文摘

糖尿病肾病(DN)是慢性肾功能衰竭的主要原因,表现为肾小球和间质纤维化。Epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT)在DN发病机理中起着重要的作用。通岳(TXL),中国草药化合物,已经使用在中国建立DN患者的治疗效果。调查TXL改善DN的分子机制,KK-Ay老鼠被选为评估模型在DN发病机理和治疗。在体外,TGF -β1用于诱导EMT。免疫印迹(WB)、免疫荧光染色和实时聚合酶链反应(rt - pcr)是用于检测EMT标记体内和体外的变化,分别。结果显示TGF -的表达式β1及其下游蛋白质smad3 / p-smad3 TXL组大大减少;同时,TXL恢复smad7的表达。结果,表达胶原IV (IV)上校和纤连蛋白(FN) TXL组明显减少。体内,24 h-UAER(24小时尿白蛋白排泄率)和面包(血尿素氮)降低,Ccr(肌酐清除率比率)是增加TXL组与DN组。总之,目前的研究表明TXL成功抑制TGF -β在DN 1-induced epithelial-to-mesenchymal过渡,这也许可以解释的治疗效果TXL-mediated renoprotection。

1。介绍

糖尿病肾病(DN)和其他慢性肾脏疾病特点是肾小球和间质纤维化。传统上,居民成纤维细胞被认为是肾纤维化的关键调解人;现在,令人信服的证据表明,间隙myofibroblasts的出现也会导致纤维化。这个过程的核心是epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT) [1]。研究表明,大约30%成纤维细胞来源于通过EMT在肾脏肾小管上皮细胞2]。

EMT是由不同的信号分子和转化生长因子β1 (TGF -β1)证明在EMT(中介原则3]。在糖尿病、高葡萄糖和其他刺激增加了生产的TGF -β1 (4]。TGF -β1有能力提高自己的表达导致ECM的积累和纤维化(5]。结合TβRII TGF -β1启动等下游信号蛋白的表达母亲对小decapentaplegic (smad)和增殖蛋白激酶(MAPKs)。失去钙粘蛋白(E-CA)和增益α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma)表达式是EMT的标志6]。结果,细胞外基质(ECM)如胶原IV (IV)上校和纤连蛋白(FN)的过度积累。随着肾纤维化的发展,许多患者可能发生终末期肾病(ESRD)和DN ESRD的主要原因,占全世界数以百万计的死亡(7]。在治疗DN和其他慢性肾疾病,大多数疗法瞄准等对症治疗法的控制血压和血糖。

随着现代技术的发展,中药的制备也得到了改进。通岳(TXL),中草药化合物开发二十年前,包括一组药物等人参答:最大经济产量。提取和芍药棺罩。提取(8,9]。这是在中国国家食品药品监督管理局注册。TXL已经被证明有一群潜在治疗价值,如防止细胞凋亡,改善内皮细胞功能,减少炎症和降低脂质(10]。它已被用于治疗心绞痛疾病在中国多年来(8]。根据这些积极影响,许多研究调查的机制,也就是说,TXL调节血管内皮功能通过诱导以挪士表达式通过PI-3K / Akt HIF-dependent信号通路(11]。TXL剂量依赖性增强易损斑块的稳定而高剂量辛伐他汀(12]。TXL显示对游离脂肪酸诱导内皮损伤保护作用促进细胞内抗氧化能力通过AMPK途径(8]。在治疗DN, TXL也显示了积极的影响。荟萃分析显示,TXL显著降低24小时尿白蛋白排泄率(24 h-UAER)和血液尿素氮(BUN) (13]。治疗早期DN, TXL可以改善肾微循环,减少Cys-C和阿联酋,延缓肾损害的进展(14]。但TXL改善DN的机制尚不清楚。纤维化是DN和过度的关键病理细胞外基质(ECM)的合成和积累,导致肾小球和肾小管病理,并最终死于糖尿病患者(15]。研究已经证实TXL的积极影响和一些组件的抑制肾纤维化或EMT。TXL减毒肾纤维化和减少TGF -的表达式β1,αsma在单侧输尿管阻塞老鼠16]。Ginsan多糖提取人参的积累,显著抑制TGF -β、胶原蛋白和αsma (17]。芍药苷(PF)的主要活性组分芍药帕拉斯,曾被报道以防止UUO小鼠肾纤维化的进展。PF的antifibrosis功效主要体现在提高组织病理学障碍和减少胶原蛋白沉积在肾组织18]。此外,PF成功表达下调TGF -β1表达和抑制肾脏纤维化smad2/3激活诱导UUO [18]。这些研究结果强烈支持的假设TXL可能减弱EMT在DN。

本研究的目的是探索机制TXL-mediated renoprotection并确定TXL能否抑制TGF -β1-induced EMT在DN。结果表明,TXL成功抑制TGF -β和TGF - 1表达β1-induced EMT, TXL可能是一个新的治疗糖尿病肾病。

2。材料和方法

2.1。通岳的制备超细粉的解决方案

通岳,超细粉被Shi-jiazhuang夷陵制药公司(采购很多。071201年,Shi-jiazhuang夷陵药业有限公司石家庄,中国)。它包含一组药物等人参答:最大经济产量。提取和芍药棺罩。提取。的详细配方TXL补充材料网上所示http://dx.doi.org/10.1155/2014/123497。草药药物验证和标准化的标记化合物根据中国药典(2005)。减少TXL不同批次的剂量变化,物种,起源、收获时间,药用部分,为每个组件和炮制方法是严格标准化。此外,高效液相色谱(HPLC)、高效毛细管电泳、气相色谱法是应用于量化TXL的组件。高效液相色谱是检查指纹色谱图的水提取物10批次进行相似性分析(12]。高效液相色谱法的详细结果可以在补充材料。超细粉的草药药物地面直径≤10μm超微粉粉碎机。体内实验中,750毫克/公斤TXL超细粉末溶解在aquadistillate intragastrically管理每一天。在细胞培养中,TXL超细粉末溶解在无血清DMEM / F12(杜尔贝科修改鹰的介质/ F12)。的解决方案是用近1小时在1164 g离心10分钟紧随其后。浮在表面的第二次离心机。最后,它是0.22过滤μm过滤器和储存在−20°C。与此同时,沉淀在60°C加热和干为了计算的实际体积溶通岳,超细粉。最终的浓度是2000μ克/毫升(19]。在体外实验中,稀释DMEM / F12。

2.2。动物

探索TXL TGF -的影响β1表达与肾小管EMT在DN, KK-Ay小鼠自发性动物模型的评价患者的发病机理和治疗DN (20.]。DN时被诊断出随机血糖(篮板)≥16.7更易/ L和尿白蛋白肌酸比例(ACR)≥300μg /毫克。C57BL / 6 j小鼠用普通饲料喂养KK-Ay老鼠与高脂肪饲料喂养4周。C57BL / 6 j小鼠填喂法与aquadistillate设置为正常对照组(正常,),KK-Ay老鼠强饲法与aquadistillate设置为糖尿病肾病组(DN组,)和KK-Ay老鼠TXL对待(750毫克/公斤体重/每天,填喂法)被设置为TXL集团(DN + TXL集团)。治疗12周后,血液和24小时尿收集。肾组织立即冷冻免疫印迹和rt - pcr和4% (w / v)多聚甲醛用于修复肾组织免疫荧光染色。C57BL / 6 j和KK-Ay小鼠购自中国医学科学院(8周的时代,北京)。实验动物管理规则的遵守卫生部,中国,和实验动物保健委员会批准的协议是首都医科大学,北京,中国。

2.3。细胞培养

人类肾tubuloepithelial细胞(职员)是在中国购买的细胞资源中心。这是孵化与杜尔贝科的修改鹰的中/ F12 (DMEM / F12)含有10% (v / v)胎牛cerum的边后卫。细胞被维持在37°C 5% (v / v)有限公司₂被水浸透的气氛。重组人类转化生长因子β1 (TGF -β1、eBioscience圣地亚哥,美国)被用来诱导EMT在体外的事宜。五个浓度(5 ng / mL-25 ng / mL)的TGF -β1和5个时间点(24 - 72小时)应用于观察TGF -的影响β1对EMT体外。10 ng / mL的TGF -的浓度β1被用来诱导EMT在以下研究。细胞暴露于10 ng / mL TGF -β1被设置为48小时TGF -β1组。为了测试在EMT TXL-mediated保护,我们首先事宜事先已经与TXL为30分钟之前他们暴露于TGF -β1 (8]。细胞暴露于10 ng / mL TGF -β1和250μg / mL TXL 48小时被设置为TGF -β1 + TXL组。细胞培养在正常没有TGF - DMEM / F12β1被设置为正常组。

2.4。rt - pcr分析

总RNA提取试剂盒(TIANGEN、北京、中国)按照制造商的建议。每个样本反向转录成cDNA使用上标二世逆转录酶(表达载体)。基因表达是比较的量化通过Ct方法(②)和相对量化计算(21- - - - - -23]。E-CA相对mRNA水平,αsma、smad3 smad7、坳IV和FN检查和规范化β肌动蛋白mRNA。所有rt - pcr进行了一式三份,数据提出了平均数±标准差。TGF -的引物β1、E-CAαsma、smad3 smad7、坳IV和FN在桌子上1。

2.5。免疫印迹分析

TGF -β1、E-CAαsma、smad3 / p-smad3 smad7被免疫印迹检测(如前所述)(24,25]。与鼠单克隆免疫印迹进行TGF -β1 (Abcam, 1: 500),兔子单克隆E-CA (CST, 1: 500),兔多克隆αsma (Abcam 1: 500),兔子单克隆smad3 (Abcam, 1: 500),兔子多克隆p-smad3 (CST, 1: 500)和兔多克隆smad7 (Epitomic, 1: 500)。膜被孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体(1:5000)。免疫印迹分析至少一式三份。微被检测到图像J [26,27]。

2.6。免疫荧光染色

肾组织部分准备在4% (w / v)多聚甲醛固定后石蜡和嵌入。半定量的分析,20大功率显微镜领域的肾组织被随机选中。分析了平均荧光活动image-pro + 6.0软件(28,29日]。细胞融合在盖玻片是80%与4% (w / v)多聚甲醛固定。半定量的分析,40大功率显微镜领域的细胞是随机挑选的,和平均荧光分析了活动image-pro + 6.0软件(28,29日]。抗体和稀释如下:兔单克隆E-CA (CST, 1: 50),兔多克隆αsma (Abcam, 1: 50),兔多克隆FN (Abcam, 1: 250),和兔多克隆坳IV (Abcam, 1: 250)。DAPI用于染色细胞核(蓝色)。共焦显微镜(徕卡TCS SP5 MP,海德堡GmbH,德国)被用在这个实验。

2.7。生化检测和光学显微镜

血液从小鼠空腹一夜之间在24周的年龄,和老鼠代谢笼收集24小时的尿液样本。组织光学显微镜在4% (w / v)多聚甲醛固定,然后嵌入石蜡。Four-micrometer厚的部分肾组织处理hematoxylin-eosin(他)和马森的三色的染色。

2.8。统计分析

结果表现为±SD至少有三个独立的实验手段。用SPSS17.0统计分析进行了。数据分析与单向方差分析。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。TXL TGF -的影响β1表达和EMT标记与DN肾

压倒性的证据表明TGF -β1作为管状EMT的关键中介[30.]。观察TXL是否影响TGF -β1表达和标记的EMT体内,rt - pcr检查的表达获得了TGF -β1在24周的年龄。rt - pcr结果表明TGF -β1在DN组较正常组显著提高(图1(一),)。与TXL接受治疗后12周,表达TGF -β1与DN组相比显著降低(图1(一),)。此外,免疫印迹结果与rt - pcr结果(数据一致1 (c)和1 (f))。TXL抑制TGF -β1 mRNA和蛋白表达水平。接下来,进一步验证TXL在管状EMT的影响,E-CA和αsma被rt - pcr检测、免疫印迹和免疫荧光染色,分别。rt - pcr和免疫印迹结果显示αsma是增强和E-CA减少DN组与正常组(数字1 (b),1 (c),1 (f),)。更重要的是,TXL显著下降αsma表达和增加E-CA表达式与DN组mRNA和蛋白水平(数字1 (b),1 (c),1 (f),)。免疫荧光染色显示了类似的结果,上皮标记E-CA明显减少,αsma是增加在DN组与正常组(数字1 (d)和1 (e),)。更重要的是,TXL显著恢复E-CA和治疗αsma表达式(数据1 (d)和1 (e),)。这些结果表明,TXL可以抑制TGF -β1表达和EMT的DN。

3.2。TGF -β1体外诱导Epithelial-to-Mesenchymal过渡

五个浓度(5 ng / mL-25 ng / mL)的TGF -β1和5个时间点(24 - 72小时)应用于观察TGF -的影响β1对EMT体外。增加了αsma和损失的E-CA EMT的标记。rt - pcr和免疫荧光染色法是用来显示的变化EMT标记。rt - pcr显示剂量依赖性的方式在E-CA mRNA的减少,最低10 ng / mL(图2(一个),还是正常的,与10 ng / mL),而αsma mRNA显著增加,达到峰值10 ng / mL(图2 (b),还是正常的,对10 ng / mL)。细胞暴露于10 ng / mL TGF -β1展出时间依赖方式E-CA mRNA的减少,在48小时内最低,而αsma mRNA显著增加,达到峰值(图48小时2 (c)和2 (d),对48小时)。此外,免疫荧光染色结果表明,荧光活性αsma明显增强,减少TGF -钙粘蛋白β1组与正常组(数字2 (e)和2 (f),)。TGF -β1也引起一个呈细长的表型变化事宜(图2 (g))。这些变化表明事宜已经开始失去上皮表型和改变了染色法标记来表达。

3.3。TXL TGF -的影响β体外1-Induced Epithelial-to-Mesenchymal过渡

确定TXL影响EMT体外,EMT的标记(αsma和E-CA)被rt - pcr检测。事宜进行了不同浓度的TXL (50 - 500μg / mL)。10 ng / mL TGF -β1是诱发EMT选择。rt - pcr表明TXL恢复E-CA表达剂量依赖性的方式,在250年达到顶峰μ克/毫升(图3(一个),与TGF -β1组,与250年μg / mL),而αsma表达被抑制,最低250μ克/毫升(图3 (b),与TGF -β1组,与250年μg / mL)。TXL积极扭转TGF -βE-CA和upregulation差别1-induced对这些αsma。

3.4。通岳TGF -的影响β1 / Smads信号途径在体内和体外

EMT的各种研究已经探讨了角色ofTGF -β1在激活smads [31日]。探索TXL是否会影响TGF -β1 / smads信号通路,肾组织和职员被rt - pcr和免疫印迹检测,分别。10 ng / mL TGF -β1应用于诱导EMT的事宜。细胞暴露于10 ng / mL TGF -β1被设置为TGF -β1组,细胞暴露于10 ng / mL TGF -β1和250μg / mL TXL被设置为TGF -β1 + TXL组。正常的细胞培养只有DMEM / F12被设置为正常组。体内,免疫印迹显示p-smad3 / smad3显著增加,smad7减少在DN组与正常组(数字4(一)和4 (b),),而p-smad3 smad3明显减少和smad7 TXL组与DN组(增加数据4(一)和4 (b),)。rt - pcr结果与免疫印迹结果(图一致4 (e))。此外,在体外,免疫印迹和rt - pcr还显示p-smad3的显著增加和smad3 TGF -β1组与正常组。相比之下,smad7显著下降(数字4 (c),4 (d),4 (f),)。重要的是,p-smad3 / smad3明显减少,smad7 TGF -增加β1 + TXL组相比,TGF -β1组(数据4 (c),4 (d),4 (f),)。因此,目前的结果表明,TXL积极已故p-smad3 / smad3表达式和smad7的表达增加。

3.5。预防由通岳,增强胶原IV、纤粘连蛋白的表达

EMT为细胞外基质(ECM)沉积铺平了道路,最终肾纤维化(32]。探索TXL在ECM的影响,利用rt - pcr检测胶原IV的变化(IV)上校和纤连蛋白(FN) mRNA。体内,结果表明坳IV和FN mRNA在DN组较正常组显著增加(图5(一个),),而第四坳和FN mRNA TXL组与DN组显著减少(图5(一个),)。同时,免疫荧光染色的结果还展出,坳IV和FN蛋白质在DN组较正常组显著增加(数据5 (c)和5 (d),)。重要的是,TXL成功地降低了坳IV和FN的表达蛋白(数字5 (c)和5 (d),)。此外,在体外,结果表明,TXL显著降低坳IV和FN mRNA的表达与TGF -β1组(图5 (b),)。重要的免疫荧光染色显示相同的结果作为rt - pcr(数字5 (e)和5 (f),)。重要的是,第四坳的结果和FN的表达在体外与体内的结果一致。目前的结果表明,TXL可能改善ECM沉积的作用。

3.6。24日的影响TXL h-UAER、面包和肌酸间隙比和形态学变化

尿白蛋白排泄率升高(阿联酋)是肾和心血管疾病的主要危险因素在2型糖尿病33]。肌酐清除率比(Ccr)通常是作为评价肾过滤功能。肾形态是由光学显微镜观察到在24周的年龄。与正常组相比,24 h-UAER和血液尿素氮(BUN)测定在DN组明显增加,Ccr下降时(数据6 (b),6 (c),6 (d),)。有趣的是,24 h-UAER和包被减少,Ccr增加TXL组与DN组(数字6 (b),6 (c),6 (d),)。他染色显示肾小管上皮细胞空泡变性的DN组和TXL部分改善。马森染色展出大量的胶原纤维和TXL积极减轻这些病理变化与DN组(图6(一))。目前的结果表明,TXL施加积极影响的DN通过减少阿联酋/包,增加Ccr。此外,它改善肾结构。

4所示。讨论

糖尿病肾病(DN),糖尿病患者死亡的主要原因,影响大约三分之一的糖尿病患者,为他们造成沉重的经济负担34]。关键的病理学基本DN是间质纤维化(25]。EMT tubuloepithelial细胞的间质性纤维化是一种广泛认可机制,维持在DN (35]。EMT可以诱导或由不同的生长和分化因子,包括TGF -β1和结缔组织生长因子(CTGF)。在这其中,TGF -β1已经收到关注EMT在纤维化的主要诱导物(31日]。在目前的研究中,rt - pcr结果TGF -展出β1 DN组表达明显增强,并指出TGF -的至关重要的作用β1在DN。与先前的报道(目前的结果是一致的36,37]。此外,我们选择检查几个行之有效的EMT在肾组织的典型事件和肾tubuloepithelial细胞被广泛应用于研究TGF -β1-induced EMT (25,38]。伴随着TGF -的增加β1表达,E-CA的表达明显减少αsma在DN组升高。在细胞实验中,TGF -β1诱发EMT职员评估得到的形态变化,表达增加αsma,下调的上皮钙粘蛋白标志。更重要的是,我们现在的小说发现TGF -β1能够诱导EMT以时间和剂量依赖的方式。细胞暴露于10 ng / mL TGF -β1 48小时使用诱导EMT体外实验。

提取中药通岳(TXL)等一批草药人参答:最大经济产量。提取、芍药棺罩。提取,在tlc syntheticum(39]。一些活性成分提取人参显著抑制TGF -β表达式[17]。芍药苷可以通过下调起到antifibrogenic作用smad3表达和磷酸化通过TGF -β1信号[40]。根据潜在有利的调节细胞信号事件的组件TXL在肾脏16,18),我们试图探索TXL能否抑制EMT在DN。重要的是,我们现在证明TXL明显抑制TGF -β1的表达在DN和抑制TGF -β令1-induced形态和表型变化。rt - pcr结果表明,TXL大大减少αsma mRNA表达和增加E-CA mRNA的表达。和差别E-CA对这些基因的抑制αsma upregulation看到在当前的研究是与250年最大μg / mL TXL的浓度。的药理机制TXL抑制EMT绝对是按照先前的研究;洪等人表明,抵消TGF -β1和其下游信号传感器,如smad3和smad7,可能是一种有效的治疗在抑制EMT (24,41]。目前的研究还表明,TXL能够负调节TGF -β1信号在几个水平。有证明TXL阻塞TGF -β和TGF - 1表达β1-evoked细胞表型的变化,我们检查了这些TGF - TXL干扰的能力β1信号元素。TGF -β1 upregulation smad3和p-smad3表情引起的,而减少smad7表达式。更重要的是,smads的变化被TXL恢复或多或少,反映在smad3 / p-smad3表达式的减少和增加smad7 TXL组中表达。先前的工作已经证明了smads参与TGF -β1-mediated EMT并证明调节这些smads抑制EMT的积极影响。通过减少TXL似乎抑制EMT TGF -β1-induced smad3 p-smad3表达式,与先前的研究一致(24,42]。smad7 TGF -负监管机构β1-induced EMT (43]。在目前的研究中,免疫印迹和rt - pcr结果表明,TXL显著增加smad7表达在体外和体内。TXL抑制EMT的最可能的原因可能是,TXL压制TGF -β下游信号级联TGF - 1表达和块β1在事宜。综上所述,目前的结果表明,TXL可能是一个积极的治疗在抑制TGF -β1-induced EMT。这些结果进一步支持TXL的治疗可能通过抑制EMT在治疗糖尿病肾病。

细胞外基质(ECM)过度沉积是DN的组织学特点,这是肾功能的逐渐下降密切相关44]。人参TXL是主要的组成部分;研究表明diabetes-induced upregulations ECM的蛋白质在肾脏明显减少人参管理;此外,蛋白尿在糖尿病小鼠预防(45]。然而,TXL改善肾脏结构和功能是否通过抑制ECM TGF -积累β1-induced EMT仍不清楚。现在发现确实支持这样的观点:TXL抑制坳IV和FN的表达在mRNA和蛋白水平。从这个意义上说,目前的结果可能占一部分,TXL改善肾脏结构和功能的机制。的确,我们观察到明显降低24 h-UAER和包子,Ccr TXL组增加的时候,比未经治疗的糖尿病小鼠。这些发现表明,TXL可能导致管修复和管理可能会加速肾功能的衰退中观察到糖尿病状态。目前的结果表明,TXL成功改善肾脏结构和功能,及其小说在糖尿病肾病治疗可能是极具吸引力的。

5。结论

总的说来,目前的数据提供了一个新的视角在分子TXL对DN的影响表明,TXL治疗抑制TGF -β1-induced EMT。但还需要更多的基础研究和临床研究未来调查TXL的积极作用在保护DN。此外,目前的数据激发进一步的研究探索中草药化合物的效果和机制,这可能有重要的治疗DN的适用性。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

承认

这项工作是支持由中国主要国家基础研究计划(973计划,没有。2012 cb518602)。

补充材料