文摘

首先血管系统(pv)漂浮在淋巴流体大多被观察到在大口径管道尾腔静脉和胸导管的兔子,老鼠,和老鼠。但是没有追踪pv淋巴结。尚未建立pv离开淋巴血管是否通过淋巴血管壁或进入淋巴结。因此,观察pv进入淋巴结,例如,腋窝节点,是可取的。在当前的工作中,我们追踪pv靠近腋窝的表面节点的一只老鼠。本研究使用的方法是基于最近开发的方法来检测的pv腹股沟,腋窝淋巴结的淋巴管道在一只老鼠的皮肤注入阿尔新蓝腹股沟节点。然而,阿尔新蓝模糊附近的淋巴结和跟踪的pv淋巴结已不可能。当前的方法显示接近腋窝pv节点。

1。介绍

虽然第一血管系统(pv)最初注意到五十多年前(1,2),其确认只是最近因为没有方法观察原始文献中被描述。pv有几个子系统,其中一个是在皮肤和自称是解剖结构对应穴位和经络1,2]。其他子系统至少直接或间接影响了针灸治疗,因为他们是连接到针灸经络作为整个循环系统的部分,根据金(pv1]。在其他子系统有淋巴导管的pv漂浮在液体2]。最近,这个lymph-associated pv (L-PVS)是广泛的研究通过使用几种方法与各种染料:兔子,它研究了染料杰纳斯绿B (3和阿尔新蓝4,5),用光学方法没有注射染料(6]。在老鼠的情况下,研究了磁性荧光纳米粒子(7)和阿尔新蓝染色(8),在Prox1-GFP转基因老鼠的情况下,研究了没有注入染料(9]。一个罕见的病例是第一船的淋巴血管来自肿瘤异种移植的腹侧皮肤鼠标(10]。这种情况下是一个加强的例子的推测作用pv癌症转移(11]。

最近,pv是第一次观察到淋巴管道运行从腹股沟到腋窝淋巴结的皮肤注入阿尔新蓝腹股沟淋巴结(12]。这是一大进步,它已成为可能的观察L-PVS很长一段时间没有严重的手术,因为它只需要一个窗口系统观察淋巴在皮肤上。这种监测将导致生理周期初代细胞的理解节点,所声称的金(2]。

然而,它不是第一船是否显示出来的淋巴血管通过淋巴墙或继续进入淋巴结因为淋巴结附近的阿尔新蓝模糊,因此明确淋巴结附近的跟踪是不可能的。在当前的工作中我们发现另一种染料,1,1′-dioctadecyl-3, 3、3′′-tetramethylindocarbocyanine高氯酸(DiI),工作更好地跟踪第一船腋窝淋巴结的表面。因此,第一次L-PVS靠近腋窝节点显示。因为在以前的作品,L-PVS没有追踪到节点(3- - - - - -10,12),目前的工作是一个重大进展完成跟踪L-PVS的淋巴系统。

可能的医学意义pv是由丰富的免疫细胞的观察L-PVS [8]。透明质酸和荷尔蒙肾上腺素和去甲肾上腺素的pv,早些时候声称,金正日et al。2,8,13),确认。此外,L-PVS癌症的作用通过淋巴道转移(10,11)是一个重要的问题。

2。材料和方法

2.1。制备的动物

十个男性Sprague-Dawley (SD)大鼠(6周)从DooYeol获得生物技术(首尔,韩国)。动物们被安置在恒温恒湿条件下(23°C,相对湿度:60%),12小时/ 12小时光/暗周期和提供水或商业的鼠粮随意。老鼠麻醉与聚氨酯(1.5 g / kg)和甲苯噻嗪(20毫克/公斤)肌肉内的管理,使所有外科手术在全身麻醉下进行。程序涉及的动物和他们的护理是完全符合当前国际法律和政策(指导实验室动物保健和使用的,国家科学院出版社,1996年)。实验机构伦理委员会批准的先进技术研究院收敛(批准文号:WJIACUC20130212-1-07)。

2.2。可视化和DiI恢复最初的血管系统

DiI粉(西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)溶解在99.9%酒精使股票的解决方案,是保存在冰箱(4°C)后与铝箔包装,避免光照。染色染料是工作的解决方案,是由股票的解决方案(10μL与1毫升70%酒精稀释)。

一个切口在皮下层的皮肤白线进行手术剪刀,和切割皮肤弯曲回暴露目标腹股沟淋巴结。DiI是注入的腹股沟淋巴结。注射针是一个玻璃微细管固定1毫升注射器(计26)。

为了帮助染色剂从淋巴导管,彻底清洗的自然循环淋巴流体必须保持尽可能多的。必要的一件事是保持正常体温的老鼠。为此,覆盖论文组织的老鼠是一个简单但有效的方法。两小时后染料注入,河鼠处于静止状态,以允许L-PVS吸收染料和被淘汰的自然淋巴流。目标之间的腹股沟和腋窝淋巴结淋巴导管老鼠被暴露在检测L-PVS。观察和操作的所有程序下进行立体显微镜(SZX12、奥林巴斯、日本)。

2.3。观察恢复最初的血管系统

为了检测L-PVS在活的有机体内组织中,我们使用一个荧光显微镜(MVX10、奥林巴斯、日本)的激发波长滤波器= 530 ~ 555 nm和吸收滤光片= 570 ~ 625。DiI的最大吸收和发射波长550 nm和567 nm,分别。淋巴导管及其L-PVS拍摄,图像被显示在监视器(C240P4QPYEW100、飞利浦、日本)。周围的脂肪组织与microforceps必须被删除。尽管淋巴导管橙色由于未洗的残余染料,L-PVS发红更强烈,从而揭示它的存在。

彩色L-PVS后淋巴导管被观察到,老鼠被牺牲了心脏内的注入聚氨酯(1毫升)。一块淋巴导管,包括彩色L-PVS被切断的microscissors老鼠荧光组织显微镜下。这是放在载玻片1 x PBS和观察相衬显微镜(BX51TRF、奥林巴斯、日本)。标本固定10% NBF和保存在一个冰箱在4°C。

形态分析,第一船从淋巴导管中提取。核和f -肌动蛋白染色的细胞,4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)和phalloidin,分别。与300 nM DAPI染色标本(D1306,表达载体,密苏里州,美国)20分钟和6.6的解决方案μphalloidin 488 (A12379表达载体,密苏里州,美国)解决方案30分钟。标本被洗后覆盖安装解决方案。相差显微镜下的染色标本研究(BX51TRF、奥林巴斯、日本)。

3所示。结果

的基本形态数据初淋巴管和血管中观察到当前使用DiI总结在表1。初淋巴和血管的直径是155.4±103.7μm和41.4±31.5μm,分别。这些数据与先前的报道是一致的初淋巴血管(12]。

pv是观察皮肤淋巴导管沿上腹船从腹股沟到腋窝淋巴结(图1(一))。腹股沟节点由于注入的DiI明亮,就像传出淋巴管道由于DiI流动。腋窝节点也是明亮的由于DiI到达通过淋巴导管,在这个数字几乎没有见过。马赛克图像捕获整个淋巴导管显示第一船(图中右边的窗格1(一))。一部分是放大证明第一船清晰可见,但淋巴管道平行上腹部血管是不可见的,因为它不是彩色的DiI(图1 (b))。

图2显示的腋窝淋巴结淋巴导管进入。淋巴管道合并膜的节点。在图2(一个),白色的曲线显示淋巴导管内的pv。pv是白人,因为立体显微镜是配备了b / w CCD相机(MVX 10,奥林巴斯),这引起了DiI的荧光。淋巴后的pv也支分支。相同的节点(右边的图2 (b))及其相关的节点(左边)相衬显微镜下观察。DiI是红颜色的荧光。这个节点左边显示pv分支,分支后淋巴导管,之前进入淋巴结。

在以前的工作12),与立体显微镜拍摄的图片,但是,在当前的工作中,第一船只是用荧光显微镜观察。一个孤立淋巴导管与NBF固定,把载玻片上,用相差显微镜观察没有荧光(图3(a))。第一船可辨认的但不能明确确定。相同的样本观察相同的显微镜,但与荧光滤光片,第一船出现明显(图3(b))。这个数字还表明,淋巴的墙上有一个很弱的荧光。

图4(一)显示杆状核与DAPI染色是对齐的纵向平行于第一船。核的长度在10到20之间μ米,如预期(1]。phalloidin染色信号f -肌动蛋白的细胞(图4 (b))也沿着船的方向一致。

4所示。讨论

首先血管的直径,观察到血管,大脑器官表面,在心室是20 - 30左右μm。有时观察到的直径比正常的值更大,这可能是由于其他附加到第一的船只残骸,如阿尔新蓝染色用例所示(12]。

我们检查了样品识别第一船。第一船的标志是分布的形状和长度,以及细胞核。另一个特点是f -肌动蛋白的模式。这两个特性是在良好的协议与以前的pv报道工作(12]。

pv的腹股沟,腋窝淋巴结的淋巴管道首次发现并确认在之前工作的帮助下阿尔新蓝(12]。但淋巴结的详细方法不是研究,因为阿尔新蓝都是模糊的表面附近的淋巴结。在当前的工作,另一个染料,使用DiI,这清楚地显示,第一船靠近腋窝的表面节点。因此,我们建立的第一船不出来淋巴血管通过淋巴墙但进入淋巴结。这项工作将有助于进一步追踪pv的淋巴结需要另一种方法,因为当前和以前的染色方法不能使用在一个淋巴结。因为我们有精确的信息通过这个实验的第一船进入淋巴结的组织学调查这部分我们可以应用一个淋巴结。

可能相关性对针灸,L-PVS显示是连接到器官表面pv是分布在内脏器官的表面(6]。另一方面,器官表面的pv的阿尔新蓝流动注射到老鼠的穴位肾俞14]。因此,连接L-PVS的穴位组合显示两个实验。更多的实验显示第一的流体的流动从穴位L-PVS非常可取的。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

张苏许多公园和Byung-Soo也同样这项工作。

确认

这项工作是支持的部分资金从韩国传统医学R & D项目,健康和福利,大韩民国(B110076)和基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由科技部,ICT和未来规划(批准号2013 r1a1a2008343)。作者感谢劳伦女士禁止使用Alphascan显示她的帮助。他们感谢WOOJUNG BSC的动物保健服务公司。

补充材料