文摘

褪黑激素和电针刺激(EA)都被认为是有效的治疗方法对中风。然而,还不知道这两个的组合疗法对瞬态局部脑缺血可能是有益的。本研究调查的影响褪黑激素和EA的预处理大鼠短暂性大脑中动脉阻塞(MCAO)模型。经过预处理的褪黑激素+ EA (MEA),瞬态MCAO在男性Sprague-Dawley诱导90分钟(SD)的老鼠。神经功能缺损评分、脑梗死体积,脑水肿比、神经炎症和凋亡瞬态MCAO后24小时内进行评估。炎症和凋亡相关介质的表达在大脑中也被调查。结果表明,意味着改善神经系统的结果,减少脑梗死体积,抑制神经炎症和细胞凋亡瞬态MCAO后24小时。的有利影响的差别可能来自对这些炎性proapoptotic介质和upregulation凋亡介质。因此,这些结果表明预处理的预防效果是短暂的局灶性脑缺血。

1。介绍

中风是一种严重的脑血管事件随着全球流行特别是在人口老龄化的社会,和缺血性中风是最常见的类型。静脉溶栓使用重组组织纤溶酶原激活物(rtPA)是唯一批准的治疗1]。许多neuroprotectants调查;他们有效的动物而不是中风患者(2- - - - - -4]。由于狭窄的治疗时间窗(5,6)和出血性并发症的风险很大,临床使用rtPA仅限于少量的中风患者(7]。因此,广泛关注综合疗法一直提倡反复治疗缺血性中风增加成功的机会(4,8,9]。此外,大多数当前的治疗重点是在脑缺血后处理。然而,积累的证据已经证明了预处理的功效疗法对脑缺血性损伤可诱导神经保护。

褪黑激素是一种强有力的抗氧化剂和自由基清除剂毒性效应在动物和人类10]。缺乏足够的证据表明其有效预防中风在不同的模型和动物物种11- - - - - -16]。虽然褪黑激素的有益作用及其相关机制可以进一步调查,一些临床科学家提出,褪黑素,加上其他neuroprotectants或有效的治疗方法,可提高治疗效果和延长治疗时间窗。此外,它是值得进行II或III期临床试验的褪黑激素在中风患者11]。

针灸已广泛用于中风病人在东亚几个世纪。很容易操作、经济和安全。EA是传统针灸的结合针灸(手动)和电刺激。据信提高针灸的功效,目前用于治疗各种疾病(17,18]。尽管使用西方科学方法在这一领域的研究仍在一开始,增加临床与实验出版物提供了生理而不是形而上学的证据来证实和解释针灸的现象和机制18- - - - - -22]。然而,针灸对中风的有利影响复苏仍有争议。这可能是由于实验设计不佳,不恰当的控制,和小样本大小(23]。

在中国传统医学理论,针灸穴位沿着(胃经线)尤其阳明胃经有效治疗弛缓性麻痹。Zusanli(圣36)是经典的中国古代医学文献记载的穴位几千年来,经常进行科学研究治疗中风。此外,文献综述表明,圣36和xiajuxu(圣39)主要研究穴位包括动物和临床研究(24,25]。他们的有利影响缺血性中风也已阐明和报告。在目前的研究中,圣36和39圣是EA的治疗选择。

证据的急性脑缺血的动物研究表明,组合neuroprotectants可能比单独给出的单药更有效。褪黑激素和EA都被认为是有效的治疗方法对脑缺血。然而,还不知道这两个的组合疗法对局部脑缺血可能是有益的。

越来越多的证据表明,预处理neuroprotectants有效改善神经结果和干扰脑损伤的机制26,27]。在目前的研究中,预处理的MEA进行检查是否意味着可以发挥对短暂性脑缺血神经保护和它背后的机制。

2。材料和方法

2.1。动物和外科手术

成年雄性SD大鼠体重介于250到280克,从实验动物获得单位,香港大学,12小时光明/ 12小时黑暗条件下。实验根据机构进行监管和指导委员会批准使用的动物生活在教学和研究(CULATR),香港大学。

瞬态局部脑缺血诱导使用血管内MCAO右侧瞬态(28- - - - - -30.与再灌注)。总之,正确的颈总动脉(CCA),右颈外动脉(ECA),右颈内动脉(ICA)是通过一个颈中线切口暴露。正确的ECA解剖自由及其远端分支凝固(双极电凝、GN60 Aesculap AG)和有限公司Tuttlingen,德国),5点丝缝合松散系在ECA树桩,和microclips暂时放在右CCA和ICA。一块硅胶涂层四点(5毫米层长度0.35 - -0.37毫米直径)尼龙缝线(Doccol公司雷德兰兹,CA;猫没有。4037)的腔插入正确的ECA树桩,5点丝缝合是轻轻地收紧,以防止出血。下尼龙缝合是通过对ICA轻轻先进进右侧大脑前动脉(ACA)封闭右侧大脑中动脉(MCA)在它的起源。老鼠受到90分钟的局灶性脑缺血,然后涂硅四点尼龙缝线小心地撤回允许再灌注。使用四点尼龙缝合伤口被关闭,老鼠被允许从麻醉完全恢复之前回到笼子里。

证实了焦脑缺血区域脑血流量明显变化(rCBF)激光多普勒流量计(MBF3D、沼泽仪器,德文郡,英国)。2毫米直径的毛刺洞是右侧的头骨在5毫米横向和2毫米后的前囱借助立体定位装置(SR-6N;Narishige科学仪器实验室,日本东京)。下激光探针是粘到磨孔。稳态基线值被记录在诱导脑缺血,rCBF也都归一化,并表示作为基线值的百分比。

2.2。实验小组

老鼠被分配到两个组:对照组和MEA组。(1)对照组:车辆、生理盐水含3%二甲亚砜(DMSO, Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),给出了通过腹腔内(i.p)注入瞬时MCAO前30分钟。虚假的EA治疗是每天一次,开始瞬态MCAO前6天。虚假的EA治疗期间,老鼠与腹腔注射戊巴比妥钠麻醉的剂量没有真正的EA刺激40毫克/公斤。(2)MEA组:单剂量的褪黑激素(10毫克/公斤)是通过一个ip注入瞬时MCAO前30分钟。同时在麻醉下,EA每天治疗了一次,开始瞬态MCAO前6天。褪黑激素(Sigma-Aldrich)溶解在1毫升含有3% DMSO的生理盐水。

一个示意图总结了实验程序(图的概述1)。所有的老鼠都牺牲了瞬态MCAO后24小时测定脑梗死体积、脑水肿比,和组织处理。大鼠神经系统的结果之前评估的牺牲。

2.3。操纵EA治疗

30分钟的真实或虚假的EA每次治疗应用在不同的时间点(日常管理在6天前瞬时MCAO)与韩寒的穴位神经刺激器(hans - 200的扛鼎之作医疗科技有限公司,有限公司,南京,中国)。刺激强度为0.5 mA,刺激频率2赫兹。四个不锈钢针灸针(0.25毫米直径25毫米的长度;Huatuo、苏州医疗器械厂、苏州、中国)插入双边4毫米深度为两个穴位,圣36和圣39。韩寒的穴位刺激器是连接到插入针灸针。这两个穴位的位置是基于置换的穴位系统在大鼠模型(29日),修改前动物从置换的穴位系统[30.]。圣36位于行dubi(圣35)的脚踝折痕后肢,近五分之一的线。圣39近3/5点圣35和脚踝的折痕。圣35位于大萧条的外侧髌骨韧带的后腿(图2)。

2.4。神经行为评估

神经功能缺损评分系统(nds)测试(表1)是用来量化神经行为瞬态MCAO后24小时内,是由一个失明的观察者。nds测试是改编自一个评分系统进行验证31日,32]。分数越高,更严重的是伤害。所有的老鼠都训练前操作熟悉测试环境。

2.5。脑梗死体积和脑水肿率测量

脑梗死体积的右大脑半球测量瞬态MCAO后24小时。深麻醉下后腹腔注射戊巴比妥为100毫克/公斤,大脑被移除,切成冠状切片2毫米厚使用啮齿动物的大脑矩阵(世界精密仪器,Inc .,萨拉索塔,FL)。氯化反应后2%的2、3、去除(TTC);Sigma-Aldrich) 20分钟37°C,大脑在10%福尔马林固定的切片(pH值7.4)。双方的每片进行扫描测量两半球和梗塞体积使用计算机辅助图像分析系统(美国国家卫生研究院形象J版本。1.36 b)。无污点的区域代表了缺血性病变。脑水肿率计算的体积比的左脑右脑。为了弥补脑肿胀的影响,实际的(纠正)梗塞体积计算通过梗死的体积除以水肿率。脑梗死体积被表示为一个百分比的侧半球[31日,32]。

2.6。组织学检查

在瞬态MCAO后24小时,老鼠深深与腹腔注射戊巴比妥麻醉在100毫克/公斤,先用0.9%的生理盐水灌注transcardially然后冰冷的4%多聚甲醛(Sigma-Aldrich) 0.1磷酸盐缓冲剂(PB;pH值7.5)。日冕的大脑部分的厚度4μm是用2毫米前和1毫米后前囱和苏木精和伊红染色(他)。末端转移酶的dUTP尼克结束标记(TUNEL)测定也使用一种原位细胞死亡检测工具执行(罗氏,印第安纳波利斯)。附近的大脑部分前囱0级选择量化。TUNEL-positive细胞的数量从5个选定区域内的梗死和半影的右大脑半球,分别。阳性细胞的数量被蒙蔽侦探数,表示为每平方毫米。光显微镜下分析了部分幻灯片(Axio视觉控制,卡尔蔡司,慕尼黑,德国)。

2.7。免疫印迹分析

免疫印迹分析是用来确定炎症和凋亡介质的表达。两组的老鼠斩首瞬态MCAO后24小时。梗塞区域(2毫米之间前和1毫米后的前囱)右大脑半球解剖的冰。样本放置在radioimmune沉淀试验(里帕)裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒和磷酸酶抑制剂(Sigma-Aldrich)。声波降解法5秒钟后,溶解产物一直在冰上30分钟。20分钟后在12000 g离心,收集上清液。蛋白质浓度测定用布拉德福德蛋白质分析工具包(Bio-Rad大力神,CA)。四十μ克总蛋白质与蛋白质混合加载缓冲区和分离使用10 - 15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)。蛋白质电泳后,被转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜(Bio-Rad)在4°C。后阻断特异性的结合位点与5%的脱脂牛奶膜Tris-HCL-based缓冲盐水渐变20 (0.1% TBST;Sigma-Aldrich)在pH值为7.4 1小时在室温下,一夜之间,膜在4°C的环境与主要抗体,包括肿瘤坏死因子-α(TNF -α)(1:200稀释;圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX),环氧酶2 (cox - 2)(1: 500稀释;圣克鲁斯生物技术),b细胞淋巴瘤2 (bcl - 2)(1: 500稀释;圣克鲁斯生物技术),Bcl-2-associated X蛋白(伯灵顿)(1:500稀释;圣克鲁斯生物技术)β肌动蛋白(1:2000稀释;圣克鲁斯生物技术)。三洗后与TBST(每15分钟时间),膜被孵化与辣根peroxidase-conjugated山羊二级抗体(anti-mouse, 1: 7000稀释;圣克鲁斯生物技术;或anti-rabbit, 1: 7000稀释;圣克鲁斯生物技术)在室温1小时。与TBST三洗后,蛋白质乐队可视化使用先进的化学发光(通用电气医疗集团生命科学、香港),记录下geldoc - 2000想象系统(Bio-Rad)和蛋白表达的相对强度量化使用数量一个软件(Bio-Rad)。

2.8。数据分析

所有的数据进行了分析使用SPSS(窗口13.0版本;SPSS Inc .)、芝加哥、IL)和表达为±SEM。一个样本t以及用于检测显著改变rCBF基线值在不同时间点的数据在每一个组。使用学生的数据进行了比较t以及。是用来推断统计学意义。

3所示。结果

3.1。相对rCBF

在短暂性脑缺血,规范化rCBF明显减少;没有统计上的显著差异在不同的时间点在同一组。在再灌注期间,规范化rCBF返回对基线值;没有统计上的显著差异在同一组。没有观察到显著差异之间的控制和MEA组在同一时间点在缺血和再灌注(),如表所示2,3,4。

3.2。意味着对神经功能缺损评分的影响

与对照组相比(),神经功能明显提高了MEA预处理(瞬态MCAO(24小时后)),如图3。

3.3。意味着对脑梗死体积和脑水肿的影响比率

图4(一)总结了代表大脑切片后的反应与TTC瞬态MCAO后24小时。对脑梗塞是明显的白色区域。图4 (b)总结了计算机辅助图像分析数据揭示了两组脑梗死体积相对短暂脑缺血后24小时。相对梗塞体积被表示为±SEM。与对照组相比(%),意味着预处理(%)明显减少梗塞体积25.7% ()。图5总结了数据揭示了脑水肿率两组短暂性脑缺血后24小时。两组之间没有显著差异()。

3.4。意味着对组织学变化的影响脑部炎症瞬态MCAO后24小时

附近的大脑部分前囱0级沾他揭示了瞬态MCAO后24小时(图组织学变化6)。在对照组,许多神经元坏死和中性粒细胞渗透瞬态MCAO后梗塞的皮层。在老鼠使用意味着,在缺血性脑皮层抑制中性粒细胞浸润。

3.5。意味着对组织学变化的影响大脑细胞凋亡的瞬态MCAO后24小时

五个地区内皮层和半影分别选择细胞计数的右大脑半球。许多TUNEL-positive细胞被认为在右大脑半球梗死和半影区域的瞬态MCAO后对照组24小时内。MEA预处理组,增加的数量TUNEL-positive大脑皮层细胞在缺血半影也显著降低(数字7和8)。

3.6。意味着对蛋白表达的影响炎症介质的瞬态MCAO后24小时

炎症介质的表达,包括TNF -α(图9)和cox - 2(图10),研究利用免疫印迹分析瞬态MCAO后24小时。免疫印迹的炎症介质得到从右大脑半球。与对照组相比,MEA预处理的调节蛋白表达显著降低TNF -α和cox - 2 ()。

3.7。意味着对蛋白表达的影响bcl - 2家族蛋白的瞬态MCAO后24小时

伯灵顿的表达和bcl - 2研究利用免疫印迹分析(数据11和12瞬态MCAO后24小时)。这些蛋白质免疫印迹是获得从右大脑半球。与对照组相比,伯灵顿的相对蛋白表达显著减少了MEA预处理()。bcl - 2蛋白表达的是方与对照组相比显著增加()。

4所示。讨论

越来越多的证据表明,预处理与各种neuroprotectants诱发有利影响对中风动物模型;然而,他们中的许多人有局限性和负面影响,可以防止病人的临床应用(33,34]。虽然建议疗法预防中风复发,如血压控制和抗血栓,强烈推荐在临床实践(35,36),其中的一些药物,如抗血小板和抗凝血剂,有引起出血的风险。因此,它是可取的发展不仅有效而且安全策略旨在预防脑缺血以及减少缺血性损伤。我们实验室的一项研究(未发表的数据)表明,后处理瞬态MCAO的MEA可能诱发神经保护作用。本研究探讨是否执行预处理联合疗法可以阻止大脑脑缺血性损伤。

首先,nds评分是预处理的效果,脑梗塞体积,脑水肿率调查。数据显示,与对照组相比,预处理MEA明显改善神经功能瞬态MCAO后24小时。同时,意味着大脑梗塞体积减少了25.7%瞬态MCAO后24小时。观察脑水肿率没有显著的变化。没有明显差异,rCBF数据在脑缺血和再灌注。

其次,是预处理的效果在短暂性脑缺血中风后组织学和细胞炎症检查。他的大脑部分染色显示许多神经元坏死和中性粒细胞渗透瞬态MCAO后梗塞的皮层。在老鼠使用意味着,在缺血性脑皮层抑制中性粒细胞浸润。此外,MEA预处理两促炎介质的调节蛋白表达降低,TNF -α和cox - 2在缺血性右大脑半球瞬态MCAO后24小时。这些结果表明MEA的抗炎效应对瞬态MCAO的预处理。

第三,是预处理的效果在组织学和细胞凋亡在短暂性脑缺血中风后评估。在目前的研究中,TUNEL染色的大脑部分显示,有许多TUNEL-positive细胞缺血性梗塞和半影对照组右侧大脑半球的瞬态MCAO后24小时。TUNEL-positive细胞的数量明显减少在同一地区的MEA预处理瞬态MCAO后24小时。

此外,意味着预处理proapoptotic蛋白质伯灵顿的水平降低,增加水平的抗凋亡蛋白bcl - 2后24小时内瞬态MCAO相比对照组。目前的数据表明瞬态MCAO的凋亡是预处理的效果。

先前的研究表明,诱导炎症反应在脑缺血后的脑梗塞及其周边地区(37]。各种促炎介质,如肿瘤坏死因子-α卒中后和cox - 2的调节。这些介质的过程中扮演关键角色脑损伤后神经元生存(38,39]。抑制肿瘤坏死因子-α减少了脑梗死体积和抑制炎症反应的小鼠模型的瞬态脑缺血(40]。cox - 2的过度表达可能加重脑损伤(41]。根据目前的数据,神经保护关于神经系统的结果和脑梗塞体积的抑制作用可能是部分原因是TNF -α和cox - 2。

脑缺血所带来的损害是由两个主要区域:梗塞核心和缺血半影。缺血性中风后神经细胞凋亡主要发生在半影区(42]。特别是瞬态局部缺血后,细胞凋亡可能是一个促进因素最终梗塞体积(43]。根据目前的数据,TUNEL-positive细胞的数量明显减少方预处理在半影区瞬态MCAO后24小时。这一发现可以部分解释MEA预处理后梗塞体积减少的结果。此外,巴克斯和bcl - 2提出不同的监管机构细胞凋亡在中风的早期阶段44]。Upregulation的伯灵顿的差别,对这些基因bcl - 2是反复观察到在脑缺血后的半影区(45]。伯灵顿抑制导致神经保护与中风(46]。bcl - 2表达的减少而导致增加氧化应激(46,47]。目前数据显示的凋亡效应意味着伯灵顿和upregulation差别预处理通过对这些基因bcl - 2。

总之,这项研究提供了一些初步的数据关于MEA短暂性局灶性脑缺血预处理的效果。目前的结果表明,对瞬态MCAO MEA预处理可以诱导神经保护的改善神经功能和降低脑梗塞体积。有益效果是部分通过抗炎和antiapoptosis介导的。

承认

这项研究受到了研究和会议委员会拨款(200907176032),香港大学,香港。