文摘
激活核factor-KappaB信号通路中起关键作用诱导炎性损伤。据报道,电针刺激可能是一种有效的抗炎治疗。我们旨在探索EA的复杂机制抑制NF -的激活κB信号通路和在短期内改善炎症损伤;尼莫绑定的影响域肽为此进行了比较。焦脑I / R是大脑中动脉闭塞引起的2小时。总数380名男性Sprague-Dawley老鼠的研究。神经行为学评分、梗死体积和il - 1的水平β和IL-13被检测到。NF -κB p65,我κBα、IKKα、IKKβ进行了分析和NF -的能力κB结合DNA进行了研究。EA治疗和NBD肽治疗减少梗塞面积,改善神经分数,和监管il - 1的水平β和IL-13。治疗减少IKK的表达α和IKKβ和改变NF -的表达κ我和B p65κBα在细胞质和细胞核;NF -的活性κB是有效地减少。我们得出的结论是,EA治疗可能会妨碍NF -的过程κB核易位。同时也会抑制NF -的活性κB信号通路改善局灶性脑缺血/再灌注后的炎性损伤。
1。介绍
局灶性脑缺血/再灌注的病理机制非常复杂,涉及到大量的不同的分子和细胞因子信号通路(1]。作为一种重要的和关键的病理过程后局灶性脑缺血/再灌注(2,3)的过度激活炎症可以诱发更为严重的损害,甚至比缺血性损伤本身的致命伤害(4]。发生炎症病理过程,通过放大级联、NF -κB信号通路(5),和复杂的细胞因子网络对炎症反应的发生[至关重要6,7]。此外,需要使用更为复杂的方法治疗局灶性脑缺血/再灌注,因为狭窄的治疗时间窗和复杂的这种疾病的病理特征(8]。在亚洲,特别是在中国,电针刺激(EA)是一个通用的方法治疗脑血管疾病。许多报道的基础研究和临床研究已经讨论了EA在调节炎症损伤的疗效[9- - - - - -12]。然而,EA的确切机制和功能目标治疗需要阐明。值得注意的是,EA的机制抑制NF -的活性κB信号通路在脑缺血/再灌注的早期阶段需要讨论。
NF -κB家族转录因子由五名成员组成,p50, p52, p65 (Rel):, Rel B NF -κB的原型是一个异质二聚体由RelA (p65)和NF -κB1 (p50)子单元。这变种是最有效的基因在NF -反式激活因子κB家族和主要的NF -κB蛋白质在细胞核13,14]。我抑制蛋白κBα,这面具(NLS)的NF -核定位信号κB p65蛋白和让他们隐藏在细胞质的非活动状态,导致不断穿梭NF -κB /我κBα细胞核和细胞质之间的配合物15,16]。堕落的我κBs(特别是我κBα)是一种快速诱导信号事件发起在特定分子的磷酸化激活IKK [16,17]。IKK复杂主要包含IKKα、IKKβ和调节亚基尼莫(NF -κB调制器/ IKK至关重要γ)。IKKγ不是功能的缺失与IKK的互动α和IKKβ(18]。因此,NF -κB p65 /我κBα、IKKα、IKKβ被认为是最重要的因素在激活的NF -κB信号通路在病灶的早期脑I / R。因此,我们将观察变化的重要因素,以探讨EA治疗炎症损伤的机制后焦脑I / R。
NF -κB特定抑制剂(野生型)NBD肽破坏尼莫(IKK之间的交互γ)IKKβ有一些优势包括以下几点:(1)不影响基底NF -κ活动,(2)有明确的分子网站的行动,(3)是一种特别的古典NF -κB和不影响NF -激活途径κB替代途径,(4)不目标激酶的活性域,因此不太可能影响到其他重要的激酶(19]。NBD肽的药理学特点提示一个清晰的了解的机制NBD肽抑制NF -过度κB激活(20.]。相反,EA的机制抑制NF -κB信号通路激活还不清楚。因此,我们使用NBD肽作为一个积极的干预方法控制IKKs函数研究为了调查过度激活的EA机制抑制NF -κ局灶性脑缺血/再灌注后B。此外,EA和NBD肽治疗的影响相比,这一过程是为了进一步阐明底层机制和EA治疗的目标。
根据传统的中医理论和基本的针灸研究的原则,“Baihui”(问20)和“Siguan”穴位选择了在这个研究。“Siguan”穴位由两个“风池”(李4)和两个“Taichong”(LR 3)穴位。我们的目的是定义EA治疗的有效的目标和机制,影响了NF -κB信号通路及其功能减轻炎症损伤后局灶性脑缺血/再灌注早期阶段。
2。材料和方法
2.1。动物
在我们的研究中使用的实验协议是动物实验伦理委员会批准重庆医科大学第一附属医院和所有程序按照美国国立卫生研究院进行动物研究指南(指导护理和使用实验动物)。雄性SD大鼠(280 - 300克)是由重庆医科大学实验动物中心,安置在控制条件下12小时光/暗周期,温度22±2°C,湿度在60%到70%之间,至少一个星期前手术和治疗。动物们被允许自由进入标准的啮齿动物的饮食和自来水。总380只老鼠被随机分为四组:虚假的组(),I / R组(MCAO 2 h,),一个EA组(),NBD集团()。这些小组评估了在再灌注后6 h 48 h。
2.2。感应的局灶性脑缺血/再灌注
瞬态局部脑缺血是引起MCAO大鼠如前所述(21,22]。简而言之,SD大鼠禁食12小时,但手术前被允许免费使用水。麻醉诱导与3.5%水合氯醛(100 mL / g)腹腔内注射。右颈总动脉和颈外动脉通过下腹正中暴露颈部切口,结扎向近端,暂时。2.0单丝尼龙缝线(Ethicon尼龙缝线;Ethicon Inc .,日本大阪)提示插入圆形在火焰加热通过arteriectomy颈总动脉略低于颈动脉分叉然后先进到颈内动脉大约18毫米至20毫米远端颈动脉分叉到轻微阻力显示闭塞起源的大脑前动脉和大脑中动脉。再灌注是通过撤回的缝合2 h后缺血。切口缝合,消毒。37°C上的动物保持恒温。虚假的手术进行缺血/再灌注(I / R)插入手术小组的尼龙单丝缝合到10毫米到颈内动脉; do not insert into the middle cerebral artery.
在所有动物体温监测。直肠温度维持在38°C±0.5°C的所有部分实验通过直肠热敏电阻探针和恒温调节的加热灯放置高于动物的身体。Intrastriatal温度监控和调整通过操纵一个小的高度高强度灯放在上面。缺血性侮辱前,intrastriatal温度举行36.5°C±0.5°C在所有组缺血(23,24]。
2.3。电针刺激治疗
EA组,总SD大鼠()与3.5%水合氯醛麻醉(100 mL / g)腹腔内注射。根据实验动物穴位映射,“Baihui”(问20)/“Siguan”选择穴位,位于十字路口的矢状面中线和线连接的耳朵,第二掌骨桡侧的中点,第二个脚趾胫骨后方的抵押品方阵。这些穴位刺激的强度1 mA和2/20 Hz频率为30分钟使用G6805-2 EA工具(模型没有。227033;北京鑫升有限公司,中国)。SD大鼠保持在37°C恒温表。EA治疗是每天一次(从再灌注后6 h 48 h)。缺血2 h后,开始第一个EA治疗尼龙单丝时撤回。从6 h 48 h, EA治疗两次,3次,4次,5次有序。
2.4。药物干预方法
NBD肽(恩佐生命科学公司,没有。bml - p607 - 0500,溶于50μ10 L DMSO,最终浓度μ克/μL)是第一次注射intracerebroventricularly 2 h手术前如前所述[25]。短暂,总72只老鼠被麻醉,附加到立体定位仪(美国Stoelting)。根据立体定向映射结合老鼠大小,我们确定正确的侧脑室位置和钻颅窗口(十字中心,对1.3毫米,落后1.5毫米,下行3.8毫米)的注射5μL NBD肽一旦每一天,直到再灌注后48 h。NBD肽注射时间从6小时至48 h是两次,3次,4次,5次。
2.5。神经行为评价
神经行为进行评价的I / R组,EA组和NBD肽组。局灶性脑缺血/再灌注后不同时间点,模型SD大鼠的神经功能缺陷评分进行评估的侦探不知道动物分组。修改后的神经功能缺陷评分被巴隆等人被用于神经系统评估。0:没有赤字;1:未能延长左前爪完全;2:绕到左边;3:向左下降;4:没有带着沮丧的自发的意识水平。动物得分2到3包含在实验。神经行为评分测定根据加西亚等描述的方法。26)和Bederson et al。27]。
2.6。梗死体积的评估
动物(为每个组)被斩首,2毫米厚日冕部分从整个大脑沾2% 2、3,去除氯(Sigma-Aldrich)评估梗塞体积,如王et al。所述28]。
2.7。免疫组织化学分析
免疫组织化学进行了使用avidin-biotin-peroxidase复杂的方法。简单地说,大脑被固定在4%磷酸盐多聚甲醛(PFA)和沉浸到20%蔗糖3 h。4毫米厚冠脑片被切断,开始8毫米离开前的额叶。然后减少纵向(从上到下)是大约2毫米从中线缺血性脑切除内侧部分。石蜡包埋组织切片和脱蜡为抗原检索沉浸幻灯片在0.01 mol / L柠檬酸缓冲,pH值为6.0,其次是在微波炉加热(温度92 - 98°C) 20分钟。部分被冷却到室温和PBS 5分钟清洗和内源性过氧化物被封锁在3% H2O215分钟。部分是培养30分钟5%正常山羊血清非特异性结合。主要的抗体,NF -κB p65 (C22B4)兔马伯(细胞信号技术,1:50),添加和部分在4°C的环境中过夜。应用SP设备使用。消极的虚假的集团,主要抗体与PBS代替。缺血半影区从每个部分的幻灯片图像扫描并获得使用一个奥林巴斯PM20自动显微镜(奥林巴斯、东京、日本)和tcfy - 2050(远Inc .,北京)病理系统。每个部分图像的视觉领域(在每个大脑)五个部分进行了分析使用地中海Motic 6.0 CMIAS病理图像分析系统(北京航空航天Motic Inc .),北京,中国)。
2.8。Double-Immunofluorescence标签
脑组织固定和冷冻,10μ米厚的冠状切片切开始前的8毫米的额叶。冻结部分风干在50°C为30分钟。部分服用10 mol / L柠檬酸钠缓冲(pH值6.0)并在微波炉中加热20分钟在92 - 98°C。组织洋溢着1% Triton x - 100,和部分孵化5%山羊血清1 h在37°C。孵化项目在4°C与初级抗体进行了一夜。主要的抗体NF -κB p65 (C22B4)兔马伯(细胞信号技术,1:50)κBα(L35A5)鼠标马伯(细胞信号技术,1:50)、IKKα(m - 110)(圣克鲁斯,不。sc - 7183, 1: 25)、IKKβ(P-20)(圣克鲁斯,不。sc - 34673, 1: 25)。洗后,幻灯片被孵化与荧光isothiocyanate-conjugated anti-rabbit (1: 50), anti-mouse(1: 50)和抗体(1:100)为2 h抗体37°C。最后,考察了部分缺血半影区激光扫描共焦显微镜在奥林巴斯IX70倒置显微镜(奥林巴斯、东京、日本)配备Fluoview FVX共焦扫描头(徕卡Microsystems海德堡GmbH是一家位于德国)。
2.9。荧光定量聚合酶链反应
细胞总RNA分离与试剂盒(表达载体,佩斯利,英国)。互补脱氧核糖核酸合成与上标逆转录酶(表达载体)。iQ5梯度的聚合酶链反应进行实时PCR检测系统(Bio-Rad)使用引物(Takarad) NF -κB p65,我κBα、IKKα、IKKβ(表1)。数据分别归一化的均值相对GAPDH的表情。定量PCR (Q-PCR)是使用热启动执行核心荧光PCR试剂盒(SYBR绿色我),每个反应混合物包括第一链cDNA模板,1.25μprimer-probe L和12.5μ25 L SYBR绿色的总量μl .以下循环使用条件:95°C 10分钟,其次是40 95°C的周期5 s为30年代和60°C。随后,每个样品进行了分离曲线分析检查primer-target特异性如前所述[29日]。
2.10。免疫印迹分析
老鼠用3.5%水合氯醛麻醉(100 mL / g)腹腔内注射。大脑皮层缺血区域的均质在里帕裂解缓冲(Beyotime,没有。P0013B)。总蛋白和胞质/冰核蛋白质提取使用核和胞质蛋白提取试剂盒(Beyotime,不。P0027)。免疫印迹分析和45μg蛋白提取10% sds - page分离,然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(密理博公司)。非特异性抗原表位与5%脱脂牛奶/ Tween-20-Tris-buffered盐水被封锁。以下主要抗体被用于double-immunofluorescence标签分析:适当的辣根过氧化物酶结合的抗体(anti-rabbit (1: 4000), anti-mouse(1: 4000)和抗体(1:1000)二级检测抗体是孵化2 h。Bio-Rad装置(Bio-Rad实验室、里士满、CA)和数量一个软件版本4.6.2 (Bio-Rad实验室)是用来扫描免疫印迹和分析。
2.11。电泳迁移率改变分析(EMSA)
核提取准备如前所述。NF -κNF - B双链寡核苷酸对应κB共识序列(5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′)是来自圣克鲁斯和end-labeled与末端转移酶(TdT)使用Biotin-11-dUTP(皮尔斯)。核提取物(8μg)在室温下孵化与1 20分钟μL EMSA / Gel-Shift缓冲区。竞争研究,样品也孵化与100倍的无标号(冷)寡核苷酸或标记寡核苷酸突变。dna蛋白质复合物是解决nondenaturing 5%聚丙烯酰胺凝胶在0.5×20 mA 3 h Tris-Borate EDTA。紫外线交联后,样品被封锁和孵化streptavidin-HRP共轭(15毫升)。杂化样品开发和分析使用杂交孵化器(wd - 9403 e,北京)。
2.12。酶联免疫吸附试验(ELISA)
il - 1的水平β在大脑胞质IL-13分数和血清中分析了酶联免疫吸附试验(Bender,没有。81 - bms630/96t;Abcam,不。ab100766/96T)。
3所示。统计分析
软件SPSS 16.0对Windows (SPSS . n:行情)、芝加哥、IL)是用来进行统计分析。所有的值表示为平均数±标准差(标准差)。数据分析单向方差分析和多元组间差异进行检测分析,其次是LSD测试。神经赤字分数表示为中值(范围)和克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行了分析,其次是Mann-WhitneyU测试Bonferroni调整。的值被视为具有统计学意义。
4所示。结果
4.1。EA和NBD肽治疗明显减少缺血/再灌注损伤后局部脑缺血/再灌注
以下4.4.1。神经行为评价
焦脑I / R后,大鼠显示神经赤字行为在每一个时间点(图1)。再灌注后6 h 48 h,与I / R组相比,EA组和NBD组神经行为评分的改善()(图1)。NBD组效果更显著比EA组()(图1)。这些结果表明,EA治疗和NBD治疗改善神经功能缺陷的症状在I / R和促进了运动恢复程度。它表明,EA可以减轻缺血性病变焦的超早期脑I / R。
4.1.2。梗塞卷MCAO后/ R值
EA组的梗死体积显示一个更小的脑梗死体积比I / R组()(图2)。NBD组的脑梗死体积比这更显著降低在EA组和I / R组()(图2)。数据表明EA和NBD肽治疗可以明显减少梗塞大小。此外,NBD肽的影响比EA治疗更为重要。
(一)
(b)
4.2。EA和NBD肽治疗后,il - 1的水平β减少,IL-13水平增加局部脑缺血/再灌注大鼠吗
焦脑I / R后,il - 1的水平β从6 h显著增加到48 h在大脑中(数据3(一个)和3 (b))和血清中(数据3 (c)和3 (d))。然而,在EA组和NBD组,il - 1β水平显著降低,低于I / R组()(数据3(一个)和3 (b))。IL-13水平增加I / R组,尤其是在48 h在大脑和血清中24小时。在EA组和NBD组大脑和血清,IL-13水平均明显高于在增加I / R组在同一时间点()(数据3 (c)和3 (d))。EA组IL-13水平达到24 h在大脑和48 h血清和达到12 h和24 h NBD集团(数字3 (c)和3 (d))。这些数据表明,EA和NBD肽治疗有效地降低il - 1β在大脑和血清水平和增加IL-13水平。因此,EA和NBD肽治疗有效降低il - 1的数量β和抑制炎症造成的损害因素在早期阶段。但NBD肽和EA的高峰时间点治疗是不一样的。
(一)
(b)
(c)
(d)
4.3。EA和NBD肽治疗可能抑制NF -κ通过调节NF - B信号通路激活κB核易位
免疫组织化学分析,NF -κB p65蛋白表达是焦脑I / R后进行的。在虚假的集团,NF -κB p65蛋白主要表达于胞浆(数字4(一)和4 (b))。然而,焦脑I / R后,观察表达在细胞质和核的神经元缺血半影区,尽管NF -的高表达κB p65蛋白在细胞核中发现比在细胞质中()(数据4(一)和4 (b))。NF -的重要变化κB p65蛋白表达在EA组和NBD组观察到,这主要是在细胞质中而不是在细胞核中发现()(数据4(一)和4 (b))。这些观察表明,本地化的NF -微分κB p65蛋白在细胞质和细胞核是EA和NBD肽治疗后改变,从而表明EA和NBD肽可以有效地抑制NF -的过程κB核易位。
(一)
(b)
4.4。EA和NBD监管NF -肽治疗κB p65 /我κBα反馈回路抑制NF -κB核易位
NF -的蛋白表达和本地化κB p65(绿色)和我κBα(红色)在脑缺血半影区被double-immunofluorescence染色检查。如图5在虚假的组,低水平的NF -κ我和B p65κBα蛋白表达观察整个半球。后焦脑I / R, NF -κB p65蛋白表达都被观察到在细胞核和细胞质,与此同时有一个小的表达我κBα蛋白质在细胞核(图5)。相比之下,NF -κB p65蛋白表达显著降低在EA组和NBD组细胞核;我的κBα在细胞质和细胞核蛋白表达显著增加(图5)。Double-immunofluorescence NF -分析κ我和B p65κBα蛋白表达表明NF -κB p65蛋白主要定位于细胞质中,而我κBαEA后细胞核和细胞质中高度表达,NBD肽治疗。
荧光quantitation-PCR分析表明NF -的表达κB p65 mRNA在I / R组显著增加24小时和48小时高于EA组和NBD组()(图6(一))。我的表达κBα信使rna在EA组和NBD组明显增加,高于在I / R组()(图6 (b))。
(一)
(b)
NF -的表达κ我和B p65κBα蛋白质是由免疫印迹分析虚假的集团中,I / R组,EA组,NBD组。在I / R组,NF -的表达κB p65蛋白在细胞质中逐渐减少,与此同时我的低水平κBα蛋白质检测。与I / R组相比,NF -的表达κ我和B p65κBα蛋白质在EA组和NBD组增加()(数据7(一),7 (c),7 (e))。在细胞核中相比,NF -的表达κB p65蛋白显著增加I / R组和EA组明显减少,NBD集团()(数据7 (b)和7 (d))。我的表达κBα蛋白质在EA组明显增加,NBD集团,这是高于I / R组()(数据7 (b)和7 (f))。这些数据表明,EA和NBD肽治疗有效地改变了NF -的表达κ我和B p65κBα蛋白质在细胞质和细胞核后焦脑I / R。他们减少了NF -κB p65蛋白在细胞核中表达和维护它在细胞质中,而我κBα蛋白表达增加在细胞核和细胞质。因此,这些数据表明,EA的机制和监管NF - NBD肽治疗κB核易位与高我的表情κBα在细胞质和细胞核。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4.5。EA和NBD肽治疗规范IKK的表达α和IKKβ局灶性脑缺血/再灌注后信使rna和蛋白质
IKK的表达α(绿色)和IKKβ(红色)蛋白质被double-immunofluorescence染色检查假组I / R组,EA组,NBD肽组。如图8,小IKK的表情α和IKKβ蛋白质是虚假的组(图中观察到8),他们是焦脑I / R后显著增加(图8),但在EA组和NBD组明显减少,特别是减少IKKβ表达式(图8)。
荧光quantitation-PCR (Q-PCR)分析表明,IKK的表达α和IKKβ信使rna在I / R组显著增加()(数据9(一个)和9 (b))。IKK的αmRNA表达在EA组显著降低,低于在I / R组()(图9(一个))。表达高峰NBD组高于在EA组()(图9(一个))。与I / R组相比,IKK的表达β信使rna在EA组明显减少()(图9 (b))。NBD组、IKKβmRNA表达是微不足道的从6 h 48 h(图9 (b))。
(一)
(b)
IKK的蛋白表达α和IKKβ被免疫印迹分析。在I / R组、IKKα从6 h蛋白表达持续增加到48 h(数字10 ()和10 (c))。IKK的表达α蛋白质在EA组下降,低于I / R组()(数据10 ()和10 (c))。NBD组,表情也减少,但仍然远高于在EA组,特别是在12 h ()(数据10 (b)和10 (d))。IKK的表达β蛋白质在I / R组显著增加,尤其是在24小时和48小时()(数据10 ()和10 (d))。与I / R组相比,表达式在EA组显著减少()(数据10 ()和10 (d))。此外,NBD组、IKKβ蛋白表达是持续低6 h 48 h ()(数据10 (b)和10 (d))。这些数据表明,EA和NBD肽治疗可以有效地减少IKK的高水平β焦脑I / R后表达,特别是在24小时和48 h。与NBD肽组相比,其他EA治疗可以减少IKKα蛋白表达。
(一)
(b)
(c)
(d)
4.6。EA和NBD肽治疗有效监管的DNA结合能力NF -κB
电泳迁移率改变分析(EMSA)被用来进一步研究所有NF -活动κB后焦脑I / R和活动的变化由EA NBD肽治疗干预。NF -的活性κB I / R后增加,尤其是在24小时和48 h,表明NF -的DNA结合能力κB是高I / R组()(数据(11日)和11 (b))。在EA组和NBD组,NF -的活性κB显著降低(),之间没有显著差异()(数据(11日)和11 (b))。结果表明,EA和NBD NF -肽治疗有效地减少了活动κB。
(一)
(b)
5。讨论
在目前的研究中,我们调查了抗炎效应和NF - EA的可能机制κ局灶性脑缺血/再灌注后B信号通路。首先,我们发现EA治疗有效地降低脑梗死体积和提高神经行为评分,似乎能够减轻缺血性损伤。其次,EA治疗也监管白介素(il - 1的水平β和IL-13)在大脑和焦脑I / R后血清。比所有这些更重要的是,我们观察到EA治疗减少IKK的表达α和IKKβ蛋白质,也许IKK的功能下降α和IKKβ,然后调节NF -κB p65 /我κBα反馈回路激活的NF -κB有效信号通路在早期阶段的焦脑I / R,这表明,EA显然防护和抗炎效应在局灶性脑I / R损伤,通过激活的机制与抑制NF -κB信号通路在很早的阶段。此外,对IKK的影响α和IKKβEA治疗和NBD肽之间显著不同。
炎症反应是一个重要的病理一步焦过程中的脑I / R,导致神经元死亡和快速加剧缺血性损伤和身体负担(30.]。因此,有效地抑制炎症的发生和发展是一个重要的目标和方向治疗局灶性脑I / R。导致炎症反应的细胞因子包括TNF -α,il - 1βcox - 2,进气阀打开,和许多其他类型的因素31日]。il - 1β是一种神经毒素和炎症反应的主要刺激因素。降低il - 1的水平β可以显著改善缺血梗死体积和炎症的发生32]。相反,细胞因子il - 10和IL-13等更好地发挥抗炎作用。炎症反应引起的il - 1β刺激是显著抑制IL-13 [33]。集中在缺血性脑和血清炎性细胞因子,我们观察到的水平和峰值的时间表达il - 1β和IL-13受EA NBD肽治疗。这些数据表明,EA治疗可以发挥显著的抗炎效应在早期阶段的焦脑I / R像NBD肽的功能。然而,NBD肽的作用更显著的细胞因子的调节。
为了调节炎性损伤发生在再灌注后的早期阶段,有必要抑制NF -的激活κB信号通路由焦诱导脑I / R。在激活过程中,NF -κB信号通路,p65和我之间的交互κBα核易位是关键步骤(34,35]。在目前的研究中,我们观察到,NF -κB p65表示在细胞质和细胞核,NF -κB p65主要表现在焦脑I / R后核。它表明,大脑缺血和缺氧病理因素刺激了p65主要表达于细胞核和促进了NF -κB核易位过程。我们观察到EA和NBD肽治疗主要维持胞质p65水平高,显著降低核。这项发现表明,EA有效抑制p65核易位和保持它在细胞质中,我们还发现NBD肽治疗后。按照一般的理解NF -κ核NF - B信号通路,κ我开车κBα表达式生成一个负面反馈循环(36,37]。在目前的研究中,我们发现,EA治疗显著增加κBα表达在细胞质和细胞核,尤其是在细胞核表达,改变了NF -κ我和B p65κBα蛋白质在细胞核表达。结果表明,可以调节NF - EA治疗κB /我κBα反馈回路在细胞核和细胞质。最重要的是,它表明,EA促进活动heterotrimer生成核通过增加κBα表达式在NF -κB /我κBα反馈回路,然后保持p65胞质水平高。可以推测的是抑制NF -κB核易位可能是最重要的一个机制EA抑制NF -κB激活。
我的功能κBα受我吗κ在NF - B激酶(IKKs)κB信号通路,NF -κB激活取决于IKK磷酸化过程(38]。两个IKKα和IKKβ使磷酸化我κBα在Ser 32和Ser 36,尽管IKKα效率较低,因此不能补IKK吗β淘汰赛细胞(18,38]。在这项研究中,我们观察到IKK的表达α和IKKβ焦脑I / R后显著增加,这表明IKK的大规模表达吗α和IKKβ可以要求NF -κB激活。然而,EA治疗显著降低IKK的表达α和IKKβ,特别是对于IKKβ。EA组的结果明显不同于NBD肽效应完全集中于减少IKK的表情β而不是IKKα。NBD肽组的结果符合NBD肽的特性。因此,我们演示了EA在IKK的效果α和IKKβ第一次焦脑I / R的老鼠。
此外,EA之间的不同的效果和机制治疗和NBD IKK肽α和IKKβ也提示。
此外,这一过程的关键步骤是核易位;绑定p65 / p50二聚体κB在DNA序列是另一个重要的步骤在NF -的激活κB信号通路(39]。我们发现的DNA结合能力NF -κB是局灶性脑缺血/再灌注后增加,显著降低了EA NBD肽治疗干预。这表明EA治疗和NBD肽抑制NF -κB信号通路通过抑制NF -的能力κB结合DNA。
总之,EA有效抑制NF -的激活κB信号通路可能通过降低IKK的表达α和IKKβ,这是局灶性脑缺血/再灌注后高度表达。IKK的功能α和IKKβ在NF -κB通路可能抑制,可能我变弱κBα磷酸化,从而增加了我κBα表达式在NF -κB /我κBα反馈回路在细胞核中,这可能会阻止核易位NF -κb .此外,EA NF - DNA结合能力降低κ激活的NF - B,从而有效减少κB通路。与NBD肽相比,EA治疗介导减少IKK的表达α。它可以推测,这些观察结果的差异反映了不同的机制的EA治疗和NBD肽。不幸的是,我们只能集中在规范的途径。此外,由于IKK的效果α是通过磷酸化的Rel A和抗炎作用:在网站加速他们的核营业额40),IKK EA的效果和机理α在经典之中通路和磷酸化IKKs将在将来的研究中调查的过程。EA的影响在其他信号通路在炎症也被认为是我们的下一个研究目标。
简而言之,我们推断的抑制NF -κB信号通路激活参与的机制EA治疗改善炎症损伤发生在局灶性脑缺血/再灌注的早期阶段。
6。结论
总之,EA的机制抑制NF -激活κB信号通路,减少炎性损伤涉及多个目标和链接。EA治疗可以减少IKK的表达α和IKKβ并可能抑制调节的功能激活的NF -κB的炎症信号通路和改善局灶性脑缺血/再灌注的早期阶段。
缩写
| EA: | 电针刺激 |
| NF -κB: | 核因子-κappaB |
| NBD肽: | 尼莫绑定域肽 |
| 我/ R: | 缺血/再灌注 |
| SD: | Sprague-Dawley |
| PFA: | 多聚甲醛 |
| PBS: | 磷酸缓冲盐 |
| PVDF: | 聚偏二氟乙烯 |
| EMSA: | 电泳迁移率改变分析 |
| RHD: | Rel-homology域 |
| 新经济学院: | 核出口序列。 |
确认
这项研究是国家自然科学基金支持的科学研究(没有。30470606)和程序的中医研究重庆市卫生局(没有。2012-2-128)。