文摘

薯蓣皂苷配基(戴奥)的活性成分薯蓣属物种。戴奥之间的相互作用与牛血清白蛋白(BSA)在模拟生理条件下通过光谱方法研究。荧光猝灭数据显示绑定的戴奥BSA没有或有限公司^{2 +}或锌^{2 +}是一个静态猝灭过程。公司的存在^{2 +}或锌^{2 +}既增加了静态猝灭常数K_SV和亲和力BSA-DIO系统。在竞争面前实验和Δ的负值H⁰和Δ年代⁰,戴奥绑定到网站我BSA主要通过氢键和范德华力。此外,BSA的构象变化研究了喇曼光谱,显示,BSA的二级结构和微环境的芳香残留物被戴奥改变。拉曼光谱分析表明,构象的变化,二硫桥,和酪氨酸的微环境,Trp残留的BSA诱导通过戴奥有限公司^{2 +}或锌^{2 +}不同,如果没有公司吗^{2 +}或锌^{2 +}。

1。介绍

薯蓣科主要分布广东、四川和浙江两省在中国。薯蓣皂苷配基(戴奥),3β-hydroxy-5-spirostene(图1)的活性成分之一薯蓣属物种的块茎中提取出来的薯蓣属物种。先前的研究已经表明,戴奥可以延缓骨质疏松症的进展1)和减弱血浆胆固醇(2),具有抗炎(3和抑制血管收缩4)的影响,等等。

血清白蛋白(SA)是由三个结构同源域(》);每个域包含两个子域(A和B)。它是主要的运输蛋白,可以作为载体的内源性和外源性配体(5]。药物在体内的运输和分配相关与血清白蛋白的相互作用。另一方面,绑定的药物也可以改变血清白蛋白的构象功能。所以重要的是调查药物与血清白蛋白相互作用。牛血清白蛋白(BSA)有相似的结构和性质与人血清白蛋白(HSA);这两个血清白蛋白之间的主要区别是,只有一个在HSA Trp残留物,但在BSA有两个Trp残留物(^134年Trp和^212年Trp)。与国内相比,BSA总是选为模型蛋白由于其低成本,不寻常的配体结合的属性。研究药物与BSA之间的交互中扮演一个重要的角色在药理学和药效学(6]。

血浆中含有许多金属离子生化过程中发挥着重要作用。前面的血清白蛋白之间的相互作用和几种金属离子的报道表明,许多金属离子有特殊的结合位点的蛋白质(7- - - - - -9]。药物与血清白蛋白的结合金属离子的存在也广泛研究[10,11]。先前的研究表明,金属离子的存在不仅会影响血清白蛋白与药物的相互作用,而且药物引起的血清白蛋白的构象变化。有限公司的金属离子^{2 +}和锌^{2 +}丰富生物具有许多生化功能的必需元素。有必要调查BSA-DIO之间的相互作用的有限公司^{2 +}或锌^{2 +}。

在本文中,我们研究了戴奥的绑定与BSA在模拟生理条件下的pH = 7.43。荧光光谱和拉曼光谱被调查绑定过程和蛋白质结构的变化在没有和公司的存在^{2 +}或锌^{2 +}。

2。材料和方法

2.1。材料

戴奥(98%,从阿拉丁试剂公司购买)溶解在乙醇准备1×10的股票的解决方案⁻³摩尔·L⁻¹。0.05摩尔·L⁻¹磷酸缓冲溶液(PBS)的pH = 7.43,包含0.1摩尔·L⁻¹生理盐水。BSA(98%,脂肪酸免费,球蛋白自由、σ)是溶解在PBS准备股票1×10的解决方案⁻³摩尔·L⁻¹之前和存储在277 K,稀释使用。布洛芬和ketoprofen溶解在乙醇准备股票1×10的解决方案⁻³摩尔·L⁻¹,分别。氯化钠、乙醇、氯化锌、六水合氯化钴(II)和其他实验药物的分析纯试剂。双重蒸馏水中使用。

2.2。荧光光谱

rf - 5301上的荧光光谱进行了荧光分光光度计(日本岛津制作所公司)。5.0×10的解决方案⁻⁷摩尔·L⁻¹BSA添加石英电池1.0厘米;金属离子或戴奥然后逐渐加入BSA通过显微注射器。扫描解决方案的BSA戴奥或金属离子的缺失和存在的波长范围300 - 500 nm,分别。狭缝宽度是5 nm / 5海里;激发波长为280 nm。DIO-BSA系统没有金属离子的反应温度控制在291 K, 298 K, 306 K,分别。反应温度对DIO-BSA系统有限公司^{2 +}或锌^{2 +}被控制在298 K。BSA和站点网站标记实验,标记在克分子数相等的混合浓度在室温下2 h,然后戴奥逐渐添加到解决方案,解决方案的荧光光谱扫描。

2.2.1。猝灭机理

为了证实戴奥引起的猝灭机理,荧光猝灭被Stern-Volmer方程(12]: 在哪里和荧光强度没有和冷却器,分别。淬火速率常数。平均生物分子的荧光寿命冷却器的缺失。(是饮料的浓度。是Stern-Volmer猝灭常数。由于生物聚合物的荧光寿命是10⁻⁸年代(13),和可以根据获得的斜坡Stern-Volmer情节。

2.2.2。猝灭机理和绑定常数

静态猝灭的结合常数计算根据修改Stern-Volmer方程(14]: 在哪里是荧光和的分数吗荧光团的有效猝灭常数访问,这类似于关联绑定常量。

2.2.3。热力学参数

焓的变化()被认为是一个常数,当温度变化不大,然后焓变化()和熵变(从范霍夫方程)可以获得15]: 在哪里气体常数和标准自由能变化。

2.2.4。能量传递计算

根据福斯特的无辐射能量传递理论(16,17),能量转移效率不仅决定通过受体和捐赠者之间的距离,而且关键能量传递距离();这是(18), 在哪里受体和捐赠者之间的距离吗是临界距离的传输效率是50%吗 在哪里偶极子的空间取向因子,介质的折射率,捐赠者的荧光量子产率,是荧光发射光谱的重叠积分的供体和受体的吸收光谱 在哪里()是供体荧光强度的波长和的摩尔吸光系数是受体在波长。

2.3。拉曼光谱

拉曼光谱被记录在英国Invia + + FT-Raman光谱仪使用一个基于“增大化现实”技术⁺激光激发波长为514 nm。激光功率是3兆瓦;记录的范围是200 - 2000厘米⁻¹1厘米的光谱分辨率⁻¹。扫描5×10的拉曼光谱⁻⁴摩尔·L⁻¹BSA在没有和戴奥和金属离子的浓度在室温下。在拉曼实验中,戴奥第一次被溶解在乙醇/水(1:9),然后与BSA混合,金属离子解决方案准备拉曼扫描样本。分析了拉曼光谱区域的曲线拟合的曲线拟合程序(峰值8.0原产地分析仪模块,Microcal起源、美国)使用高斯曲线。

3所示。结果与讨论

3.1。戴奥对BSA的荧光没有或有限公司^{2 +}或锌^{2 +}

对于大分子,荧光测量可以提供信息的绑定蛋白的小分子物质。兴奋时280海里,BSA的固有荧光主要是由Trp残留物(19,20.]。BSA的荧光猝灭的存在和缺乏的戴奥有限公司^{2 +}或锌^{2 +}相同的浓度是如图2。图2(一个)表明,BSA的荧光强度减少定期与增加戴奥。与此同时,小蓝移观测到随着戴奥浓度表示更疏水环境BSA的荧光发色团(21]。数据2 (b)和2 (c)加入公司后表明,荧光强度降低^{2 +}或锌^{2 +}用相同的浓度。这些表明,金属离子结合BSA是按照我们之前的工作。当戴奥加入BSA溶液包含克分子数相等的股份有限公司^{2 +}或锌^{2 +}会定期与蓝移,荧光强度降低。光谱的形状类似没有有限公司^{2 +}或锌^{2 +}的荧光强度,而公司的存在^{2 +}或锌^{2 +}是弱于那些没有公司^{2 +}或锌^{2 +}。获得的结果表明,金属离子的荧光就熄了不仅还戴奥。交互发生在BSA、戴奥和金属离子。

3.2。猝灭机理和绑定常数

荧光猝灭分为动态猝灭和静态猝灭。通常情况下,静态猝灭是由于极化子的形成复杂的荧光团和冷却器之间。静态猝灭常数将减少随着温度增加,因为更高的温度将会降低复杂的稳定性。动态猝灭荧光团和冷却器碰撞结果,随着温度升高导致较大的扩散系数,所以相反的效果观察22- - - - - -24]。

确认淬火机制,分析了荧光猝灭数据根据Stern-Volmer方程(1)。Stern-Volmer块不同的温度和相应的结果如图3和表1。结果表明,随温度增加而降低大于2.0×10吗¹⁰L·摩尔⁻¹·年代⁻¹,显示一个静态猝灭BSA和戴奥之间的机制25]。猝灭常数都是增加公司的存在吗^{2 +}或锌^{2 +},表明公司的存在^{2 +}或锌^{2 +}戴奥的荧光猝灭效应增加。与此同时,值的有限公司^{2 +}或锌^{2 +}显示一个静态猝灭机制BSA的绑定戴奥有限公司^{2 +}或锌^{2 +}。

为了获得绑定常数,分析了实验数据也根据修改Stern-Volmer方程(2)。图4显示修改后的Stern-Volmer阴谋在不同的温度下,计算结合常数BSA-DIO系统表中列出2。的值绑定的戴奥BSA随温度增加而降低,这也进一步表明戴奥与BSA的结合是静态猝灭。绑定常量BSA-DIO系统有限公司的存在^{2 +}或锌^{2 +}计算是2.10×10吗⁵L·摩尔⁻¹和1.94×10⁵L·摩尔⁻¹,分别。绑定常量BSA-DIO系统都增加了公司的存在^{2 +}或锌^{2 +},这意味着更强的约束力BSA在当下的戴奥有限公司^{2 +}或锌^{2 +}。

3.3。绑定的本质力量

一般来说,有机小分子绑定到生物分子主要通过四种类型的表演力:氢键、范德华力、静电力和疏水作用,等等(26]。力类型可以由三个热力学参数、焓(),自由能变化),熵的变化()。这些参数对戴奥之间的交互和BSA被范托夫方程计算(3)和热力学方程(4)。范霍夫块如图5,表中列出的热力学参数2。消极的建议戴奥与BSA之间的反应是自发的。戴奥与BSA主要通过氢键和范德华力的消极价值就体现了这一点和(27]。

3.4。药物与BSA之间的能量转移

戴奥的吸收光谱的重叠和BSA的荧光发射光谱图所示6。BSA,,,(28];然后我们可以得到以下结果:厘米³·L·摩尔⁻¹,海里,nm。BSA和戴奥之间的距离小于8纳米,这表明由戴奥是静态猝灭BSA的淬火,依照上面的结果。

3.5。绑定的网站制造商调查

有两个主要的药物对白蛋白结合位点被称为I和II Sudlow网站。网站我形成一个口袋在子域活动花絮,涉及到的孤独的色氨酸蛋白(^212年Trp)。网站我是适应性强,结合各种配体与不同的化学结构。在子域iii a网站第二定位。它可以结合配体,因为它是小,比网站我更灵活、更窄29日,30.]。网站我给华法林亲和力,ketoprofen,等等,为布洛芬和站点II,氟芬那酸,等等31日- - - - - -33]。为了确定戴奥对BSA的结合位点,竞争位移实验进行对网站使用不同的网站调查ketoprofen我和布洛芬网站II,分别。结果表明,戴奥对BSA的结合常数是令人惊讶的从2.57改为1.304×10⁵L·摩尔⁻¹存在酮络芬在,值几乎保持不变的情况下布洛芬(2.47×10⁵L·摩尔⁻¹)。结果表明,ketoprofen戴奥的表现出显著的位移。然而,布洛芬被戴奥显然不是流离失所。这些意味着戴奥对BSA的结合位点是我的网站。

3.6。分析BSA构象变化

拉曼光谱已经成为一个有用的方法来研究蛋白质二级结构的构象变化和氨基酸残基的微环境34]。为了研究戴奥对BSA的构象的影响,我们分析了酰胺我和芳香族氨基酸残基的地区的拉曼光谱。拉曼光谱的峰值出现在该地区的1550 - 1620厘米⁻¹是芳香的环振动乐队残留物(35]。我乐队的酰胺(1700 - 1630厘米⁻¹)是主要来自肽C = O拉伸(36,37]。图7显示组织的拉曼光谱和BSA-DIO系统在没有和公司的存在^{2 +}和锌^{2 +}。酰胺我乐队的BSA, BSA的主要乐队约1648 - 1658厘米⁻¹的特征是螺旋;虽然乐队1630 - 1640厘米⁻¹代表短段链连接螺旋的乐队词都集中在1680 - 1700厘米⁻¹分别为(38- - - - - -42]。图8我是拉曼的曲线拟合酰胺;相应的结果列在表中3。结果表明,本地BSA包含主要螺旋构象(55.71%),这与先前的报道是一致的BSA通过拉曼,红外线,和CD光谱(43- - - - - -45]。的螺旋含量下降到47.58%由于戴奥的绑定。与此同时,的内容词增加而减少短段的内容。结果表明,由戴奥BSA二级结构的改变。与BSA-DIO竞争系统,降低的程度螺旋内容低锌的存在^{2 +},而对于有限公司^{2 +}有一个增加。结果表明,公司的存在^{2 +}或锌^{2 +}影响BSA二级结构的变化。

17二硫化物桥梁的血清白蛋白分子的构象可以敏感地由拉曼光谱。BSA有三个构象的二硫化物桥梁:gauche-gauche-gauche (g-g-g,峰值约为510厘米⁻¹),gauche-gauche-trans或trans-gauche-gauche (g-g-t或t-g-g,峰值约525厘米⁻¹)和trans-gauche-trans (t-g-t,峰值约为540厘米⁻¹)[46]。图9s波段的分析;17二硫化物桥梁的构象是根据获得的拟合结果。如表所示4、二硫化物的主要构象桥梁在本机BSA g-g-g构象。绑定后戴奥,有7 s桥梁转换后的构象,在3 s桥梁的构象改变公司的存在^{2 +}或锌^{2 +},这表明公司的存在^{2 +}或锌^{2 +}减少戴奥s桥梁的改变。

周围的酪氨酰紧身上衣850和830厘米⁻¹,所谓的“费密共振Tyr-doublet,由于对称ring-breathing振动和出平面ring-bending振动。乐队在850年和830厘米⁻¹氢键是极其敏感的酚羟基,和紧身上衣的强度比()是一个指标的酪氨酸残基的微环境。这个比率在0.3和0.5之间的值表明,tyrosy1残留“埋葬。“另一方面,酪氨酸残基”,“当的值的范围从1.25到1.40 (47,48]。分析酪氨酸侧链是显示在图10;结果在表5显示的值减少后的戴奥。但对于BSA-DIO-Co^{2 +}和BSA-DIO-Zn^{2 +}系统都增加了公司的存在^{2 +}或锌^{2 +}的值是大于自由组织。结果表明,酪氨酸残基的buriedness蛋白质增加了戴奥,但公司的存在^{2 +}或锌^{2 +}降低了buriedness酪氨酸残基的49]。

乐队出现约1340厘米⁻¹和弱肩约1363厘米⁻¹由于费密共振紧身上衣乐队的残留物。他们的强度比也可以用来调查周围环境的整体疏水性色氨酸残基(50,51]。图11Trp侧链的分析;表中列出的结果5。强度的比率从0.0409增加到0.0461,由于戴奥,而BSA-DIO-Co中发现了更大的变化^{2 +}和BSA-DIO-Zn^{2 +}系统。结果表明,Trp周围的疏水性残基增加由于戴奥的绑定;疏水性增加更多的有限公司^{2 +}和锌^{2 +}(51]。

4所示。结论

总之,我们模拟了交互与BSA的戴奥体外通过光谱调查。实验结果表明,药物与BSA结合形成一个DIO-BSA复杂。绑定的反应是自发的。戴奥网站绑定到我的BSA主要通过氢键和范德华力。公司的存在^{2 +}或锌^{2 +}增加了淬火效应和戴奥对BSA的结合亲和力。否则,构象变化的分析证实,绑定的戴奥诱导蛋白质二级结构的展开。尽管BSA二级结构的变化引起的戴奥的有限公司^{2 +}或锌^{2 +}不同于那些没有金属离子,所有主要降低了吗螺旋构象。的戴奥7 s桥梁的BSA的构象变化,而变化都减少到3的有限公司^{2 +}或锌^{2 +}。此外,戴奥增加了buriedness酪氨酸残基的蛋白质,但BSA-DIO-Co的影响是相反的^{2 +}和BSA-DIO-Zn^{2 +}系统。与此同时,色氨酸残基的疏水性是由于增加绑定的戴奥有限公司的缺失和存在^{2 +}或锌^{2 +}。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者欣然承认中国的国家自然科学基金(21061002,21061002,21101035),科研基础归侨学者、中国广西自然科学基金(2011 gxnsfc018009 2012 gxnsfaa053035),广西医药行业的人才小高地项目(1201),和重点实验室的基础化学和分子工程的药用资源。