹分析进一步证实了。结果。蒜素诱导SKOV3细胞凋亡和物磷酸化以时间和剂量依赖性的方式,但这些明显被SP600125物(抑制剂)。研究结果表明,物磷酸化与蒜素对SKOV3细胞的作用。此外,物激活诱导bcl - 2家族激活mitochondria-mediated触发信号通路,导致大量的伯灵顿的易位和细胞色素c释放。结论。物激活和线粒体伯灵顿易位参与allicin-induced SKOV3细胞凋亡。我们的数据输入新见解的文学allicin-induced细胞凋亡。
1。介绍
卵巢癌是癌症死亡的主要原因。在西方国家,而且其在亚洲的发病率正在增加。目前,cytoreductive手术和化疗被认为是卵巢癌的常规治疗。然而,手术的成功率只有35 ~ 50%,造成的多重耐药性(MDR)化疗导致晚期卵巢癌患者的5-year-survival率只有20 ~ 30%。因此,尽管卵巢癌研究癌症,预防或治疗仍然需要进步。
大蒜(大蒜)长期以来一直被用于食品和药物在东方国家。研究表明,大蒜具有多种生物活性,包括antiatherosclerotic、抗高血压、抗菌、抗癌、免疫调节、辐射防护和潜在抗衰老的效果(1,2]。新鲜碎大蒜蒜素,主要的组成部分,是一种最具有生物活性化合物的大蒜(3),形成从蒜氨酸通过蒜氨酸酶的作用4,5]。大蒜素对不同类型的肿瘤细胞具有明显的抑制影响,如胃癌、结肠癌、肝癌、肺癌和已投入临床治疗作为抗癌药物的援助。
激活细胞凋亡信号通路可能是负责恶性疾病的治疗。caspase-3两凋亡通路收敛,一个涉及caspase-8,另涉及线粒体释放细胞色素以及caspase-9的激活,有被描述6,7]。线粒体凋亡信号是由线粒体膜的完整性的变化。可溶性细胞凋亡信号分子,如细胞色素线粒体膜间隙中,局部释放到细胞溶质在细胞凋亡诱导(8]。释放细胞色素同事与Apaf-1 [9,10)和激活procaspase-9 multimeric复杂,apoptosome [11- - - - - -13]。活跃caspase-9反过来流程下游效应还存在3、6、7 (14]。因此,细胞色素的释放细胞凋亡信号的细胞溶质代表了一个关键的步骤和分析线粒体细胞色素释放可能因此识别细胞凋亡的线粒体信号(15]。研究已经证明,一些bcl - 2家族成员(如伯灵顿,Bcl-xL, mcl1, bcl - 2,和报价)位于线粒体膜可以改变膜的渗透性和触发激活还存在的16),从而导致凋亡细胞死亡。蒜素已经被报道在人类上皮癌细胞通过诱导细胞凋亡的线粒体释放细胞凋亡诱导因子(AIF)和蛋白激酶发挥重要作用的发现caspase-independent凋亡通路(17]。
proapoptotic影响大蒜素对肿瘤细胞的体外研究提供的(18];然而,大蒜素的机制发挥其凋亡的影响尤其是对卵巢癌并不完全理解。目前的研究提供了新的证据表明,激活物和线粒体易位的伯灵顿参与allicin-induced人类卵巢癌SKOV3细胞凋亡。
2。材料和方法
2.1。材料
蒜素是购自上海收获制药有限公司有限公司(上海,中国)。实验中使用的蒜素的纯度≥90%,由高效液相色谱法。鼠标anti-Hsp60单克隆抗体和anti-Bax单克隆抗体2 d2从圣克鲁斯生物技术、购买公司(美国)。抗体细胞色素和物抑制剂SP600125获得Beyotime生物技术研究所,而抗体β肌动蛋白、phospho-JNK和物从细胞信号技术购买。人类Phospho-Kinase阵列(产品目录号ARY003)获得研发系统有限公司(美国)。rpmi - 1640中型和胎牛血清买来GIBCO(美国)。
2.2。细胞培养和治疗
人类卵巢癌细胞系SKOV3从中国获得类型文化中心集合(武汉,中国)。rpmi - 1640细胞常规培养的培养基补充10%胎牛血清在湿润的气氛中有5%的公司2孵化在37°C。与不同数量的蒜素治疗进行,从0到100不等μ克/毫升。除非另有规定,蒜素的浓度选择为所有实验是25μg / mL;等量的磷酸缓冲盐或二甲亚砜加入细胞控制。
2.3。细胞增殖和细胞凋亡测定
SKOV3细胞(2×104)被播种在每个96孔板和孵化为不同时期在不同浓度的大蒜素。治疗后,细胞的增殖潜力进行了分析使用细胞计数Kit-8 (Dojindo、熊本、日本)根据制造商的协议。细胞凋亡测定,SKOV3细胞增长到大约75%在6-well板块交汇,然后处理或没有蒜素(25μg / mL, 48 h)和/或物抑制剂(20μ米,30分钟)。治疗后,这些细胞被收集,水洗,并在200年resuspendedμL 2×10的绑定缓冲5细胞/毫升。2.5样本随后孵化μL的膜联蛋白V-FITC和5μL (propidium碘在黑暗中在室温下15分钟,然后分析了流式细胞术(Miltenyi,德国)。
2.4。Phospho-Kinase蛋白质组分析和免疫印迹分析
细胞被播种密度1×107细胞每60厘米2菜,培养24小时,使用表示浓度的大蒜素治疗48 h,和加工使用人类Phospho-Kinase数组工具包(蛋白质组分析器;研发系统,明尼阿波利斯,美国制造商的指示。Phospho-kinase数组数据开发x光片后暴露在化学发光试剂。结果经免疫印迹分析,如前所述[19]。
2.5。伯灵顿易位检测和细胞色素在线粒体释放
原油从SKOV3细胞线粒体和胞质提取准备与暗示治疗,所描述的Parone et al。20.]。伯灵顿和细胞色素在细胞质和线粒体被检测到免疫印迹分析。
2.6。统计分析
数据来自三个独立的实验,用平均数±标准差表示。使用学生的差异进行了分析以及或单向方差分析,适当的。被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。蒜素抑制SKOV3细胞增殖和凋亡
蒜素的抗增殖作用对SKOV3细胞暴露了蒜素的细胞不同浓度24日,48和72 h。细胞生长抑制的剂量和时间的方式(图1)。在25岁μ大蒜素的g / mL, SKOV3细胞表现出大约60%的抑制增殖治疗后48 h。因此,这个浓度和处理时间被用于以下实验。流式细胞仪分析表明,蒜素显著诱导细胞凋亡,也明显被预处理SP600125(图2);然而,SP600125独自不可能抑制细胞凋亡。
(一)
(b)
3.2。大蒜素激活的信号通路在SKOV3细胞
人类phospho-kinase阵列进行了化验发现哪些信号通路参与allicin-induced SKOV3细胞凋亡。物和AKT通路被激活(见补充资料在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/378684)。作为物通路的激活是一个了不起的新发现在此设置,我们关注它在接下来的实验。Phospho-JNK增加剂量依赖性的方式(图3(一个)15岁),峰值磷酸化检测min-when细胞治疗与25μ蒜素(图g / mL3 (b))。此外,SP600125能部分抑制物磷酸化激活的蒜素(图3 (c)),揭示allicin-induced凋亡相关物在SKOV3细胞MAPK信号通路。
(一)
(b)
(c)
3.3。物激活蒜素导致伯灵顿易位和细胞色素在线粒体释放
伯灵顿(2 d2)和细胞色素水平在线粒体和胞质分数进行进一步阐明物通路是否参与下游细胞凋亡的分子事件。如图4(一)时间的方式,线粒体伯灵顿水平降低,但同时增加了胞质分数。相反的是观察到的细胞色素的水平。有趣的是,SP600125明显阻止了细胞色素从线粒体释放SKOV3细胞暴露于蒜素(图4 (b))。显然Allicin-induced物直接导致细胞色素的增加内容。这些生化变化确认allicin-induced凋亡是由物激活。
(一)
(b)
4所示。讨论
细胞凋亡,细胞程序性死亡过程,是一个重要的方法去除老化、损伤和突变的细胞。随着细胞凋亡及其机制的深入研究,研究人员认识到,诱导肿瘤细胞凋亡是一种有效的方法治疗肿瘤(21]。因此,探索新的治疗调节治疗肿瘤的细胞机制,诱导细胞凋亡是成为肿瘤学领域的热点研究之一。
细胞凋亡是一个严格监管的过程控制的几个信号通路,如半胱天冬酶和线粒体通路(22]。蛋白质的bcl - 2家族,要么proapoptotic(伯灵顿)或凋亡(bcl - 2)的蛋白质,在细胞凋亡中起着重要的作用,导致细胞色素的释放从线粒体23]。同样,线粒体是已知在调解中发挥核心作用“内在死亡信号”,因此可以作为化疗的新目标。细胞色素是一种线粒体蛋白的释放到胞质是由bcl - 2家族成员24]。一旦释放到胞质、细胞色素与procaspase-9后开关caspase-3或caspase-7,导致细胞凋亡(25]。
最近的研究表明,MAPK蛋白质是细胞凋亡的重要介质压力刺激引起的(26]。物和p38 MAPK共同称为“压力激发了蛋白激酶”,因为他们被激活通过各种与压力相关的刺激和化疗药物(27]。物信号通路被报道影响bcl - 2家族的成员。例如,物不仅可以灭活凋亡bcl - 2蛋白还可以激活线粒体易位的伯灵顿(28]。
在目前的研究中,蒜素激活一种蛋白激酶,P53,和物(c-Jun)通路在人类phospho-kinase SKOV3细胞阵列分析;然而,控制信号的信号是弱,极强的(补充数据)。因为物通路是小说在此设置,找到我们在这项研究集中在物通路,物激活模式进一步证实了免疫印迹。随后物激活诱导线粒体伯灵顿易位和释放细胞色素从线粒体细胞溶质。SP600125能明显阻止这些行为。此外,Bcl-xL略微下降的表达与大蒜素治疗后(数据没有显示)。这些结果表明,caspase-independent通路参与allicin-induced细胞凋亡。总之,我们的数据提供了新的证据表明大蒜素可以激活物通路,从而导致线粒体伯灵顿易位和线粒体释放细胞色素,从而诱导SKOV3细胞凋亡。
利益冲突
作者声明没有潜在的利益冲突对本文的作者和/或出版。
确认
这项工作是支持的资助中国国家高技术研究发展计划(863计划,没有。2014 aa093501)和中国国家自然科学基金(项目号。30672742,30672742,30930113)。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表或论文的准备。凌许博士和金余co-first作者。
补充材料
补充数据。人类phospho-kinase数组化验的结果。
蒜素激活AKT、P53和物(c-Jun)通路SKOV3细胞被人类phospho-kinase阵列分析。如图所示,第一张照片是负控制而第二个蒜素(12.5μg /毫升)干预组;因此,AKT和P53的信号弱两张照片之间的不同;然而,物的信号非常增加蒜素组比消极的控制。因此,物途径是小说的发现在这个设置。