文摘

Xiaoyaosan (xy)煎剂已被广泛用作传统医学治疗压力和抑郁症疾病在中国几千年了。这项研究的目的。观察xy汤的抗抑郁作用的潜在机制α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic酸(AMPA受体)与海马的突触可塑性相关引起的大鼠慢性固定压力(CIS)。材料和方法。动物被随机分为五组:对照组(1);(2)sham-operated组;(3)CIS集团,老鼠进行了CIS 21天;(4)xy汤治疗组;(5)6-cyano-7-nitroquinoxaline-2 3-dione (CNQX)积极组织,杏仁核的CIS老鼠单方面microinjected竞争谷氨酸受体拮抗剂,CNQX。独联体21天之后,空旷的田野测试(选择)和高架plus-maze测试(EPM)测量,海马CA的超微结构₁次区域由电子显微镜观察;GluR1和GluR2 mRNA水平的AMPA受体亚基在海马CA₁实时qPCR次区域被检测到。结果。老鼠受到独联体区中部的展出时间的增加和减少总距离的选择。在EPM,他们也显示,中心区域时间和减少条目,打开臂时间和条目,增加亲密的手臂。超微结构的损伤海马CA₁也观察到。xy煎煮,CNQX显示显著改善行为变化和海马CA的超微结构的损伤₁;xy汤也逆转CIS-induced减少GluR2 mRNA和增加在海马CA GluR1信使rna₁以及CNQX。结论。xy汤可以有效地产生抗抑郁效果,似乎涉及到AMPA受体相关的海马突触可塑性。

1。介绍

有充分的证据证明慢性应激可引起海马损伤,如树突突触可塑性,树突缩回,神经发生减少,细胞凋亡1]。突触可塑性的关键因素之一是指示压力反应是如何改变损害;的变化α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic酸(AMPA)受体的突触与突触可塑性的关系(2]。然而,应力诱导大脑的焦虑和抑郁涉及多个领域,如杏仁孔和前额叶皮层。

海马和杏仁核都是边缘系统的重要方面,在应激反应中起着主导作用。在解剖学上,几个海马杏仁核项目地区(包括CA₁区)(3,4]。和功能上,他们两人控制所涉及的系统压力。但似乎他们在应激反应有不同的行为。有发现杏仁核体积和减少海马体积增大在年轻女性抑郁症(5]。相当多的证据表明,杏仁核是非常参与调解与压力相关的对行为的影响和调节海马功能。此外,海马体和前扣带皮层抑制应激HPA激活,而杏仁核可提高糖皮质激素分泌(6]。

AMPA受体调节快速兴奋性突触传递的多数在中枢神经系统(2,7]。众所周知,谷氨酸是一种有效的神经元excitotoxin [8,当它与AMPA受体相结合α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic酸AMPA受体,它产生去极化和神经兴奋。激发触发器快速或延迟神经毒性可能是应激的神经损伤的一个重要原因。AMPA受体是由人类或heteromeric复杂的四个亚基,GluR1, GluR2, GluR3, GluR4 [2]。在成熟的海马,大多数AMPARs由GluR1-GluR2或GluR2-GluR3组合9]。AMPA受体主要分布在兴奋性突触的突触后膜。他们不是突触的静态组件,但是它们不断交付和移除的突触的反应神经活动(10]。量的变化或某些单元的AMPA受体可能影响兴奋性突触的活动和传播效果。这个动态过程中可能扮演着重要的角色在突触可塑性被认为引发方面的学习和记忆,也被压力下的神经损伤的致病因素之一。

我们先前的研究[11)发现,在海马CA AMPA受体的表达减少₁次区域增加在杏仁核的基底外侧核(BLA)暴露在独联体之后,和xy汤监管的影响上面的变化。

,因此,在目前的研究中,6-cyano-7-nitroquinoxaline-2 3-dione (CNQX),竞争谷氨酸受体拮抗剂,在杏仁核阻止microinjected AMPA受体积极控制。本研究的目的是进一步研究的潜在监管机制xy汤在突触可塑性相关AMPA受体在中枢神经系统特别是海马CA₁独联体的老鼠。

2。材料和方法

2.1。动物

共有100名男性Sprague-Dawley老鼠(北京Weitong利华国际实验动物研究中心),重量(230±10)g,被用于实验。他们被随机分成5组:对照组(1);(2)sham-operated组;(3)CIS组;(4)xy汤治疗组(xy组);(5)CNQX积极组。

动物们被安置在一个房间里,日常保健(20 - 24°C, 30 - 40%的相对湿度)和免费的食物和水。本研究进行了严格按照指南中建议的实验动物保健和使用的p . r .中国。协议是由动物实验的伦理委员会批准的北京中医药大学(中医药大学)。戊巴比妥钠麻醉下手术,是尽一切努力来减少动物痛苦。

2.2。xy汤的提取做准备

xy汤是由下列原料干:茯苓等)。狼(云苓),芍药笼罩。(白芍),乌拉尔甘草费。(甘草),北柴胡。柴胡、当归(摘要)。一昼夜的当归、白术macrocephala Koidz。(苍术Macrocephalae),薄荷Briq。(薄荷),生姜Rosc。(干姜Recens)。这八个草药是从北京同仁堂药材公司买来的,验证通过气俊杰,中医药大学,前处理以下程序提供的部门准备草药,在北京中日友好医院,如前所述12]。

2.3。手术

所有的老鼠除对照组与戊巴比妥钠麻醉(40 - 50毫克/公斤,i.p。)在适应了三天。动物保护在立体定位仪采用nonpuncture耳朵酒吧和一口酒吧。不锈钢引导插管(0.8毫米外径)。目的是向右杏仁核(坐标:美联社:−4.0毫米,李:4.4毫米,DV: 8.0毫米)(13]。插管提示注射部位上方1.5毫米,插管是附加到头骨与不锈钢螺丝和丙烯酸骨水泥、和细高插管内防止阻塞(14]。老鼠与独联体建立了1星期后进行手术,青霉素是由肌内注射抗感染。套管的组织学网站验证了染料注入在实验的最后,并演示了正确度。

2.4。压力过程和xy治疗

老鼠在CIS, xy, CNQX组进行每天固定应力3 h 21天如前所述。的xy decoction-treated老鼠给通过填喂法提取的混合物(5.32克/公斤)15),1小时前独联体每天21天。其他组的老鼠是蒸馏水。

2.5。颅内注射

CNQX (Sigma-Aldrich公司),选择性AMPA受体拮抗剂,溶解在99.5%二甲亚砜(DMSO) (Sigma-Aldrich公司),然后用无菌稀释0.9%盐水最终浓度为0.5μ0.5克/μL CNQX。注入的方法执行Padovan等人与少量修改14]。简单,一根细针刺(0.4外径)。介绍了通过引导插管,直到提示低1.5毫米套管结束。聚乙烯导管(PE 10)之间插入的上端牙科针和微量调节注射器。体积为0.5毫升注射在1分钟使用汉密尔顿(美国)微量调节注射器。气泡的运动在聚乙烯导管证实药物流和额外的喷射器替代了1分钟。单边intra-amygdala CNQX注入(0.5μL)是管理老鼠CNQX集团1日,4日,7日,10日,13日,16st, 19日和21天;车辆(无菌生理盐水)被用作控制。

2.6。行为过程:开放田地测试(OFT)

按照先前描述的程序执行公平贸易局(12]。22天,八点,所有老鼠放在一个安静的,封闭的房间周围黑色的窗帘在测试前10分钟,避免不利的环境干扰。每个老鼠被放置在中心区域(50厘米×50厘米)的开放田地盒(100厘米×100厘米×40厘米)轻;总距离(cm)和时间在中央区域(sec)被EthoVision跟踪记录和计算软件(Noldus信息技术有限公司、荷兰)。设备是用95%的乙醇彻底清洗后每只动物测试的气味影响下一个老鼠。

高架Plus-Maze测试(EPM)。按照测试执行下列程序。公平贸易局两小时后,每只老鼠放在升高加上迷宫的中心地带头面对一个开放的手臂。条目*区中部,张开双臂和封闭的武器和时间在中央区域,张开双臂,闭臂在5分钟内被EthoVision跟踪记录和计算软件。一个老鼠完成测试时,迷宫由95%乙醇打扫干净了。

2.7。电子显微镜

行为测试后,由电子显微镜分析了每组的三种动物,和动物和2%戊巴比妥钠麻醉(40毫克/公斤)和冷灌注0.9%氯化钠溶液接着灌流液溶液(4%多聚甲醛、2.5%戊二醛,和0.1摩尔PBS)。然后,大脑是孤立和后缀在2.5%多聚甲醛24小时;正确的CA₁海马区(2毫米×2毫米×2毫米)在宏观上从脑组织切除了。

嵌入电子显微镜,48小时内的部分清洗8倍0.1磷酸盐缓冲剂,后缀以2%为1.5小时,四氧化锇洗5 * 5分钟在PBS,脱水我通过一系列醇丙酮(50%,70%,80%,90%,95%,和100%,每10分钟),进一步脱水100%丙酮II, III两次40分钟,浸泡在一个比1:1丙酮溶液和环氧树脂的1.5小时,然后沉浸在纯树脂在室温下为3小时,37°C 12小时,12小时45°C, 60°C 48 h。块与徕卡一起区段连续节点超微切片机到70海里。部分被定位到1毫米开槽,piloform-covered,镀铜网格,沾8%醋酸双氧铀和0.4%柠檬酸铅。超薄部分在80 kV jeol - 1230扫描透射电子显微镜(TEM)。

2.8。实时qPCR

5每组样本被检测到实时qPCR。动物和2%戊巴比妥钠麻醉(40毫克/公斤),立即斩首,大脑被移除在冰上。侧海马CA₁地区在个别动物很快就被孤立Lein ES报道(16),放入1.5毫升无菌离心管,然后冷冻储存在−70°C。总RNA提取试剂盒试剂(英杰公司)根据一个标准协议。RNA在40稀释μL超纯净水,RNA浓度是由NanoDrop nd - 100分光光度计(热费希尔科学、威明顿、德)。

总RNA从每个样本被用来合成cDNA使用高容量cDNA逆转录工具包和基因Amp PCR系统9700(美国应用生物系统公司)。最后一个1的浓度μg / 100μL。实时PCR引物设计的基础上,报道cDNA序列。引物的序列如下:β肌动蛋白,向前5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′和反向5′-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3′;GluR1,向前5′-GAGGGGAGGGAAGACCAA-3′和反向5′-GCCGCATGTTCCTGTGAT-3′;GluR1,向前5′-AGAGGACCCTTGTCTGTC-3′和反向5′-GTGTTTGATGGCTTGAGT-3′;GluR2,向前5′-CTACCAATGGGATAAGTTCGC-3′和反向5′-TTCGCAGTCAAGGATTACACG-3′。实时PCR进行使用ABI 7700实时PCR系统(美国应用生物系统公司)和一个SYBR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司)在最后一个25的体积μL使用下面的热循环条件:30分钟95°C,紧随其后的是40 95°C的周期15秒,59°C 20年代,20年代72°C, 83°C 15 s。β肌动蛋白是作为内部控制。

在一式三份样本化验。相对数量的每个样本中的每个mRNA的表达作为信使rna的比例/计算β肌动蛋白。放大的相对数量产品是使用比较阈值周期执行制造商的手册中所描述的方法。

2.9。统计分析

数据表示为意味着±标准平均误差(SEM)。差异意味着测量单向方差分析(方差分析)和学生的t测试中,相关性修正为多个比较。被定义为统计意义。

3所示。结果

3.1。行为测试

3.1.1。选择

选择是一种行为测试测量大鼠的兴奋或沮丧状态,常用来评估探索性行为和反映大鼠的情绪反应在新的环境。在目前的研究中,这个测试是用来验证CIS模型是否成功。如数据所示1(一)和1 (b)相比,sham-operated老鼠,老鼠在独联体组显示减少总距离在5分钟(区域(中部),增加了时间)后放入户外区域。减少总距离被治疗有效逆转CNQX或xy汤();在中央区域治疗后下降,但没有统计学差异()。xy和CNQX显著改善CIS老鼠的行为异常。

3.1.2。按照项目

高架plus-maze测试也常用一个焦虑测试。独联体减少输入时间和花费的时间在中央区域,控制和sham-operated老鼠相比,图2(一个);,图2 (b))。减少被逆转的CNQX管理局(,数据2(一个)和2 (b))或xy汤(,数据2(一个)和2 (b))。

相比控制和sham-operated组老鼠的活动,进入次张开双臂CIS(后被减少,图2(一个))。类似的效果被发现在张开双臂所花费的时间(,图2 (b))。xy汤增加张开双臂的入境时间和时间(,数据2(一个)和2 (b))。CNQX显示更好的upregulation效果相比,xy,几乎达到了正常水平相比对照组(数字2(一个)和2 (b))。

没有发现显著差异在封闭的手臂条目的数量和时间之间的封闭的武器控制和sham-operated集团(数字2(一个)和2 (b))。所花费的时间在封闭的怀里在独联体相比显著增加控制和sham-operated老鼠,图2 (b))。xy汤减少所花费的时间在封闭的武器;CNQX显示类似的效果(,图2 (b))。

3.1.3。TEM

在次区域海马CA₁膜的控制和sham-operated对照组海马锥体细胞核非常光滑,和caryotin均匀分布(图3(一个))。各种细胞器,线粒体形态正常的粗面内质网,高尔基体,核糖体和自由被确定容易细胞核附近(图3(一个))。突触的结构是正常的;前和突触后膜都清晰的可视化;突触间隙,球形囊泡也明显(图3 (b))。通常这些突触的突触囊泡在清晰和圆(图3 (b))。和CIS的集团核海马锥体细胞的萎缩和metamorphotic,表现出致密的原子核,不规则,染色质团分散,线粒体变形和几个细胞内溶酶体在细胞液(图3(一个))。突触结构突触间隙和突触间隙都不清楚,相比之下,预处理和突触后膜的融合可以可视化明显(图3 (b))。

xy汤治疗后,没有明显的变化观察海马神经元和突触之间相对于对照组(数字3(一个)和3 (b))。

3.1.4。实时qPCR

实时qPCR分析表明,海马CA₁21天的压力增加GluR1 mRNA的内容(,图4(一))与sham-operated组;GluR1 mRNA水平降低了xy汤治疗后,但没有发现意义与CNQX阳性对照组(,图4(一))。sham-operated组相比,GluR2 mRNA水平较低的CIS集团(,图4 (b))。然而,xy汤治疗有效逆转GluR2 mRNA表达以及CNQX积极组(,图4 (b))。

4所示。讨论

经常是最受欢迎的评价方法之一行为研究,经常用来评估环境操作应用在啮齿动物的情感17,18]。另外在我们的实验中,我们观察到动物的行为利用EPM。这个乐器也被彻底验证作为一种非常有用的工具用来评估啮齿动物的情感状态(19]。开放领域的几个变量可以测量;例如,中间的时间被认为是表明情感反应,和总距离是为了指出运动和探索性活动(17,18]。中心区域的时间增加,降低了CIS老鼠的总距离显示有限的自发活动的一份声明中,焦虑和抑郁,导致减少了响应能力、认知能力、运动当老鼠被放置在一个小说的环境。xy汤逆转CIS-induced变化,确凿的我们之前的结果(12],CNQX显示类似的效果。这可能反映出xy和CNQX有抑制性影响大鼠慢性压力。

在我们按照项目测试,21天的CIS老鼠显示增加入住率的封闭的武器和减少占用的张开双臂和中心区域,被认为是表示焦虑或抑郁。据报道,动物早期克制展出时间百分比明显降低,张开双臂条目的数量;此外,克制诱导减少条目的总数(20.),这意味着暴露在充满敌意的环境可能产生行为和神经内分泌变化,涉及中枢神经系统的可塑性。在我们的调查中,发现xy汤有效逆转CIS-induced EPM行为变化以及CNQX积极控制。这些行为研究的结果清楚地证实和扩展先前的调查结果,连续管理xy汤具有抗抑郁作用。

CNQX,竞争AMPA受体拮抗剂(non-NMDA谷氨酸),发现抑制天真的大鼠的运动活动,而且没有观察到行为激励的症状(21]。在我们的研究中,探索行为的增加和运动活动CIS intra-amygdala后大鼠注射CNQX被观察到。这些发现似乎提供,阻断AMPA受体在大脑特定区域可能发挥重要作用在缓解或加重抑郁样行为引起的慢性压力。

电镜结果显示,在海马CA₁,一系列的细胞器官如细胞核和线粒体的超微结构损害在独联体锥体神经元和突触联系观察老鼠。线粒体是神经元的主要能源供应商。线粒体损伤或其他功能障碍会导致严重妨碍生产ATP和减少的主要神经能力和产生不同的变化,细胞结构和功能障碍。信息从一个神经元突触流动到另一个神经元。数量下降或突触的结构损伤可以引起梗阻引起的神经元信息传递改变神经递质传递。与先前的研究一致的锥体神经元反复应力可能会导致损失的(22),深刻的变化形态的苔藓纤维终端,CA和突触的重大损失₃和CA₁海马体(23),我们已经证明,在中枢神经系统突触可塑性改变了慢性压力。

慢性压力可能作为实验模型来评估潜在的细胞和分子改变与复发性抑郁症的后果。我们之前的研究发现,一般来说,海马体CIS的AMPA受体水平下降而增加他们的杏仁核BLA [11]。目前的数据表明,GluR1水平增加,而GluR2减少海马CA₁在暴露于CIS。相反的表达趋势GluR1和GluR2之间可能归因于不同的合成过程中,走私和内化。GluR1的高表达可能是归因于增强谷氨酸引起的慢性应激HPA轴兴奋性,和积累谷氨酸激活GluR1-containing AMPAR受体(24,25]。

GluR2表达式可以作为一个“分子开关”形成的Ca^{2 +}透水AMPA受体(26]。事实上,包含GluR2受体亚基钙不透水;只有受体缺乏GluR2单元(例如,heteromers GluR1/3)透水钙(27,28]。的位置GluR2 AMPA受体亚基可以取代GluR1 GluR2的差别和GluR3单元对这些基因的表达和刺激这些钙渗透后谷氨酸受体的增加会引起内源性神经的侮辱。

一些证据报道mRNA和蛋白表达的谷氨酸受体亚基GluR2海马CA₁被瞬态抑制全球缺血、持续或kainate发作;CNQX GluR2的差别改变了对这些亚基,防止海马神经元的神经毒性29日- - - - - -31日]。在长期的压力加工,多基因的共同作用,多层次,和multisignal通路导致海马的免疫功能的紊乱,海马细胞凋亡和增殖失衡(32]。这是符合组织的保护作用CNQX, GluR1和upregulation差别和xy汤对这些GluR2海马CA₁本研究应对21天的压力。

众所周知,xy汤在抑郁症疾病的临床治疗中扮演重要的角色在中国(33),和一些生物活性天然产物已确定从xy的草药汤33]。在中国医药理论,xy汤释放约束和鼓励肝脏气血的畅通,使心胸开阔和散漫的精神34]。我们之前的临床和实验研究表明,xy汤的主要成分是基数当归Sinensis(即。,胡柴in Chinese), which acts as a nervous system sedative and a pituitary adrenocortical stimulant and is used for treatment of menstrual disorders [35- - - - - -38]。

总之,本研究表明,xy汤可以扭转类似抑郁的行为变化引起的独联体和产生的效果类似于CNQX AMPA受体积极控制,这表明xy汤的机制之一可能减弱刺激海马CA₁减轻其损失。可能需要进一步的研究来证明xy汤可以有效地调节平衡的海马和杏仁核之间的AMPA受体兴奋性。

伦理批准

本研究获得的动物伦理委员会批准北京中医药大学,中国。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

郭元梁和小林进行动物实验和起草论文;两位作者的贡献同样这项工作。Guang-Xin曰执行的一些实验。Jia-Xu陈负责设计、监督实验,纠正手稿。所有作者阅读和修正,并批准了最终版本。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(30672578,30672578),中国国家杰出青年科学家基金(30825046)和项目创新研究团队在北京中医药大学(2011 cxtd-07)。我们感谢秀芳丁博士在北京中医药大学为她修改英语语法和单词。