文摘
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)单链RNA病毒,会造成致命的腹泻综合症,呼吸道疾病和生殖障碍的牛群。在过去的几年中,它已经逐渐浮出水面,BVDV感染率增加,很可能需要BVDV的有效疫苗。在这项研究中,转基因黄芪作为另一种糖蛋白的表达E0生产平台。糖蛋白E0转基因表达的免疫原性黄芪中检测出鹿。pBI121-E0的存在证实了聚合酶链反应(PCR),验证了转录逆转录- PCR (RT -),证实了和重组蛋白表达ELISA和免疫印迹分析。鹿,皮下注射免疫与转基因植物疫苗的发达对BVDV特定的体液和细胞免疫反应。这项研究提供了一种新的方法对弱免疫原性蛋白作为一种转基因植物疫苗的一部分。
1。介绍
牛病毒性腹泻(BVD)是一种普遍的疾病,影响牛(1]。病原体是牛病毒性腹泻病毒(BVDV)瘟病毒属同属黄病毒属。BVDV感染提供了一个广泛的疾病,包括从轻度急性感染致命的粘膜病(2]。已知病毒破坏受感染动物的免疫系统,从而使动物更容易受到其他疾病,对畜牧业造成重大损失3- - - - - -5]。之间的病毒可以感染和传播各种各样的动物,如牛、羊、和白尾鹿鹿6- - - - - -9]。在我们之前的研究中,提出了一种新的单应变BVDV CCSYD孤立从梅花鹿和验证10]。
不同的策略可以控制在一群BVDV的传播,如疫苗和test-and-cull方案。在这些策略,test-and-cull计划非常成功地应用于牛低密度和低BVDV流行的地区,如斯堪的纳维亚(11,12]。但在牛密度和高BVDV高流行的地区,该计划将带来巨大的经济损失。疫苗研究被认为是一个有前途的替代,以防止BVDV蔓延。灭活疫苗一般具备有效性不足,不引起足够的保护性免疫。尽管修改活疫苗提供某些保护同源菌株,毒力回归的内在风险仍然是一个问题(13,14]。由于穷人灭活疫苗的免疫原性和周围的安全问题使用修改后的活疫苗,BVDV的有效亚单位疫苗已经成为越来越多的研究兴趣的主题(15]。
BVDV单链RNA病毒,大约12.5 kb RNA基因组(16)和BVDV的基因组是翻译和加工成11成熟的蛋白质。感染或疫苗接种后,牛三个膜蛋白引起抗体E0、E1, E2和非结构蛋白NS3(17]。糖蛋白E2的主要目标是抗BVDV感染引发的保护性免疫反应和广泛用于亚基疫苗(18,19]。然而,高度可变的E2蛋白序列往往导致免疫失败(20.,21]。
E0是一种守恒的蛋白抗原多样性并显示低于E2 (22]。然而,BVDV E0表达原核生物系统产生中和抗体,但在低浓度不能有效地中和病毒,这是归因于E0的错误折叠17]。认为真核表达可以保持蛋白质的正确折叠和糖基化,真核表达已经成为研究焦点在亚单位疫苗的研究。去年,高et al。23)成功地构建原核表达载体PVAX1-E0并确定其抗原活动兔子。结果表明,重组PVAX1-E0可以产生特定的体液和细胞免疫反应在兔子。转基因植物是新的真核expression-delivery系统已成为有吸引力的生物反应器生产高价值医疗肽和蛋白质(24]。到目前为止,几种类型的植物物种被用作亚单位疫苗antigen-delivery系统(25,26]。例如,截断糖蛋白BVDV E2被表达n .烟草叶子和随后显示,病毒中和试验(高反应活性27]。
提高疫苗的免疫活动的另一个策略是使用佐剂(28]。疫苗佐剂可以刺激免疫系统增加特定的抗体反应。黄芪(黄芪)是一种植物作为一种传统的中草药在中国,并以其抗病毒活性和促进免疫属性(29日- - - - - -31日]。黄芪多糖能提高巨噬细胞的功能,提高巨噬细胞吞噬作用,增加自然杀伤(NK)细胞的活动(32]。黄芪寄主植物可以发挥作用的免疫佐剂增强免疫水平。
在这项研究中,植物表达载体pBI121-E0构造和转入黄芪。重组蛋白的免疫原性和保护效果中演示了鹿。本研究的目的是开发一个转基因黄芪牛病毒性腹泻疫苗。
2。材料和方法
2.1。试剂、细菌和质粒
的质粒pMD18-T-E0是在我们以前的工作23]。的大肠杆菌应变DH5α从英杰公司购买(上海,中国)。质粒pBI121 (Novagen,达姆施塔特,德国)是用于重组蛋白表达。限制性内切酶,Taq DNA聚合酶,TriPure装备,和T4连接酶从豆类购买生物技术有限公司,大连,中国。
2.2。质粒构建
BVDV E0开放阅读框放大从质粒pMD18-T-E0包含完整的基因与正向引物(5′ccG手枪CCCCA TGG AAA ACA TAA CAC AGT GG-3′,BamHI网站强调)和反向引物(5′gcG AGC TCT TAA GCG答GCT CCA AAC CAC GT-3′,尚驰网站强调)。PCR产品消化了BamHI和尚驰和插入植物表达载体pBI121消化的酶来创建重组质粒pBI121-E0。
2.3。植物转换和遗传分析
的黄芪(费)。Bungevar。mongholicus(Bunge) p . k .萧种植在我们的实验室是用作寄主植物。转换实验是在7月中旬进行。20 h人工授粉后(33),150年μL质粒pBI121-E0 (1 - 2 ng /μL)是应用于耻辱均匀使用微量吸液管。在成熟阶段,种子收获和储存在室温下。转基因幼苗被确定通过PCR和rt - PCR分析正向引物5′20手枪CCA CCA TGG AAA ACA TAA CAC AGT GG-3′和反向引物5′GCG AGC TCT TAA GCG答GCT CCA AAC CAC GT-3′。
2.4。蛋白质的提取
使用0.5 g蛋白隔离进行了新鲜的叶子的再生苗迅速在液态氮。由此产生的粉末是resuspended 1毫升(0.24 g / L KH提取缓冲2阿宝4,1.44 g / L Na2HPO40.2 g / L氯化钾8 g / L氯化钠,10μPMSF g / mL亮抑酶肽,5毫米,50毫米EDTA, pH值7.0 - -7.2)如前所述27]。混合物在12000 g离心20分钟在4°C,和布拉德福德的蛋白质浓度测定蛋白质测定(34在1毫升的上层清液使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准。
2.5。酶联免疫吸附试验(ELISA)
为了说明糖蛋白的表达E0, ELISA。ELISA试验板涂层在4°C与90年在一夜之间μ(包含30 L蛋白样品μ从转基因g总蛋白提取黄芪)稀释10μL涂层缓冲区(pH = 8.0)。去除液体后,盘子都洗了三次磷酸盐(PBS)和渐变20 (PBST)和阻塞在37°C和10%的马血清1 h。然后,BVDV-positive牛血清稀释(1:20)添加到盘子和孵化1 h在37°C。然后,盘子被孵化1 h与辣根过氧化物酶在37°C(合)共轭兔子anti-bovine免疫球蛋白g(1: 5000稀释)作为二级抗体。基质添加颜色反应15分钟在37°C,通过添加2 M H反应终止2所以4(50μ信用证)。吸光度是检查使用ELISA读者在490海里。
2.6。免疫印迹分析
为了进一步证明转基因表达的糖蛋白E0的免疫活动线路,重组蛋白免疫印迹分析探测到。总可溶性蛋白(60μg)从新鲜的叶子中提取转基因黄芪受到在12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)和转移到硝酸纤维素(美国通用电气医疗集团)。使用BVDV-positive牛血清进行免疫印迹(1:100稀释)和HRP-conjugated兔子anti-bovine免疫球蛋白g(1: 5000稀释,南方生物技术,美国中小学抗体,分别。从野生型的总蛋白提取黄芪负控制和糖蛋白E0表达小仓鼠肾- 21(博鸿泰)细胞(23作为一个积极的控制。
2.7。道德声明
所有的鹿都来自东大鹿工业有限公司,有限公司在梅花鹿鹿及保养吉林农业大学农场和权限进行这项工作被授予吉林省畜牧业管理局的(导演Shaoxian Liu)。批准的研究也是吉林农业大学动物伦理委员会和国家鹿产业协会中国畜牧业协会(CAAA)。在采样之前我们麻醉鹿。血液采样由兽医,生物学家,与先前的培训和经验或技术人员在这些程序。我们收集到2毫升的血液通过颈静脉。所有手术在戊巴比妥钠和执行是努力减少痛苦。最后,所有的鹿没有牺牲。
2.8。免疫接种程序
三十健康,该部雄性梅花鹿被随机分为5组(每组6只鹿)。准备的疫苗(如前所述)(27]。简而言之,montanide ISA 70 SEPPIC和Al (OH)3水凝胶作为疫苗佐剂在石油和水疫苗。和佐剂抗原的比率40:60 - 90:10,分别。鹿在第一组免疫皮下注射1毫升制定疫苗含有100μ从转基因g总蛋白提取黄芪;制定集团两个免疫南卡罗来纳州1毫升水包含相同剂量的疫苗的蛋白质提取转基因黄芪。组三组四个充当消极组;鹿在两组免疫南卡罗来纳州与疫苗1毫升油和水疫苗包含100μ从野生型g总蛋白提取黄芪,分别。组5 100 TCID南卡罗来纳州注射50灭活BVDV疫苗(购自中国兽药控制室)。进行第二次免疫组14天。收集血液样本的免疫(0)天7天,14日,21日,28岁,35岁,和第一次免疫后42。血液中血清用于淋巴细胞胚芽生殖试验和ELISA试验。
2.9。特定的抗体在免疫测定鹿
血液从梅花鹿与涂料稀释(1:40)缓冲(pH = 8.0)和加入微量滴定板(100μ信用证)。微量滴定板涂了2 h在37°C。去除液体后,盘子洗了三次PBST阻塞和10%马血清2 h在37°C。然后,100年μL可溶性全病毒抗原(包含100μ从C g病毒蛋白)中提取24V BVDV(购自中国兽药研究所控制)添加到盘子和孵化为2 h 37°C。盘子被洗了三次PBST和孵化与100年1 h在37°CμL BVDV-positive牛血清(1:200稀释)。HRP-conjugated兔子anti-bovine免疫球蛋白g(1: 5000稀释)作为二级抗体。基质添加促进颜色反应15分钟在37°C和反应被终止的2 M H2所以4(50μ信用证)。光密度(OD)评估在490海里。
2.10。淋巴细胞胚芽生殖化验
外周血单核细胞分离实际上颈静脉血液之前报道(见图4)[35]。超过95%的细胞淋巴细胞。细胞的生存能力是检查台盼蓝染料排斥试验和细胞在罗斯威尔公园resuspended纪念研究所中(RPMI) 1640,补充10%胎牛血清,100国际单位/毫升青霉素(σ),和100毫克/毫升链霉素(σ)。这些细胞被置于96孔圆底板块在4×10的浓度6细胞/ (100μL)和有或没有BVDV孵化(104TCID50 /)在hexaplicate 37°C下5%的股份有限公司2。Phytohaemagglutinin (PHA)(σ)5毫克/毫升被用作积极控制。40至48小时孵化后37°C下5%的股份有限公司2(3)- 4 5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)被添加到每个细胞培养4 h。之后的100年μL二甲亚砜(DMSO)对每个停止显色,盘子在其570海里。
2.11。统计分析
多个组比较进行使用单向方差分析(方差分析)其次是图基的测试以检测组间差异。GraphPad棱镜软件(版本5.0;圣地亚哥GraphPad软件公司CA)被用来执行统计分析。的值被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。基因鉴定转基因黄芪
确认E0基因整合到转基因苗的染色体基因组DNA和总RNA从转基因被孤立黄芪并通过PCR和rt - PCR检测。正如所料,具体的债券706个基点被发现在所有组除了负对照组(数字1(一)和1 (b))。
(一)
(b)
3.2。E0的表达蛋白转基因黄芪种子
ELISA试验是用来确定糖蛋白E0在转基因的表达黄芪。转基因的OD490值黄芪组类似于积极的团体,但明显高于阴性组(图2(一个))。揭示了糖蛋白E0转基因中高度表达黄芪。进一步证实E0的免疫活性蛋白,免疫印迹分析。特定频带的50 kDa对应于糖蛋白E0中检测出coomassie蓝色凝胶分析(图2 (b))和免疫印迹的样品和积极控制如图2 (c)。正如所料,它没有发现消极的控制。
(一)
(b)
(c)
3.3。鹿血清抗体和细胞免疫水平的检测
免疫血清抗体水平的鹿,ELISA检测结果如图所示3。在接种之前,没有发现显著差异在所有组。但是,免疫血清的鹿前七天,石油疫苗组的血清抗体,水疫苗组和灭活BVDV疫苗组明显高于阴性组()。抗体水平增加在所有组与免疫时间,除了消极组。增加免疫时间,鹿BVDV灭活疫苗组的抗体水平达到峰值后35天的免疫接种,而石油疫苗组和水疫苗组42天后到达峰值。这表明石油疫苗和水从BVDV感染疫苗给鹿不再保护。
评价细胞介导免疫反应,收集血液样本后42天免疫和检测淋巴细胞增殖反应。如图3,结果表明,淋巴细胞存在于血液从鹿接受转基因黄芪植物上大幅激增引发刺激BVDV抗原(图3)。这个特定的扩散没有消极组接受是非叶子(图3)。结果是对应PHA-induced淋巴细胞增殖的结果。这表明BVDV-E0具体延长细胞介导免疫反应与E0转基因鹿皮下注射免疫黄芪植物的叶子。
4所示。讨论
BVDV感染牛发病率和经济损失的一个重要原因。据估计,BVD生成一个负面经济影响乳制品操作(20美元和160美元之间每年成年牛)(36]。开发有效和廉价的疫苗对保护动物抗BVDV感染至关重要。随着基因分子生物学和植物生物技术的发展,植物已成为一个新的平台,与植物疫苗抗原蛋白的生产和交付。植物疫苗提供了几个优势等传统疫苗缓解交货,粘膜的功效,安全,快速的可伸缩性和低成本。然而,还没有报道E0植物糖蛋白的表达。这个实验成功收购了糖蛋白E0 BVDV在转基因黄芪通过花粉管通道。这是第一个报告E0在药用植物糖蛋白的表达。
病毒糖蛋白E0有几个功能,如附件,进入靶细胞和中和抗体的生产,以及有影响的致病性BVDV [37,38]。糖蛋白E0由227个氨基酸组成和等电点为7.6139]。守恒的蛋白质,E0显示不如E2抗原多样性。然而,作为BVDV抗原,E0仍有许多缺陷。例如,E0许多糖基化网站,对蛋白质的正确折叠和活动维护很重要,同时也表现出弱免疫原性。在这项研究中,转基因黄芪已成功用于生产糖蛋白E0的平台,这使我们能够克服以上的缺点。黄芪提取作为疫苗佐剂显著提高E0亚单位疫苗的免疫活动。因此,植物糖蛋白E0有能力生成一个梅花鹿免疫反应。这项研究提供了一种新的方法对弱免疫原性蛋白作为转基因植物系统的候选疫苗的使用。
利用转基因植物作为亚单位疫苗的新antigen-delivery系统越来越多的探索(40]。黄芪具有免疫调节作用,黄芪寄主植物可以发挥作用的免疫佐剂增强免疫水平。植物可以大批量生产,廉价的抗原的来源,和亚单位疫苗的理想系统。这项研究提供了新的思想转基因药用植物疫苗的发展。
5。结论
总之,糖蛋白E0实际上转基因表达黄芪。鹿皮下注射免疫(南)转基因植物疫苗可以对BVDV开发特定的体液和细胞免疫反应。这项研究为药用植物疫苗的开发提供新思路。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Yugang高和赵Xueliang贡献同样这项工作。
确认
作者欣然承认金融支持提供由中国国家自然科学基金(31070316)、中国科学技术部(2011 bat03b01),和吉林省科学技术厅(2010 b10010945, 20110228,, 20112101)。