文摘

蜂胶是一种天然产品,蜜蜂收集来自各种植物。它是有益的药理作用而闻名。我们研究的目的是评价蜂胶的影响对人类精子的运动性,线粒体呼吸活性、膜电位。精液样本10 normozoospermic捐助者加工根据世界卫生组织的标准。蜂胶对精子的运动性和线粒体活动的影响参数进行测试的新鲜精液和纯化精子。蜂胶保存进步精子的运动性原生精液样本。耗氧量确定纯化permeabilized精子通过高分辨率的呼吸运动计量法二磷酸腺苷和基质复杂的我和复杂的二世(状态propolis-treated样本)显著增加。蜂胶在鱼藤酮的存在也增加了非耦合呼吸(状态第四)和复杂的活动,但这并没有影响国家寡霉素引起的泄漏。线粒体膜电位并不影响蜂胶。这项研究表明,蜂胶维护本地射精精子的运动性,增加活动的线粒体呼吸复合体II和第四而不影响线粒体膜电位。数据表明,蜂胶能提高总线粒体呼吸效率在人类精子体外从而有可能改善精子的运动性。

1。介绍

蜂胶(蜂胶)是一种天然产品,蜜蜂(的蜜蜂)收集来自各种植物。它被用作建筑材料(裂缝和缝隙的填)或抵御入侵者(薰杀死入侵者昆虫)1]。

蜂胶被用作治疗数千年。这个词来自希腊语箴(前面的意思)城邦(城市、社区)。它的化学成分取决于地方,集合的时间,植物来源使其高度可变。到目前为止,已经有超过300种化合物中发现各种蜂胶提取物(2,3]。它主要由树脂(50%)和蜡(30%)。其他组件都花粉(5%),和芳香精油(10%)、类黄酮和次要成分(槲皮素、山柰酚、松属素,芹黄素、白杨素等),beta-steroids、萜烯、矿物质和维生素1,4- - - - - -6]。蜂胶是已知的在民间医学药理作用:抗菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫、抗炎,chemopreventive,免疫调节,王亚南,抗氧化,抗肿瘤1,7]。由于这些影响,在过去的30年里,蜂胶被强烈的医学研究的主题。

不育影响10 - 15%的育龄夫妇和许多悬而未决的问题仍然是关于生理机制成功的生育率(8]。男性因素导致约50%的不孕病例和他们中的大多数仍特发性(9]。超过90%的男性不育病例是由于低精子数(症),精子运动性(asthenozoospermia)、精子形态异常(畸形),或三个。其余病例的男性不育可能由许多因素包括解剖问题,荷尔蒙失衡,遗传缺陷。

合适的精子能动性在哺乳动物生殖成功的基础,因为精子必须相对长途旅行通过女性生殖系统活跃鞭毛运动。精子运动的能量形式的三磷酸腺苷(ATP)是由两个代谢过程:糖酵解发生在细胞质或线粒体的氧化磷酸化发现只有在精子中段,在72 - 80成螺旋形地安排细胞器可以检测到。然而,这两种途径的相对贡献精子能动性在不同的物种是一个长期争论的问题10,11]。然而,最近的实验数据表明,减少线粒体呼吸活动可能导致效率降低精子的运动性。在asthenozoospermic患者中,描述了在精子线粒体形态和功能变化(12,13]。

直到现在,蜂胶对线粒体形态和功能的影响,研究了特别是在体细胞。然而,这些研究的结果远未统一显示刺激和抑制各种线粒体功能包括耗氧量、细胞凋亡和线粒体膜电位(14- - - - - -17]。我们的研究的目的是评估的影响ethanolic提取蜂胶的人类精子的运动性(保留),线粒体呼吸活动和膜电位测试这种自然的公认的治疗潜力产品治疗asthenozoospermia。

2。方法

2.1。Ethanolic提取蜂胶的准备

蜂胶收集使用塑料网在西方地区的波西米亚(Horni Slavkov-50 17.268°8′^”48.992 N, 12°48′^”2012年9月E)。蜂胶是冻结在−20°C和地面磨。由此产生的粉末(10克)在室温下混合与70%乙醇(100毫升)24 h,然后过滤。100毫升的滤液是由70%的乙醇(18]。样品一直在黑暗中在4°C到分析。与活细胞实验,蜂胶是进一步稀释导致最终乙醇浓度低于1%不是有毒的细胞(19]。为进一步的实验选择的最终浓度蜂胶是0.01毫克/毫升的相应的媒介。

2.2。高效液相色谱法(HPLC)分析

定性和定量色谱分析酚醛树脂进行高效液相色谱系统配备一个二进制泵(水域1525),水域717 + Autosampler,和双UV / VIS检测器2487。对称C18柱进行分离,颗粒大小5μ米(150毫米×4.6毫米),用0.08%醋酸的流动相甲醇(a)和0.1%醋酸和10%甲醇水(B),梯度是10 - 47%(25分钟),47%(批准min), 47 - 70%(40 - 70分钟),和70 - 100%(70 - 80分钟)流动相的流速0.5 mL / min。注入体积是10μL,列温度是30°C。

光谱光度测量的检测是由280 nm和330 nm。多酚化合物的识别是通过比较保留时间与商业纯化合物。所有标准都溶解在二甲亚砜(Sigma-Aldrich;美国圣路易斯)给10更易与L标准的解决方案。校准标准由稀释标准溶液的乙醇。

定量分析是由外部的标准方法。校正曲线的线性响应在5 - 100的浓度范围μmol / L。在高效液相色谱分析之前,保留在聚四氟乙烯注射器微型滤波器过滤Separon 0.45μm。高效液相色谱法分析蜂胶提取物稀释一百倍。

酚类化合物从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,美国)(芹黄素、白杨素、染料木素、山柰酚、木樨草素,柚苷配基,松属素,galangin和酚酸:咖啡,p-coumaric, t-ferulic, t-cinnamic,安息香,和没食子酸和咖啡酸苯乙基酯)。香兰素是购自默克(达姆施塔特,德国)。

2.3。精子样品制备

研究设计是经当地伦理委员会批准的大学医院在皮尔森和书面知情同意了从每个10参与者包括在这项研究中(平均年龄24.2岁,SEM±2.8)。

射精后收集的性禁欲3天在体外受精中心教授泽赫,皮尔森。精液样本进行评估是一个有经验的员工。分析了液化后,他们根据2010年世界卫生组织的标准(20.]。我们调查了精液体积,与相差光学显微镜下放大×200浓度的精子,精子的运动性和病态。精子的运动性是评估在室温下Makler计数室。每复制二百精子被分为三运动性类别(nonprogressive进步,不能游动的精子细胞)。所有的样品被认为是normozoospermic射精(表1)。

新鲜精液(0.1毫升)与蜂胶进行实验。蜂胶或乙醇(1μL)添加到0.1毫升的新鲜精液(蜂胶的最终浓度为0.01毫克/毫升)和精子运动性60分钟后评估。

剩余的样本由梯度分离技术用于实验和极谱oxygraph (Oroboros,因斯布鲁克,奥地利)和精子流式细胞术评估。分离后的精子数量也决定Makler计数室。

2.4。精子密度梯度分离技术

精子分离和纯化。这是使用梯度解决方案执行媒体SpermGrad介质(SGm、Vitrolife、瑞典)和SpermRinse介质(SRm, Vitrolife,瑞典)。SpermGrad培养基稀释到90%(0.15毫升SGm: 1.35毫升SRm), 70%(0.09毫升SGm: 0.21毫升SRm)和50%(0.15毫升SG: 0.15毫升SRm)。成一个锥形管1.5毫升90%,0.3毫升70%和0.3毫升的50%梯度媒体是分层的。完整的射精了,样品离心20分钟300 g。删除后上层清液,8毫升SRm添加然后样本离心机在300 g 8分钟。切除后上层清液,样品的浓度和活性评价精子并准备注入oxygraph。

2.5。高分辨率的呼吸运动计量法

耗氧量的纯化精子测量36°C 2毫升玻璃钱伯斯oxygraph Oroboros (Oroboros,因斯布鲁克,奥地利)连接到电脑DatLab数据采集和分析软件(Oroboros,因斯布鲁克,奥地利)。氧通量计算作为一个消极的时间导数的氧气浓度。所有值的氧气通量校正仪器和化学背景测量在不同的试验中执行相同的介质没有人类配子。

介质组成的0.5 L更易与乙二醇四乙酸,3 L MgCl更易₂h·6₂O 60更易/ L K-lactobionate 20更易与L牛磺酸、10 L KH更易₂阿宝₄,20更易/ L玫瑰,110 L更易与蔗糖,1 g / L白蛋白基本上自由脂肪酸(21]在750 rpm搅拌,平衡与空气60分钟。平衡后,室中氧浓度与它的浓度在大气和溶解度在中(0.92)。钱伯斯被关闭,完整的精子被注入的样品室使用汉密尔顿注射器。并行的两院录音,蜂胶(0.01毫克/毫升)注射和样本进一步孵化20分钟的36°C。精子细胞膜permeabilized与洋地黄皂苷(美国圣路易斯Sigma-Aldrich;5μg / mL)和基质的组合,顺序抑制剂,解偶联剂注入到取样器测量呼吸电子传递系统的通过不同的段(图1)。(1)静止呼吸基质提供电子复杂我苹果酸(2更易/ L)和谷氨酸(10更易/ L)是衡量国家S2 (nonphosphorylating泄漏状态,L_N)。(2)积极的呼吸被5更易诱导L二磷酸腺苷(ADP);S3状态或OXPHOS)。(3)耗氧量进一步测量与丙酮酸(5更易/ L)和电子转移衬底黄素蛋白(ETF)棕榈酰肉碱(20μmol / L)。(4)线粒体内膜的完整性检查,细胞色素c (10μmol / L)。(5)线粒体呼吸就增加了琥珀酸,复杂的第二衬底(10更易/ L)。(6)国家泄漏被抑制诱导再次对比寡霉素(2μg / mL)。(7)电子传输系统的最大容量(国家S3u或者ETS)达成的滴定的解偶联剂trifluorocarbonylcyanide苯腙(FCCP;0.05μmol / L滴定步骤)。(8)添加一个复杂我抑制剂鱼藤酮后,氧气通量与电子传输系统的最大容量的复杂二世。(9),抗霉素A (2.5μmol / L),一个复杂的三世抑制剂注入了取样器测量残余耗氧量(火箭)。(10)N, N, N′, N′-tetramethyl-p-phenylenediamine盐酸盐(TMPD;0.5更易/ L)和抗坏血酸盐(2更易/ L)注射对呼吸运动的同时测定了细胞色素c氧化酶(c(四)活动。在结果中,氧通量记录在个人滴定步骤纠正了残余的耗氧量。

蜂胶浓度之间的剂量反应关系和精子呼吸活动在另一组实验中,测试的最终浓度蜂胶0.001,0.005和0.01毫克/毫升。高剂量的蜂胶并不像在实验中测试并行运行,更高浓度的蜂胶在孵化中(0.03和0.05毫克/毫升)是有毒的老鼠胚胎干细胞减少增长,生存和增殖(未发表的观察)。

2.6。在精子细胞膜的渗透性

精子是处理不透水荧光染料propidium碘检查细胞膜渗透性的基质,抑制剂,解偶联剂治疗后洋地黄皂苷。最后propidium碘的浓度是1μ克/毫升。

2.7。精子流式细胞术评价

线粒体膜电位()确定MitoProbe JC-1化验设备(技术)。每个精子样本resuspended 37°C温暖的磷酸盐(PBS)约细胞/毫升。蜂胶(1μL(100)被添加到测试样品μL)达到最终浓度为0.01毫克/毫升。控制仍然不干预。样本在蜂胶孵化后60分钟,用PBS。JC-1 (10μL 200年μmol / L)增加了20分钟孵化(37°C, 5%有限公司₂)。用PBS(5分钟,1500 rpm)。500年样本resuspendedμL PBS和BD流式细胞仪测量第二章血细胞计数器(美国新泽西州BD生物科学)。与BD流式细胞仪分析女主角软件与488 nm励磁使用排放过滤器适合Alexa萤石488染料和R-phycoerythrin。

2.8。柠檬酸合成酶活性

线粒体含量样品从每个oxygraph吸气室被化验测定柠檬酸合成酶活性(22,23]。试验介质由0.1更易/ L 5, 5-dithio-bis——(2-nitrobenzoic)酸、0.25% Triton-X,更易与0.5 L oxalacetate, 0.31 L更易与乙酰辅酶A, 5μmo / L EDTA 5更易与L盐酸三乙醇胺和0.1 mol / L Tris-HCl, pH值8.1 [22]。二百毫升的混合和均质室内容添加到800年μL的媒介。酶活性的测定spectrophotometrically在412 nm和30°C / 200年代和表达每10个人⁷细胞。

2.9。数据分析和统计

结果意味着±SEM。统计分析了不同使用软件包STATISTICA Cz, 8 (StatSoft Inc .布拉格,捷克共和国)。测试后的正常分布和方差的同质性,比较了使用学生的以及,Wilcoxon符号秩检验和方差分析(方差分析)与事后测试修正Bonferroni多重比较的方法。结果被认为是显著不同。

3所示。结果

3.1。高效液相色谱分析

高效液相色谱法分析蜂胶,我们能够识别t-ferulic酸化合物,p-coumaric酸,香兰素,咖啡酸,t-cinnamic酸、山柰酚、芹黄素和白杨素。虽然我们分析标准的没食子酸,苯甲酸,槲皮素,柚苷配基,毛地黄黄酮,染料木素,松属素,galangin,和咖啡酸苯乙基酯,他们并不确定在我们的蜂胶样品。色谱ethanolic提取的捷克蜂胶呈现在图2。详细的结果与观测到的物质的浓度如表所示2。

3.2。精液参数和影响蜂胶在新鲜精液精子的运动性

十个健康男性被纳入本研究。的平均年龄为24.2岁。一般精子normozoospermic男性射精后的特征如表所示1。蜂胶的作用对人类精子的运动性孵化60分钟后呈现在图3。蜂胶保存精子的进步的能动性本机精液样本,由于比例的逐步能动的精子与蜂胶孵化后仍然新鲜样品几乎一样,而在射精没有蜂胶,进步运动随时间显著下降。酒精对精子的运动性本身没有负面影响。

3.3。高分辨率的呼吸运动计量法

代表的痕迹的耗氧量permeabilized精子有或没有蜂胶0.01毫克/毫升是描绘在图4。耗氧量完整的精子(0.13±0.01 nmol / (s·IU)显著增强了蜂胶(0.27±0.03 nmol / (s·IU);)。与洋地黄皂苷透化作用后,状态2确定苹果酸和谷氨酸为0.19±0.04 nmol / (s·IU)在控制样品和显著的高于propolis-treated精子样本(0.29±0.05 nmol / (s·IU);)。状态3,耗氧在氧化磷酸化,决定在ADP和基质复杂的我,ETF,复杂II是描绘在图5。蜂胶显著增加(~ 50%)氧通量(二)建议增加活动的复杂。蜂胶4寡霉素诱导,达到不影响状态0.81±0.07,0.94±0.09 nmol / (s·IU)的控制和propolis-treated精子,分别。最大容量的电子传输系统(国家S3u)检测复合物I和II和复杂的存在我抑制剂鱼藤酮明显高于蜂胶后管理(图6)。在测量TMPD +抗坏血酸盐、复杂IV呼吸为12.16±2.58 nmol O₂/ (s·IU)控制样品和它是由蜂胶显著提高到15.4±3.19 nmol O₂/ (s·IU)。绝对乙醇单独(媒介蜂胶、寡霉素抗霉素A, FCCP,和鱼藤酮)的体积10μL不影响呼吸运动的参数测量与基质复合物I, II, ETF ADP的存在。

通量控制比率计算估计的相对效率个人干预和耦合状态的精子线粒体。这一比率明显高于在propolis-treated样品(3.53±0.42)相比,控制(2.8±0.28)提出提高效率的耦合的呼吸当复杂二世被琥珀酸刺激。泄漏的泄漏控制比是比呼吸和ETS能力;达到0.25±0.02后的控制样品和它显著减少蜂胶为0.21±0.02 ()。

剂量反应关系测试在不同实验如图7S3状态(OXPHOS),谷氨酸,苹果酸,丙酮酸,琥珀酸,和ADP在场中,和国家S3u (ETS),在线粒体FCCP分开。蜂胶剂量依赖性增加耗氧量,尽管其影响的程度更大的国家比国家S3u S3。

3.4。在精子细胞膜的渗透性

增加5μ克/毫升的洋地黄皂苷使精子细胞膜的渗透性染料propidium碘基板,抑制剂,解偶联剂要求确定高分辨率呼吸运动计量法(图8)。

3.5。精子流式细胞术评价

线粒体膜的去极化是线粒体损伤的敏感指标。JC-1 membrane-permeable荧光探针聚合在线粒体基质,然后发出红色荧光,如果是很高的。线粒体去极化,JC-1不能的单体的形式积累在细胞质中的线粒体基质和生产绿色荧光。在精子中,损失的可以作为早期凋亡的标志和精子功能障碍(24]。在我们的实验中,孵化与蜂胶的精子样本(60分钟)没有显著影响(图9)。在控制样本,细胞的比例高为98.43±1.07%,甚至略增加propolis-treated精子到达99.33±0.25%。

3.6。柠檬酸合成酶活性

在控制样本,柠檬酸合成酶活性为6.58±0.84个人/ 10⁷细胞和不影响蜂胶(6.08±0.84个人/ 10⁷细胞)和物质(基质、抑制剂、媒体)在呼吸运动的测量,作为进行单独控制。

4所示。讨论

这是第一个研究表明收集的蜂胶化学成分在捷克共和国。蜂胶有非常复杂的化学成分取决于许多因素,包括植物的多样性和蜜蜂收集它的地理位置。虽然测试样本的收集的地区蜂胶位于温带北部“白杨”类型的蜂胶是一个典型的蜜蜂产品(3),提到的位置内的树状结构是由针叶树(90%)、桦木(6%)、桤木(2%)、山毛榉(1%),和橡树(1%)25]。然而,测试样本包含白杨素,参考在杨树蜂胶黄酮和酚酸和其他黄酮类化合物通常发现蜂胶提取物来自相似的地理区域和报道负责各种有益的蜂胶(26]。其中,阿魏酸、香豆酸和山柰酚中在捷克蜂胶提取物浓度最高。咖啡酸苯乙基酯,柚苷配基,quercetin-substances经常包含在杨树蜂胶(2,3)和广泛测试的抗炎、抗癌、抗氧化活动近年来(27——不被发现在捷克蜂胶。可能造成上述差异的因素可能包括不仅蜂巢周围生长的植物物种的多样性,但也季节,照明,高度,收集器类型,和食品供应28]。应该注意的是,寻找一个物质或一个特定的物质类,可以负责蜂胶的有益的行动到目前为止还没有成功。科学研究表明,生物活性的蜂胶可以几乎相同(即。,antimicrobial, antitumor, antioxidant, anti-inflammatory, etc.) in samples from different climatic zones and of completely different chemical composition [3]。最可能的组合的生物活性物质是至关重要的蜜蜂胶(29日]。

本研究描述了蜂胶的影响精子的运动性,线粒体膜电位,和线粒体呼吸活性评估高分辨率呼吸运动计量法允许个人呼吸状态的确定以顺序的方式在相同的样本,从而使复杂的评估线粒体功能接近体内的情况。此外,高灵敏度的方法使测定呼吸运动的活动的个体相对少量的细胞中线粒体复合物(30.]。在我们的实验中,我们使用的纯化精子受到膜轻度非离子去污剂洋地黄皂苷透化作用,仔细的剂量滴定permeabilize细胞膜而不会破坏线粒体功能。迄今为止,耗氧量由人类精子线粒体已经决定主要由传统oxygraphy生殖细胞受到低渗肿胀(13,31日- - - - - -33]。然而,一些哺乳动物的精子低渗的挑战可能会大大影响各种蛋白激酶的活性(PK),包括PKA, PKC,酪氨酸蛋白激酶通过osmosensitive K⁺和Cl⁻渠道的过程称为监管体积减少需要能源供应(34]。

本研究的主要发现是,蜂胶增强线粒体呼吸活性的复合体II和四世在不影响电子传递的耦合ATP合成和/或线粒体膜电位在permeabilized人类精子体外。耦合状态,蜂胶增强耗氧量与复杂的我和复杂的2 ~ 50%的基质。这增长归因于复杂的二世,因为复杂的活动我就不受蜂胶。此外,该比率/明显高于propolis-treated样本。同样,在非耦合状态(S3u E),耗氧量显著蜂胶高(~ 25%),都在基质复合物I和II,鱼藤酮抑制复杂的我。活动的复杂第四提高到相同的程度(~ 27%)。

可用的数据的影响蜂胶及其对线粒体呼吸的主要化合物或活动的个人线粒体酶参与electrontransport收敛系统稀缺。最常见的发现是,这种效应可以忽略在正常体细胞(心肌细胞、神经细胞和肝细胞),但变得有益细胞受到不良刺激,氧化磷酸化是妥协16,35,36]。相比之下,在各种类型的肿瘤细胞,蜂胶提取或其成分抑制氧化磷酸化和触发细胞色素c的释放和随后的细胞凋亡15,17]。针对这一点,蜂胶的作用在细胞呼吸不容易预测,取决于细胞类型。

一些研究表明,蜂胶或其酚醛成分可能会影响线粒体膜电位通过增加内线粒体膜的渗透性(14]。这个问题解决在试验MitoProbe JC-1分析工具包,清楚地表明,在人类精子,线粒体膜电位并不影响蜂胶。此外,oligomycin-induced呼吸状态(泄漏),反映了质子漏,赔偿质子滑,电子滑,阳离子循环(30.不受蜂胶。因此,减少后的泄漏控制比蜂胶可以归因于电子传递效率的增加通过复杂的二世。复杂II激活提出的假定的分子机制的研究试件et al。37),蜂胶成分山柰酚琥珀酸脱氢酶的脱乙酰作用增加从而增加其活动。

迄今为止,蜂胶、蜂胶化合物对精子的影响特征已经很少了。整个蜂胶提取物用于尤瑟夫和合作者所做的研究在老鼠和兔子,服用蜂胶10到12周(38,39]。蜂胶管理导致增加精子数量和能动性,血浆睾酮水平,减少死亡,异常的精子数量。单一研究记录的积极影响蜂胶复合白杨素精子的运动性,精子浓度、血清睾酮水平(40]。阿魏酸也提高精子能动性和可行性报告(41]。所有这些发现都归因于蜂胶的活动作为抗氧化剂和处理这些研究蜂胶的作用或其组分在线粒体能源生产。我们的研究描述了一个新颖的有益的蜂胶对精子的影响特征。

最近的实验证据表明,氧化磷酸化在人类精子中扮演着关键角色在获得能源的精子能动性和表明asthenozoospermia可能与线粒体功能受损(42]。高分辨率的呼吸运动计量法可以提供新的数据搜索的物质可以积极影响人类精子的运动性,从而提高精子施肥能力。此外,详细分析呼吸效率的耦合与非耦合条件下个体的线粒体酶复合物可以提供更好的洞察asthenozoospermia病理生理学。

5。结论

这个研究表明,第一次ethanolic提取蜂胶增加活动的线粒体呼吸的配合物二世和第四而不影响线粒体膜电位。获得的数据表明,蜂胶能提高总线粒体呼吸效率在人类精子体外从而有可能改善精子的运动性。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Miroslava Cedikova和Jitka Kuncova贡献同样这项工作。

确认

这项工作是支持的项目ED2.1.00/03.0076从欧洲区域发展基金,查尔斯大学研究基金会(项目没有。P36),特定的学生研究项目不。布拉格查尔斯大学的260048/2014和格兰特查尔斯大学的资助机构。696212年。