文摘

番木瓜广泛应用于民间医学草药来预防,预防和治疗一些疾病。这些疗效是基于在植物的不同部分的植物化学的营养物质具有抗氧化效果。种子是利用部分越少;因此本研究的目的是评估抗氧化活动c .木瓜种子水提取物对过氧化氢(H2O2)在底特律550年人类皮肤成纤维细胞氧化应激。c .木瓜种子水提取物是没有毒的,作为一个有效的自由基清除剂,提供保护底特律550成纤维细胞经历了H2O2氧化应激。数据显示,(i)的最大保护作用是通过同时提取与管理1毫米H2O2;(2)的提取存在的氧化应激不会增加过氧化氢酶活性和防止细胞色素C的释放和内线粒体跨膜电位 损失;(3)提取比维生素C更高效阻碍氧化损伤;(iv)种子水提取物的纯化小分支施加相同的整个提取物的抗氧化作用。总之,c .木瓜种子水提取物对于防止氧化应激可能是有用的。

1。介绍

氧化应激,基于不平衡prooxidants生产和抗氧化防御系统,参与衰老过程和在一些人类的慢性疾病,例如癌症、动脉粥样硬化、冠心病、视网膜黄斑变性、阿尔茨海默氏症、炎症和肺气肿(1]。维生素C和E, 单宁-胡萝卜素、类黄酮、花青素等酚类化合物是植物衍生化合物与清除自由基和抗氧化活动代表一组特殊的营养补充剂。富含这些抗氧化剂的食物中扮演着重要角色在氧化应激的基础疾病的预防2,3]。

木瓜(番木瓜),一个家庭成员番木瓜科,是一种热带水果富含膳食抗氧化剂(维生素C、生育酚、总酚类、和 胡萝卜素)[4与抗氧化活性和生物活性物质(异硫氰酸苄酯)5]。的不同部分c .木瓜(叶子,叫,根,乳胶,水果,鲜花,和种子)用于民间药物来治疗各种疾病(6]。一些科学研究验证这些传统使用证明c .木瓜(即显示广泛的治疗活动。,antiprotozoal, antifungal, antibacterial, antiviral, anti-inflammatory, antihypertensive, hypoglycemic and hypolipidemic, wound healing, antitumor, neuroprotective, diuretic, abortifacient, and antifertility) [6,7]。这些特性主要取决于一些次级代谢产物的抗氧化活性中c .木瓜器官。抗氧化营养素的研究c .木瓜导致识别的主要化合物不同在不同的器官。整个水果提取物中含有阿魏、p-coumaric和咖啡酸、类胡萝卜素和维生素C,共同保护人类细胞免受氧化压力(4),促进伤口愈合和皮肤修复(8,9];叶萃取精华含有叶酸,维生素B12和C,生物碱、皂甙苷,单宁和类黄酮(10与抗癌活性[]11,12]对饮酒导致的氧化损伤和保护胃粘膜的13];种子提取物中含有不同的酚类化合物、香草酸、和维生素C具有抗氧化14- - - - - -17和抗癌5)活动。因此,c .木瓜提取物可以作为一个协同治疗膳食补充剂的患者氧化应激相关疾病或可能被添加到配方,促进伤口愈合。即使文献资料报道木瓜水果预防H2O2全身的氧化损伤是引人注目的,到目前为止,没有研究探讨类似木瓜种子水提取物的抗氧化活性。事实上,水提取物的优点,以防止有害化学物质的使用。值得注意的是,种子代表了浪费的消费木瓜水果,不仅食物,也为医疗准备原材料。因此,本研究的目的是调查的抗氧化活性c .木瓜种子水提取物在550年底特律人类皮肤成纤维细胞的氧化应激引起的过氧化氢(H2O2)。是特别注意的方式管理和评价最高的抗氧化作用c .木瓜种子水提取物取决于整个粗提物或特定的小分支。

2。材料和方法

2.1。化学物质

提供的所有化学试剂均为分析纯和Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国),除非另有指示。

2.2。c .木瓜种子水提取物制备和分离

从成熟的种子被移除c .木瓜水果,用水冲洗,在室温下晾干(RT)。10 g的种子在砂浆地面,和粉在注入了24小时(小时)在500毫升无菌蒸馏水rt,原油提取是进行短期(800克)获得一个小球代表浪费种子。除非另有指示,成纤维细胞治疗1,2,4,8,或24小时1或2毫克/毫升(w / v,在培养基)的上层清液的存在与否prooxidant h(1毫米2O2)有或没有一个已知的抗氧化剂(50,100年,150年,200年和250年μ维生素C)。

测试的有效性提取小分支,整个原油提取受到短运行4236年离心机(贝克曼库尔特公司,沥青、钙、美国)。特别是,最后获得的上层清液离心机在使用4750克100000克Centricon离心过滤装置与一个Ultracel YM-10(美国默克密理博,Billerica的)再生纤维素膜超滤,允许到众议院与分子量的物质 kDa,而物质 在参议院kDa收集。获得的颗粒被添加到纤维母细胞为了获得1毫克/毫升(w / v,培养基)最终浓度。在图1,详细的部分过程。


图1
差速离心的原油c .木瓜种子水提取物。原油提取是进行短期在800克4236离心机(贝克曼库尔特公司,沥青、钙、美国)获得第一粒和上层清液,进一步在16000 g离心获得第二个小球和上层清液。第二个上层清液离心机在100000 g获得第三粒和上层清液。最后一个浮在表面的离心机在使用4750克Centricon离心过滤装置与一个Ultracel YM-10再生纤维素膜超滤,允许到众议院与分子量的物质 kDa,而物质 kDa收集在参议院(美国默克密理博,Billerica的)。
2.3。细胞培养和治疗

人类皮肤底特律550成纤维细胞从Centro购买Substrati Cellulari(史Zooprofilattico Sperimentale,布雷西亚,意大利)和培养75厘米2水瓶(磐城、东京、日本)的细胞密度106成纤维细胞/毫升鹰的最低基本培养基(EMEM)厄尔的平衡盐(Cambrex生物科学、Verviers、比利时),补充10% (v / v) heat-inactivated胎牛血清(Cambrex), 2毫米谷酰胺(Cambrex), 100国际单位/毫升penicillin-streptomycin, 10000国际单位/毫升制霉菌素(抗真菌的解决方案)(Cambrex)公司在湿润的气氛中为5%2在37°C。培养基是改变每2天。

prooxidative压力被孵化诱导成纤维细胞与1毫米H2O21 h在37°C单独或结合1或2毫克/毫升(w / v,在培养基)c .木瓜种子水提取物或维生素C(50、100、150、200和250μ米)。c .木瓜提取或维生素C与H。同时添加到培养基2O2和/或在复苏期间(1 h)的新媒介在37°C。

2.4。细胞生存能力和形态

MTT试验。细胞生存能力是由3 - 4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)染料线粒体减少生活成纤维细胞根据Sladowski et al。18]。简单地说, 成纤维细胞与肝癌和1毫克/毫升的孵化准备补充EMEM培养基,在37°C和5%为2 h有限公司2;成纤维细胞与0.2洗了三次磷酸缓冲盐(PBS) pH值7.4,和减少MTT甲瓒晶体水溶性与二甲亚砜(DMSO) (Carlo Erba、米兰、意大利)。光学密度(OD)读的分光光度计(Ultrospec 4000紫外/可见分光光度计,法玛西亚生物技术,斯德哥尔摩,瑞典)在570海里。

光学显微镜。生活形态变化研究了成纤维细胞,倒置光学显微镜(LM) Eclipse TS100(尼康、川崎、神奈川县、日本)。成纤维细胞,用0.2 PBS pH值7.4和福尔马林固定的4% (v / v, 0.2 M PBS pH值7.4),橡胶刮,沉积在幻灯片。Haematoxylin-eosin(圆))染色幻灯片80 LM Eclipse下检查我的得分(尼康)细胞凋亡,坏死,或有丝分裂数至少500 50 - 100大功率微观领域的成纤维细胞(0.25毫米2)。

电子显微镜。超微结构的细胞是通过常规透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)。 成纤维细胞与0.2米PBS pH值7.4和橡胶刮洗与2.5%戊二醛固定(v / v, 0.1米甲次砷酸盐缓冲pH值7.4)1 h在冰的温度。一个广泛的洗涤后,成纤维细胞与1% OsO后缀4(w / v, 0.1米甲次砷酸盐缓冲液pH值7.4)1 h在4°C。成纤维细胞脱水,嵌入在性欲的树脂(TAAB实验室设备有限公司、奥尔德马斯顿、英国),并分析了在CM12 TEM(飞利浦,阿姆斯特丹,荷兰)操作在80千伏。OsO整除的1%4后缀成纤维细胞脱水用临界点干燥器020(鲍尔泽、鲍尔泽、列支敦士登)stub-mounted,金色涂布用鲍尔泽溅射涂布机040年之前XL20扫描电镜下观察(飞利浦)操作15千伏。

2.5。过氧化氢酶活性

过氧化氢酶(EC 1.11.1.6。;2 h2O2氧化还原酶)活力测定,成纤维细胞与0.2 PBS冲洗三次pH值7.4,橡胶刮、离心机在450 g 7 - 10分钟在4°C,而悬浮在1毫升的冷缓冲区(50毫米磷酸钾pH值7,包含1毫米EDTA)。 冰成纤维细胞是用四个周期(振幅的40%,10 s(声波降解法,5 s的停顿)(Bandelin电子Sonoplus超声均质器HD 2070年,柏林,德国)然后离心机在10000克15分钟在4°C。过氧化氢酶活动确定后上层清液通过FR20工具包制造商的指令(牛津大学生物医学研究,牛津,美国)。

2.6。诱导细胞凋亡

成纤维细胞与10诱导细胞凋亡μg / mL嘌呤霉素(PMC培养基)在37°C 6 h有限公司5%2调湿大气或10−2米环己酰亚胺(CHX培养基)24小时跟着复苏的新媒介1 h在37°C的额外5%的股份有限公司2湿润的气氛,在没有或在1或2毫克/毫升(w / v,在培养基)c .木瓜种子水提取物。

2.7。(Ca2 +]

成纤维细胞与加载缓冲区(10洗两次7mM氯化钠,氯化钾5毫米,NaHCO 7毫米33毫米CaCl21毫米MgSO4×6小时2玫瑰啊,20毫米,10毫米葡萄糖,1%牛血清白蛋白(BSA)在孵化10的浓度6成纤维细胞/毫升,1 - 4毫米(2 - (4-carboxyphenyl) 6-amino-benzofuran-5-oxy) 2 - (2′-amino-5′-methylphenoxy) ethane-N, N, N′, N′(Fura-2) acetoxymethyl -tetraacetic酸酯为45分钟37°C公司5%2湿润的气氛。两个洗后加载缓冲区,成纤维细胞在相同resuspended刚制成的缓冲最终的浓度 成纤维细胞/毫升和储存在RT之前使用。2毫升的细胞悬液,在37°C prewarmed 20分钟和调整最终的浓度 成纤维细胞/毫升,被放置在一个玻璃试管Fura-2荧光测量与fp - 750荧光谱仪(Jasco欧洲开发。,Lecco, Italy) equipped with an electronic stirring system and a thermostabilised (37°C) cuvette holder and monitored by a personal computer running the Jasco Spectra Manager software for Windows 95 (Jasco Europe s.r.l.). The excitation wavelengths were 340 and 380 nm and the emission wavelength was 510 nm; the slit widths were set to 10 nm. Fluorescence values were converted to 值根据Grynkiewicz et al。19]。

2.8。hsp - 70

诱导胞质热休克蛋白70 (hsp - 70)蛋白的免疫印迹检测总底特律胞质蛋白550成纤维细胞。蛋白质是由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)用12.5%丙烯酰胺凝胶根据Laemmli [20.在硝化纤维纸,然后electrotransferred表(Amersham Hybond-C额外,英国)根据Towbin et al。21]。在电泳、蛋白质(25μg)变性有2% SDS、10%甘油、5% 巯基乙醇,0.05%溴酚蓝在62.5毫米Tris-HCl (pH值6.8)4分钟在95°C。堵塞后25毫米Tris-HCl (pH值8.0)包含3% BSA, 127毫米氯化钠,氯化钾和2.7毫米(TBS缓冲区)和洗涤与含有0.05%渐变20的TBS,硝基床单孵化了单克隆抗- hsp - 70 (1)μg / mL)为2 h rt检测到特定的抗体绑定使用山羊anti-mouse免疫球蛋白g(免疫球蛋白)结合生物素(1μg / mL)、链霉亲和素结合,过氧化物酶(1:1500稀释),和3 - 3′diaminobenzidine (DAB)作为衬底。生物素化的SDS分子量(MW)标准样品和彩色并行运行。 西方的屁股被用作控制肌动蛋白。量化使用gs - 700是由成像密度计(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。

2.9。线粒体跨膜电位

内线粒体跨膜电位的变化( )是由孵化成纤维细胞的荧光探针5、5′,6′6 -tetrachloro-1, 1′, 3、3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine碘(JC-1)(细胞技术,JC-1工具包,山景城,美国)为15分钟37°C在黑暗中。JC-1在DMSO溶液溶解、存储和使用根据制造商的指示。亲脂性的阳离子单体的形式的JC-1仍在细胞质和污渍用绿色,同时与一个完整的二聚的形式进入线粒体膜电位和污迹在红色。样品中的有机溶剂的比例不超过1% (v / v)。成纤维细胞生长在盖玻片迅速冲了0.2 PBS pH值7.4,排水,防止缓冲盐晶体的形成,和风干。完全干后,盖玻片与Histovitrex安装安装介质(卡洛Erba,意大利米兰)和观察这项LM Eclipse 80我(尼康、川崎、神奈川县、日本)配有C-HGFIE Hg precentered纤维照明器(130 W)和数码相机DXM 1200 f通过设置FITC或TRITC过滤器。

2.10。细胞色素C量化

定量测定的胞质和线粒体细胞色素C进行了试验设计的人类细胞色素C TiterZyme酶Immunometric测定(EIA)工具包(试验设计公司,安阿伯市,美国)。成纤维细胞冲洗两次0.2 PBS pH值7.4是悬浮在洋地黄皂苷细胞透化作用缓冲(250 nM蔗糖,137毫米氯化钠,氯化钾70毫米,1.3毫米Na2HPO4,1.4毫米K2HPO4,0.2毫克/毫升洋地黄皂苷,0.1% hydorol M)获得胞质部分的细胞色素C,然后radio-immunoprecipitation化验(里帕)细胞溶菌作用缓冲(50毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值7.4,150毫米氯化钠,EDTA 1毫米,1毫米EGTA,特里同x - 100 1%, 1%钠脱氧胆酸盐,和0.1% SDS)获得线粒体细胞色素C的分数都是孵化与生物素化的单克隆抗体对细胞色素C固定化在微量滴定板1 h。多余的抗体被淘汰和链霉亲和素结合碱性磷酸酶是添加前30分钟的pNPP(对硝基苯磷酸盐)衬底额外的45分钟。颜色生成的反应是在405 nm,使用快速ETI-SYSTEM读者(基于Sorin,维琴察,意大利)。的值被表示为pg细胞色素C的μg总蛋白质。蛋白质浓度测定用Bio-Rad蛋白质化验设备。

2.11。统计分析

数据分析通过执行单向方差分析(方差分析)在95%的置信水平。 值小于0.05被认为是重要的。数据意味着±标准错误(SEs)六个独立的实验都在重复完成。

3所示。结果

3.1。细胞毒性的c .木瓜种子水提取物

c .木瓜种子水提取物初步检测细胞毒性(图2)。在目前使用的两种浓度的提取工作(1和2毫克/毫升)在所有的孵化时间从来不是有毒的。事实上,1毫克/毫升提取增加了大约43%的细胞生存能力控制价值4 h(孵化( ,图2(一个))。同样,他走时彩色控制(图2 (b)(一))和1毫克/毫升提取4 h对底特律550成纤维细胞(图2 (b),(D))表现出相同的轴形状和一个中央大卵圆形核和许多随机分布的丝状伪足和微绒毛在SEM(图更好2 (b),(B) - (E)和TEM(图)2 (b),(C) - (F))的水平。TEM分析允许观察这些胞质突起特别丰富的成纤维细胞和1毫克/毫升的孵化c .木瓜种子水提取物(图2 (b),(C) - (F),插入)。百分比的凋亡、坏死和有丝分裂细胞之间没有修改控制与治疗期间成纤维细胞(图8 h的文化2 (c))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图2
可行性和形态学的底特律550成纤维细胞治疗c .木瓜种子水提取物。(一)通过MTT试验可行性评估。底特律550成纤维细胞治疗1或2毫克/毫升c .木瓜(Cp)种子水提取1,2,4,8,24小时(h)。报告的值的百分比控制未经处理的纤维母细胞被认为是100%。每个值代表均值±SE六个独立的实验中,每做一式两份。单一恒星显示值明显不同于未经处理的控制成纤维细胞( )。两颗恒星显示值从一个明星值明显不同( )。(b) LM (A, D),扫描电镜(b, E), 550年底特律TEM (C、F)显微图成纤维细胞治疗(A - C)或处理1毫克/毫升c .木瓜种子水提取物4 h (D-F)。(D):圆)染色成纤维细胞;酒吧= 20μm。(B, E):酒吧= 5μm。(C、F):插图是一个放大显示微绒毛;酒吧= 5μm。(c)的比例正常,凋亡、坏死,有丝分裂底特律550成纤维细胞治疗后1或2毫克/毫升c .木瓜(Cp)种子水提取1,2,4,8 h。至少500人成纤维细胞为每个治疗得分)彩色幻灯片。
3.2。抗氧化活性的c .木瓜种子水提取物

的抗氧化活性c .木瓜种子水提取物化验在成纤维细胞的H2O2介导的氧化应激诱导。c .木瓜种子水提取物保护成纤维细胞氧化应激的只有当同时添加H2O2(图3(一个))。事实上,细胞生存能力提高extract-treated成纤维细胞对成纤维细胞孵化只有H2O2,从而表明抗氧化活性。然而,提取无法恢复(图中加入时保护成纤维细胞3(一个))。没有发现不同的抗氧化功效之间的两个提取浓度。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图3
抗氧化活性的c .木瓜种子水提取物在550年底特律成纤维细胞。MTT试验(a - b)可行性评估。报告的值作为控制未经处理的纤维母细胞的百分比为100%。(一)底特律550成纤维细胞治疗与1或2毫克/毫升c .木瓜(Cp)与1毫米种子水提取物同时H2O21 h或在经济复苏。单一恒星显示值明显不同于未经处理的控制成纤维细胞( )。550 (b)底特律成纤维细胞与不同浓度的维生素C治疗(C)与1毫米同时H2O21 h或在经济复苏。单身明星表示值明显不同于其他所有人( )。两颗恒星显示值明显不同于那些标有一个明星和同步治疗价值( )。(c)过氧化氢酶酶活性(U /毫升)测量在底特律550成纤维细胞治疗1毫克/毫升的Cp种子水提取物添加同时(s)与1毫米H2O21 h或在复苏(r)。单一恒星显示值明显不同于其他所有人( )。底特律(d)的比例正常,凋亡与1毫米550后成纤维细胞治疗H2O2管理单独或结合1或2毫克/毫升的Cp提取或与Cp提取中加入1 h复苏。至少500人成纤维细胞为每个治疗得分)彩色幻灯片。单一恒星显示一个值从相应的凋亡明显不同于其他所有和未经处理的控制成纤维细胞( )。两颗恒星显示值明显不同于相应的未经处理的控制成纤维细胞和凋亡的( )。每个值代表均值±SE六个独立的实验中,每做一式两份。

的抗氧化活性c .木瓜种子水提取物与著名的抗氧化剂,维生素C(图3 (b))。无毒浓度的维生素C(50、100、150、200和250μ米)被添加到培养基同时H2O2或在复苏。抗氧化剂维生素C的影响比提取不同施加。事实上,维生素C是更有效的阻碍氧化应激后,添加氧化应激同时点火比H2O2以浓度依赖方式(图3 (b))。有趣的是,c .木瓜种子水提取物在绝对是比维生素C更有效保护底特律550年成纤维细胞氧化应激。事实上,细胞生存能力增加9倍和1毫克/毫升c .木瓜种子水提取物(中加入1 h, h2O2孵化)和3倍最有效浓度的维生素C (200μ米中加入复苏)对H2O2单独处理(请对比数据3(一个)和3 (b))。

3.3。过氧化氢酶活性

过氧化氢酶酶是一种最有效的抗氧化分子水解真核生物细胞的H2O2水和氧气。H2O2全身的氧化应激增加过氧化氢酶活性在控制(约1.2倍 ,图3 (c))。同时提取时添加氧化应激,过氧化氢酶酶活性(图类似于控制价值3 (c))。过氧化氢酶活性的降低比H只是部分观察(−10%2O2单独治疗)提取时添加在恢复( ,图3 (c))。

3.4。凋亡的活性c .木瓜种子水提取物

H2O2是细胞凋亡的诱导物的生产活性氧(ROS) (22];这样的能力c .木瓜种子水提取物减少凋亡成纤维细胞的百分比是化验。在图的数据3 (d)。两个浓度的c .木瓜种子水提取物非常有效地减少凋亡成纤维细胞的数量约为30%时添加在H2O2介导的氧化应激( ,图3 (d))。事实上,细胞生存能力与未经处理的(图3(一个))。相反,任何浓度的凋亡效应c .木瓜观察种子水提取物添加在复苏时,不变的生存能力(图所示3(一个)值(图)和凋亡细胞3 (b))与H2O2单独治疗。验证是否c .木瓜种子水提取物对保护通过与氧化应激通路不同,从细胞凋亡诱导成纤维细胞与CHX孵化和PMC能够诱导细胞凋亡,抑制蛋白质合成。数据图4表明,诱导细胞凋亡是不受影响的存在c .木瓜种子水提取物添加同时CHX或PMC治疗(数字4(一)和4 (b))。对比结果中生化和形态分析。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
凋亡的活性c .木瓜种子水提取物在550年底特律成纤维细胞。底特律550成纤维细胞治疗10−2环己酰亚胺(CHX培养基)或10μg / mL嘌呤霉素(PMC培养基)单独或结合1或2毫克/毫升c .木瓜(Cp)提取24或6小时(h),分别。(一)通过MTT试验可行性评估。恒星显示重要的价值与相应24或6 h值( )。(b)正常和凋亡成纤维细胞的百分比。至少500人成纤维细胞为每个治疗得分)彩色幻灯片。单一恒星显示值,从相应的正常或凋亡的显著差异( )。每个值代表均值±SE六个独立的实验中,每做一式两份。

这些数据表明,抑制H2O2介导细胞凋亡并不是对凋亡过程本身,但抗氧化活性的结果c .木瓜种子水提取物。事实上,没有抑制H2O2观察介导细胞凋亡时提取增加了氧化应激已经点燃。

3.5。线粒体 和细胞色素C

氧化应激引起的损失 和细胞色素C的释放到细胞质中。这两个事件引发细胞凋亡的发生通过的内在途径。的 由高灵敏度荧光探针JC-1评估。的单体的形式JC-1标签成纤维细胞的细胞质亮绿,虽然二聚的形式可以进入正常的线粒体 红色的污渍。数据如图5和6。JC-1标记成纤维细胞治疗1毫克/毫升c .木瓜种子水提取并没有改变 (数据5(e)和5(f)),而1毫米的H2O2引起的损失 的通道,从而防止JC-1二聚体到线粒体(数字5(g)和5(h))。当1毫克/毫升c .木瓜同时种子水提取物添加氧化应激,这阻止了 损失,因此线粒体是红染色(数字5(我),5(j))。提取无法阻碍 当复苏中加入(数据损失5(k)和5(左))。


图5
底特律550成纤维细胞标记荧光探针JC-1治疗后c .木瓜种子水提取物和/或与H2O2。成纤维细胞与JC-1标签(1% v / v)和绿色或红色荧光观察与LM通过设置一个数字化的FITC (a、c、e, g, k, m,和o)或TRITC过滤器(b、d、f、h、j l, n, p)。(a) - (d):控制未经处理的纤维母细胞T0 h (a, b)和4 (c - d);(e) - (f):成纤维细胞治疗1毫克/毫升c .木瓜(Cp)提取4 h;(g) - (h):成纤维细胞孵化与h2O21毫米的1 h;(((我))- j):成纤维细胞孵化与1毫米H2O2同时为1和1毫克/毫升的Cp h;(k) - (l):成纤维细胞孵育1毫米H2O21 h和1毫克/毫升的Cp提取物中加入复苏;(m) - (n):细胞治疗1毫克/毫升的小分支 kDa(见图1);(o) - (p):成纤维细胞同时孵化与1毫克/毫升的小分支 kDa H和1毫米2O21 h。酒吧= 20μm。

图6
细胞质和线粒体细胞色素C的水平。底特律550成纤维细胞孵化1毫米H2O2同时1 h (s)或在复苏(r)和1毫克/毫升c .木瓜(Cp)种子水提取物被收获的内容由ELISA测定线粒体和胞质细胞色素C。浓度表示为pg /μ总蛋白质的g。单一的明星表示重要的价值与未经处理的控制成纤维细胞( );两颗恒星表明重要的价值与所有其他的值相对于胞质细胞色素C ( )。每个值代表均值±SE六个独立的实验中,每做一式两份。

线粒体 损失原因反过来改变线粒体外膜的渗透性和引起细胞色素C的释放,一个著名的apoptotic-inducing因素。细胞色素C的胞质浓度比控制价值在氧化应激增加了6倍,也就是说,300 pg与分别为50 pg ( ,图6)。氧化应激中添加1毫克/毫升c .木瓜种子水提取物预防细胞色素C的释放没有影响被观察到在提取后氧化应激诱导的管理,改变显示的细胞色素C浓度对H值2O2受损的成纤维细胞(图6)。

3.6。(Ca2 +)离子

氧化应激诱导Ca2 +离子流入到细胞质中,进而导致中断正常的生理途径,导致细胞死亡。Ca2 +离子流入到细胞质被1毫克/毫升的预防c .木瓜同时添加到H时种子水提取物2O2(图7)。200年的配加也观察到同样的行为μM维生素C单独或同时与1毫米H2O2添加1 h。(Ca2 +)离子浓度在H 160海里2O2对成纤维细胞和100 nM控制和提取或维生素C治疗( ,图7)。


图7
Ca2 +离子。Ca2 +离子浓度(nM)发现550年底特律孵化后成纤维细胞和1毫克/毫升c .木瓜与200年(Cp)种子水提取物或μ同时添加了维生素C (C) (s)或在复苏(r)与1毫米H2O21 h。的值表示单明显的区别于其他明星( )。每个值代表的意思 SE六个独立的实验中,每做一式两份。
3.7。hsp - 70

热休克保护细胞免受过多的压力,包括氧化应激。减少7%的hsp - 70的数量是观察成纤维细胞在治疗1 h和1毫克/毫升c .木瓜种子水提取物( ,图8(一个))。超表达hsp - 70蛋白被发现在1毫米H2O2550年底特律孵化成纤维细胞( ,图8 (b))。c .木瓜种子水提取,添加氧化应激而不是在恢复期间,阻碍了压力减少的数量hsp - 70控制价值(图8 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图8
免疫印迹的hsp - 70。(一)西方印迹和视密度(OD)诱导细胞溶质hsp - 70控制未经处理的底特律550成纤维细胞或处理1毫克/毫升c .木瓜(Cp)种子水提取1,2,4,8小时(h);(b)西方诱导细胞溶质的印迹和OD hsp - 70底特律550成纤维细胞孵化与1毫米H2O21 h在缺席或者1毫克/毫升的Cp种子水提取物。值表示为控制未经处理的纤维母细胞的百分比值为100%。明星对其他人显示了一个重要的价值没有明星( )。每个值代表均值±SE六个独立的实验中,每一个在复制完成。
3.8。抗氧化活性的c .木瓜种子水提取物小分支

的分离c .木瓜通过差速离心(图种子水提取物1)允许我们评估如果提取物的抗氧化作用是整个粗提物的独家财产或主要是与一个特定类的化合物。任何不同的小分支(1毫克/毫升最终浓度)和MTT测定细胞毒性如图所示,JC1染色(数字9和5、职责)。图5显示红色的彩色线粒体底特律550成纤维细胞治疗 独自kDa小分支(数字5(m)和5同时(n))和H2O2(数据5(o)和5(p))。550年底特律成纤维细胞的小分支增加生存能力:最大增量测量的100000 g离心得到的上层清液上层清液(16000克 ,图9),尤其是与包含物质的小分支 kDa(图9)。关于抗氧化活性,不同的小分支没有显著不同于整个提取与氧化应激(图当同时补充说9)。任何小分支可以减少氧化应激时添加在复苏。


图9
可行性的底特律550成纤维细胞治疗不同的小分支c .木瓜种子水提取物。可行性的底特律550成纤维细胞治疗1毫克/毫升(w / v,培养基)不同的小分支的获得c .木瓜(Cp)提取(见图1)管理独自或者与1毫米H2O2同时添加(s)或在1 h复苏(r)被MTT测试评估。一颗星表示值明显不同于控制未经处理的纤维母细胞( )。每个值代表均值±SE的六个独立重复实验。准备的小分支,见图1和材料和方法部分。

4所示。讨论

目前的研究表明c .木瓜种子在H水提取物具有强力的抗氧化活性2O2氧化应激底特律550年人类皮肤成纤维细胞。我们的研究结果表明,提取不是有毒,减少细胞死亡,确保Ca2 +体内平衡,抵消线粒体功能失调在氧化stress-damaged底特律550成纤维细胞。最好的效果主要取决于政府的形态和程度较轻的剂量和组合,也就是说,整个提取与小分支。我们发现,(我)的保护作用是提取时施加额外的氧化应激与此同时,暗示的生物活性化合物c .木瓜提取不灭活H2O2(因为它是维生素C)但是,相反,可以清除H2O2但不自由基;(2)足够的剂量诱导抗氧化作用在我们的实验设计是1毫克/毫升,可能由于不同生物活性分子的浓度;(3)整个原油提取是有效的小分支。

因此,我们的数据强烈突出分子中含有的抗氧化作用c .木瓜种子水提取物,鼓励他们的剥削。事实上,物质具有抗氧化特性的生化最近受到前所未有的关注,尽可能考虑的治疗和预防代理ROS在健康和疾病的作用。此外,由于增强回收agrofood行业的兴趣,研究剩余的数量在取代合成抗氧化剂和天然来源的增加。从食品加工废弃物或副产品如种子和皮含有更高的潜在的抗氧化剂来源可食用部分(23];相反,byproduct-derived成功开发抗氧化剂是非常有限的。葡萄籽和橄榄废弃物提取在欧洲食品加工行业代表这些异常24]。在这种背景下,c .木瓜利用种子水提取物可能是一个来源。事实上,木瓜种子含有几个分子,如脂肪酸,粗蛋白,粗纤维,木瓜油,carpaine,异硫氰酸苄酯,glucotropaeolin,苄硫脲,三十一烷, 谷甾醇、caricin和芥子酶酶(7),赋予杀虫药(25,26),堕胎药(27,28],避孕的[29日- - - - - -32),愈合(33,抗癌34),抗菌35),和抗真菌36]属性以及抗氧化活性次生代谢产物的存在,如酚类化合物、香草酸,类黄酮, 生育酚和维生素c,尽管广泛的和历史的使用c .木瓜传统管理的许多疾病(4)的科学验证使用木瓜种子作为抗氧化剂是稀缺的。因此,在目前我们测试工作c .木瓜种子水提取物符合民间医药的使用并确保没有毒性相关的化学物质在准备使用。在我们的手中,c .木瓜种子水提取物是没有毒的,作为一个整体,这是更有效的比维生素C阻碍了H2O2氧化损伤。

方法提取制备的选择是非常重要的保持抗氧化活性(17,37]。种子提取物的抗氧化活性可能进一步提高,考虑到五个提取的比较分数,也就是说,乙醇、石油醚、乙酸乙酯,正丁醇,和水,表明抗氧化活性最强的乙酸乙酯和正丁醇的分数,而水提取物一直最弱的抗氧化活性(17]。尽管这些数据,我们测试了水提取,因为它是可食用的,因此符合公认的人力管理。在这里,我们也证明了形态的管理是至关重要的。因为实验H2O2氧化应激是基于两步过程,也就是说,1毫米H2O21后面h 1 h的复苏新鲜培养基,我们发现,木瓜提取的最佳形态政府同时添加时氧化应激诱导物。这表明,提取行为直接与H2O2。此外,c .木瓜种子水提取物,作为一个整体,更有效比维生素C,一个著名的抗氧化剂代理。事实上,维生素C在复苏中添加时抗氧化活性最高。H2O2必须首先转换成纤维细胞可以然后中和自由基,维生素C。事实上,维生素C是一种水溶性抗氧化剂抗坏血酸或延迟或抑制细胞损伤主要通过自由基清除。属于初级抗氧化剂维生素C组能够捐赠电子自由基,清除这些化合物更加稳定,而不是有害的细胞(38]。

的抗氧化活性c .木瓜种子提取物可以防止细胞死亡。事实上,我们显示提取的能力阻止H2O2全身的细胞凋亡。然而,提取不直接影响凋亡过程但间接阻碍氧化压力诱导细胞凋亡。事实上,c .木瓜提取没有功效对CHX PMC-induced凋亡,蛋白质合成抑制剂。因此,oxidative-stress-induced凋亡的保护是一个间接的结果提取的能力,以防止生产或阻止有害代谢物的活动,如自由基。

抗氧化功能的生物系统要复杂得多比简单的自由基清除的过程。抗氧化剂可能影响生物系统(i)抑制活性氧和活性氮物种的形成(RNS);(2)影响酶活性(39];(3)诱导新创防御酶的生物合成,从而影响其他内源性抗氧化剂(40];(iv)保留任何活动(41),或过渡金属离子鳌(v)。很明显,一些化合物使用多个抗氧化剂对生物系统的影响机制。我们的数据表明,抗氧化的效果c .木瓜种子水提取物没有增加清除酶活性,过氧化氢酶。同时添加到氧化应激时,提取正常水平降低过氧化氢酶的活性。这表明抗氧化的影响c .木瓜种子水提取物对不通过调制的过氧化氢酶酶活性,但(我)清除和螯合氧化分子(H2O2)或(ii)重新建立或维持细胞内的还原/氧化平衡。

氧化应激导致线粒体功能障碍通过的损失 线粒体DNA突变的积累,增加水平的氧化损伤DNA,蛋白质和脂质(1]。牦牛和Van Houten42)表明,H2O2治疗的影响主要是在人类细胞中线粒体DNA而不是。在我们的系统中,c .木瓜种子水提取物阻止了 损失和随之而来的细胞色素C的释放到胞质。

细胞色素C通常绑定到内线粒体膜与心磷脂,其过氧化反应导致细胞色素C和释放通过线粒体外膜进入细胞溶质。一旦进入细胞质,细胞色素C的caspase-9触发激活激活细胞凋亡的内在途径(43]。自c .木瓜种子水提取物预防oxidative-induced细胞死亡通过阻断细胞色素C从线粒体释放细胞溶质,通过减少线粒体ROS和通过抑制线粒体渗透性转换,我们推测,细胞线粒体渗透性,能够目标。

氧化应激会扰乱正常的生理途径,进而引发Ca2 +信号相关的细胞死亡。事实上,氧化应激引起Ca2 +流入到细胞质从细胞外环境和内质网(ER),分别细胞膜和ER频道(44]。c .木瓜种子水提取物抒发抗氧化作用也通过阻止H2O2全身的Ca的变更2 +体内平衡。重要的胞质hsp - 70诱导发生在暴露于H2O2是减少了c .木瓜种子水提取物对正常水平。这些结果指出可能的氧化还原机制参与热休克信号转导通路,这可能发挥重要的监管作用的遗传机制对氧化应激的耐受性。

五个小分支的抗氧化性能差速离心获得的水粗提物进行了测试在同一条件的提取。每个小分支显示活动与那些测试整个提取,从而表明的抗氧化活性c .木瓜种子水提取物并不完全是由于只有一个分子或分子和一些协会,没有协同活动的生物活性化合物。值得注意的是,一个测试的五个小分支表示一个属性是没有显示的其他小分支。事实上,小分支 kDa能够抵消损失 。这种行为的原因需要进一步的调查。

完全支持我们的数据补充外源性的有益影响c .木瓜水提取物(全部或种子 kDa小分支)代表一个有效的工具自由radical-induced损害降到最低。

5。结论

总之,这项研究也表明,nonedible部分c .木瓜,特别是种子水提取物,可能是一个有前途的抗氧化剂来源,这可能有治疗的影响。事实上,我们发现c .木瓜种子防止成纤维细胞H2O2全身的压力由于水提取物的抗氧化活性。一起给我们的结果表明在福利,形态的管理和提取c .木瓜种子是重要的抗氧化活性和开放的程度生物技术利用一个新的视角c .木瓜。事实上,这方面可能非常重要的回收浪费木瓜水果,发挥着重要作用改善完成nonedible副产品的利用率。

利益冲突

Elisa Panzarini, Majdi Dwikat、普马里亚诺•克里斯蒂安·Vergallo,她曾Dini没有利益冲突有关的出版。