文摘
作为主要另类疗法在中国传统医学,它已经表明,艾灸可以生成一系列分子事件在血液、脾、和大脑,等等。然而,艾灸部位仍不清楚会发生什么。要回答这个问题,我们进行了微阵列分析与皮肤组织从艾灸网站还Zusanli穴位(ST36) 15分钟的艾灸刺激管理。结果表现出145个调节和72个表达下调基因反应立即在生理条件下,和255年在病理条件下调节和243个表达下调的基因。有趣的是,大多数的途径和生物过程(度)在病理条件下的差异表达基因参与免疫力,而那些在生理条件下参与新陈代谢。
1。介绍
在针灸研究中,微阵列分析已被广泛用来揭示基因表达谱在不同组织或器官(1- - - - - -19]。基于这些基因表达谱,研究人员能够有可能发现更多的潜在的有趣的目标基因进行进一步实验来解释针刺引起的分子事件。艾灸,针灸临床实践的主要治疗方法之一,已经证明它可以用于缓解疼痛(20.,21),生成一系列分子事件在血液22,23)、脾(24,25),结肠粘膜(26),大脑27),等等,利用艾锥或坚持刺激穴位或某些地区(也叫艾灸的网站)。然而,没有一个基因表达谱的艾灸网站迄今为止报道。因此,我们建议艾灸,在相当大的程度上,产生大量的差异表达基因(度)艾灸的网站,我们也期待找出潜在的分子靶点说明艾灸刺激现场工作。
2。材料和方法
2.1。动物
成年男性Sprague-Dawley老鼠体重200 - 220克来自成都中医药大学实验动物中心,在这项研究中被运用。维护动物的房间自动控制天周期(12:12 =光暗循环):在24±2°C,所有老鼠被允许自由地把食物和水随意并随机分配到各实验(为每个组)。实验过程进行了按照美国国立卫生研究院(NIH)指导实验室动物保健和使用的,和所有实验协议动物伦理委员会批准成都中医药大学。
2.2。实验设计
在这项研究中,我们旨在探索将艾灸部位在视图中潜在的分子生理和病理条件下的目标。因此,我们设计了两个微阵列实验的不同部分。一个是专为发现的基因表达谱在生理条件由2组:健康对照组(C)和健康的控制与艾灸刺激组(CM)。另一个是为揭示设计的基因表达谱在病理条件组成的模型对照组(M)和模型控制与艾灸刺激组(MM)。
2.3。干预
2.3.1。生理条件下
在生理条件下,大鼠在CM组在左侧穴位艾灸Zusanli (ST36),在大萧条膝盖以下从胫骨前嵴(28为15分钟)。艾灸刺激与照明操纵艾棒(长度:12厘米,直径:0.6厘米,院长南洋韩艾灸科技发展有限公司有限公司,中国)15分钟(图1)。皮肤烧伤,艾棒的尖端从皮肤保持2 - 3厘米。
2.3.2。病理条件下
首先,病理条件建立了注入皮下注射0.1毫升弗氏完全佐剂(美国σFCA)后左爪的足底表面的老鼠29日]。CFA立即注射导致炎症,爪肿胀和疼痛,变得明显在12小时内,持续至少2周后注射。在这个实验中,大鼠在MM组接受相同的艾灸过程如上所述注射后1周。
2.4。RNA提取
两个小时完成了一次艾灸刺激之后,老鼠被公司实施安乐死2吸入。皮肤组织(0.5厘米×0.5厘米×0.2厘米)位于艾灸的网站都被立即删除并保存在RNAlater(美国Ambion)防止RNA降解。总RNA提取使用试剂盒纯化试剂(美国表达载体)和RNA清理工具(锰、德国)制造商的指示后,分别。总RNA被分光光度法测定的数量,和完整性评估了甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。
2.5。微阵列分析
微阵列分析CapitalBio公司提供的服务(中国,北京)进行描述(30.,31日]。简而言之,从样本中提取总RNA是用于生产使用体外转录技术互补的RNA。互补脱氧核糖核酸是由逆转录和作为模板合成fluorescein-labeled cDNA大片段聚合酶。通用鼠参考RNA从Stratagene购买也贴上共同参考控制。RNA样本和常见的引用被Cy5或Cy3荧光标记,分别,然后被杂化配对27 k老鼠基因组数组(CapitalBio,中国)。数组是由26962年寡核苷酸探针覆盖27044成绩单代表约22012个基因。所有数组都是由LuxScan 10 ka双通道扫描共焦激光扫描仪(CapitalBio,中国)。获得的图像进行了分析与LuxScan3.0图像分析软件(CapitalBio,中国),雇佣了洛斯标准化算法。
2.6。数据分析
2.6.1。差异表达基因的选择
检测到的信号强度的探测芯片≥400人包括进行比较分析。我们应用两种未配对算法重要的微阵列分析软件(山姆,斯坦福)来识别CM和C组之间的显著差异表达的基因,和MM和M组。度确定阈值的错误发现率,罗斯福和褶皱变化≥2.0或0.5≤≤5%。
2.6.2。度的途径和生物过程分析
我们使用在线分子注释系统(MAS)建立了CapitalBio公司(http://bioinfo.capitalbio.com/mas3/),结合KEGG和基因本体论(去)数据库执行通路和生物过程浓缩分析和计算描述的统计学意义(32]。值< 0.001被认为是具有统计学意义。
2.7。实时PCR证实
验证表达式模式从微阵列数据,我们使用定量实时聚合酶链反应(qPCR)检测四度的表达,Hspa1a, Mcpt8, Slpi, Clqa,随机选择从27 k老鼠基因组数组。表1显示这些基因的引物设计和管家Gapdh基因。互补脱氧核糖核酸制备使用第一个从DNase-treated总RNA链上标二世工具包(美国表达载体)。qPCR进行DNA主人SYBR绿色我工具包(罗氏公司、德国)和LightCycler机(罗氏公司、德国)后,制造商的协议。
3所示。结果
3.1。度在艾灸
不同数量的度在艾灸站点获得从不同的条件。在生理条件下,我们得到145调节和72年下调度(见补充表1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2013/890579)。在病理条件下,结果显示255年调节和243度使之抑制(补充表2)。
3.2。丰富通路在艾灸
图2向我们展示了统计上显著的路径(在艾灸地点值< 0.001)。在生理条件下(图2(一个)),发现10途径丰富基于所有度在艾灸的网站。另一方面,21丰富通路显著病理条件下(图2 (b))。
(一)生理条件
(b)病理条件
3.3。丰富生物过程在艾灸的网站
从图3,我们会发现生物过程有显著的统计差异(在艾灸地点值< 0.001)。在生理条件下(图3(一个)),这是发现9生物过程。在病理条件下(图3 (b)),29日生物过程。
(一)生理条件
(b)病理条件
3.4。4选择基因的验证
来验证芯片结果,我们选择了4个基因,Hspa1a, Mcpt8, Slpi,和Clqa qPCR。结果表明,证实了基因的表达水平在微阵列在qPCR(图类似4)。
4所示。讨论
在这里,我们首先报道基因表达谱在艾灸的网站。结果表明艾灸的网站也会生成一个设置度除了其他任何组织(16]。换句话说,在生理条件下或在病理条件下,我们可以找到大量的度对艾灸刺激在艾灸的网站。基于这些度在不同的条件下,我们进一步寻找22 coexpressed基因相似的表达式(补充表3)的倾向。在某种程度上,这些基因(16 upnegulated和6个表达下调基因)应该是最有可能被视为潜在的目标继续研究,以确定哪些基因是重要或关键的角色在艾灸灸网站。
在这项研究中,大多数(8/10)的参与途径在艾灸网站相关代谢生理条件下(图2(一个))。然而,重要的途径引起的病理条件下FCA最相关的免疫(图2 (b)),如抗原处理的途径和演示和自然杀伤细胞介导的细胞毒性。建议不同的途径在艾灸部位将参与在不同条件即使相同的艾灸刺激。
根据生物过程的分析,我们还可以了解来自不同国家的差异。没有FCA病理刺激,生物过程在艾灸灸后政府网站最由氧化还原、钾离子运输,等等。然而,各种各样的生物过程与免疫有关,如免疫反应,抗原处理和表示,并通过MHC抗原处理和表示肽抗原类我,表现出在这个研究。
综上所述,它似乎认为一系列分子事件会发生在艾灸的网站。此外,不同的路径和生物过程在艾灸会参与不同的条件。然而,这个结论应该认真理所当然给予以下限制。首先,只有一个刺激的时间点是在这项研究中使用。如何课程或不同时间点,如5、10、15、20日和30分钟,经常练习在艾灸诊所,在未来研究中需要回答的问题?其次,FCA注入引起的病理条件。据我们所知,FCA注入将生成通过一系列的免疫佐剂关节炎行动(33,34]。此外,以往的研究也表明,艾灸会有用得到更好的改善佐剂关节炎(32,35,36]。因此,我们不能确定度在艾灸在病理条件下将发挥重要作用的艾灸治疗佐剂关节炎。在这个角度看,当前数据只能用于解释这种情况下发生了什么事在艾灸。其他病理条件怎么样?有必要进行更多的研究来找出不同或相似不同病理条件下。
此外,在这项研究中使用的组织RNA提取和微阵列检测来自艾灸部位的皮肤。到目前为止,皮肤也被视为一个重要的免疫器官(37,38)以及neuro-immuno-cutaneous系统的一个组成部分(nic) [39- - - - - -42]。针对这方面,我们能够保证分子事件在艾灸在这个实验中有可能被应用于解释最初的艾灸激活神经免疫调节机制在先前的研究已经证明(43,44]。艾灸除了这将是另一个潜在的机制,目前认为是温度和non-temperature-related工作机制(45]。
5。结论
结果表明,一系列分子事件会发生在艾灸的网站。在这些分子事件,不同的基因和不同的通路和生物过程在艾灸站点在不同条件下会介入。
利益冲突
所有的作者清单,没有利益冲突。
作者的贡献
海岩阴和勇唐贡献同样这项工作。
确认
这项工作是由中国国家基础研究计划(973计划,没有。2009 cb522903),中国国家自然科学基金(81173320号,81102667),四川省教育局(没有。12 za037),科学研究基金会中国四川省返回中国学者。