文摘

我们探讨电针刺激的最佳时间(EA)刺激对缺血性损伤保护大脑。实验进行了大鼠暴露于右大脑中动脉闭塞(MCAO) 60分钟基本以24小时为再灌注紧随其后。EA是交付给“Shuigou”杜(26)和“Baihui”(Du 20)穴位sparse-dense波(5/20 Hz)为1.0 5 mA, 15日,30日和45分钟。结果表明,30分钟EA,从5分钟后MCAO MCAO期间(EA)或5分钟后再灌注MCAO后(EA),显著降低缺血性梗塞体积,减弱神经赤字,和降低死亡率的减少更大的缺血性梗塞前组。MCAO期间也在EA的集团,这个防护效益呈正比例增长的刺激,也就是说,增加保护以应对EA从5 - 30分钟的刺激。在所有组,EA诱导显著增加脑血流量和促进血流恢复后再灌注,血流量和血液细胞速度回到preischemia水平在很短的时间内。令人惊讶的是,EA 45分钟没有显示神经赤字或减少梗塞体积,而是证明这组死亡率的增加。虽然EA在MCAO 45分钟还增加了血液流动,这导致恶化的灌注后只对缺血再灌注组相比受到。诱导的神经保护的“最优”期(30分钟)EA被Naltrindole完全封锁,aδ阿片受体(金龟子)拮抗剂(10毫克/公斤,注射)。这些发现表明,早期的EA刺激会导致更好的结果,这对缺血EA-induced神经保护取决于一个最佳EA-duration通过多种途径包括金龟子信号,而“超长”刺激加剧了缺血性损伤。

1。介绍

缺血/缺氧脑损伤,如中风,导致严重和复杂的病理生理变化影响大脑的多个层面,和体育全球死亡率非常高,因为神经系统残疾的主要原因(1- - - - - -9]。尽管大量的研究在过去几十年中,有限的治疗选项可用抗缺血/缺氧脑损伤至今为止。庞大的身体、情感和金融通行费中风造成对患者和他们的家庭带来一个令人生畏的医学界和连续挑战[5- - - - - -9]。先前的研究在我们的实验室和他人的表明,电针刺激(EA)在适当的穴位与合适的刺激参数,显著减弱神经赤字,梗死体积和死亡率在缺血性动物模型的侮辱(10- - - - - -17],它可能揭示发展中一个新的更好的形态对缺血性脑损伤。实际上,有大量临床证据证明有益针灸对中风患者的影响(18- - - - - -21]。

因为控制不足,可怜的方法学质量和小样本见过在以前的研究中,针灸在缺氧/缺血性损伤的疗效仍未经证实的在临床的设置。事实上,主要的争议存在关于针灸的有效性在中风患者22- - - - - -24]。至少在一定程度上,这些可能是由于不同采用不同的研究方法,由于针灸诱发复杂变化在中枢神经系统的多个层面,结果还与不同acupunctural不同方法(25- - - - - -30.]。因此,它是非常重要的定义最优参数所需的针灸治疗缺血/缺氧脑损伤。

朝着这一目标,我们的系列研究建立了EA治疗急性中风的实验动物是非常依赖于特定穴位刺激电流的强度和频率(11- - - - - -15,17]。因为治疗的时机和持续时间对急性中风患者(产生巨大影响7- - - - - -9),我们进行这个工作要解决两个基本问题,即,(1)当EA应该应用诱导最佳保护,缺血期间或之后?,(2)EA应用最佳诱导时间最大的有益影响缺血性脑?

2。材料和方法

2.1。动物

成年男性Sprague-Dawley老鼠(240 - 270 g)被用于实验。所有的动物都购买实验动物中心的批准上海中国科学院。动物们被安置在一个环境温度°C,并提供免费的食物和水。所有手术都是动物保健和使用委员会批准的复旦大学上海医学院,上海,中国,进行麻醉(氯酸盐水合物,400毫克/公斤,i.p)。

2.2。脑血流量监控

脑血流量是用激光多普勒测量灌注监控(LDPM, PeriFlux5000, Perimed,瑞典)。这个过程的主要步骤如下:首先,一个小洞钻在右顶骨点前囱1.5毫米后,5毫米侧矢状缝,如前所述[14,17,31日]。脑软脑膜的肤浅micro-vessels访问使用激光多普勒探针(0.45毫米直径)插入到孔的深度2毫米和固定的头骨骨。探测器是用来测量血液灌注到皮层记录脑血流量。连续监测脑血流量进行开始5分钟前诱导脑缺血再灌注后到至少15分钟。按照制造商的指导方针,灌注值的测量变化依赖于血细胞的数量现在和他们的速度在该地区被调查的技巧。脑血流量的变化的局部区域,记录灌注的动态变化的测量单位(PU),移动血细胞浓度(在CMBC)和血液细胞的速度(速度),经常使用LDPM实时监控。聚氨酯是一种脑血流量,并表示为指数产品移动血细胞的数量和它们的相对速度。

2.3。诱导脑缺血的方法

我们跟着巴隆等描述的方法。32在我们之前的出版物中也详细14,17)创建一个局部脑缺血模型的大脑中动脉阻塞(MCAO)。动物被麻醉手术暴露他们的右颈总动脉,颈外动脉和颈内动脉。结扎后右颈外动脉的远端,雕刻和4:0单丝尼龙缝线(30毫米长度,直径0.18毫米,0.24毫米直径圆,MONOSOF, sn - 1699 g,美国)介绍了向右颈外动脉和进一步向右颈内动脉~ 20毫米到右侧大脑中动脉的起源。右侧大脑中动脉的血液流动然后锢囚在这个级别。

我们不断地监控所有的动物的血液流动,确保一个统一的脑缺血水平保持在所有组织以一种标准方式。血液流动控制通过调整缝合动脉缺血的感应。缺血性老鼠显示稳定的~ 85%下降到基线水平相比,聚氨酯(MCAO之前),也就是说,达到一定程度的~ 15%的基线PU,被用于进一步的实验。聚氨酯是控制在一个较低水平,与小波动整个缺血期间没有任何重大改变,除了在EA的应用程序。阻塞后,再灌注缺血区域的被允许通过撤回从右颈外动脉缝合。皮质血流量变化监控所有的动物开始5分钟前诱导脑缺血再灌注后到至少15分钟。这个时间是包括整个MCAO的长度和EA。

体温维持在36.5°C±0.5°C到整个手术的动物从麻醉中恢复过来。再灌注后,动物被安置在24小时24±1°C的环境温度。同样的手术进行动物sham-operation组,MCAO除外。

2.4。电针刺激方法

世界卫生组织的标准进行穴位的名称和定位33,34]。“Shuigou (Du 26)”和“Baihui (Du 20)”穴位位于头和脸。杜Shuigou(26)位于中线的一个点从嘴到鼻子上唇的2/3。杜Baihui(20)位于头部的中线上的一点,大约位于连接两个耳廓的顶端。

EA的优化效应,诱发最大保护脑缺血,我们应用EA Shuigou杜(26)和“Baihui”(Du 20) 5/20 Hz sparse-dense频率以恒定强度的~ 1.0 mA EA组,开始5分钟后MCAO或MCAO后5分钟。穴位和刺激参数的选择是基于我们的系列研究的结果在过去(14,17]。

在测定不同EA时期对脑缺血的影响,使用不同lasting-durations EA应用,也就是说,在5分钟后开始MCAO和持续5分钟,15分钟,30分钟,分别为45分钟。五个不同的组进行了研究在当下研究每组人数从16到45:MCAO只(缺血,为5分钟),MCAO + EA (EA-5最小值,15分钟),MCAO + EA (EA-15最小值,30分钟),MCAO + EA (EA-30最小值,为45分钟),MCAO + EA (EA-45最小值,)。

EA是通过不锈钢丝状针(15毫米长度和直径0.3毫米,苏州医疗器械限制有限公司,中国)由一个EA装置(模型g - 6805 ii,上海医疗器械高新技术有限公司,中国)。针插入在杜26日1毫米深,垂直的平面上的皮肤。在杜20,针插入斜和2毫米的深度14,17,25,33,34]。输出的强度和频率波后边境的负向的脉冲(脉冲宽度= 0.5±0.1女士,女士组件的直流电= 0)监测在一个通用示波器(模型XJ4210A,上海新建仪器设备有限公司,中国)。

2.5。δ阿片受体封锁

老鼠被随机分配到四个实验组,每组:(1)仅缺血();(2)缺血+ EA Shuigou杜(26)和“Baihui”(DU 20) ();(3)缺血+ Naltrindole (),老鼠服用Naltrindole(10毫克/公斤增长值)5分钟前MCAO的发作;和(4)缺血+ EA + Naltrindole (),动物被EA和Naltrindole治疗。EA开始5分钟后缺血和缺血后继续35分钟这组实验。

2.6。死亡率和神经赤字监控

一些脑缺血大鼠再灌注后2至20小时死亡。这个时期的死亡率报告基于数量的死老鼠和老鼠的总数给定组分配。无数的因素可能有牵连的死因,例如出血。然而,调查的确切死因不是我们的目标在这工作。

评估神经赤字是在所有组的动物。大鼠MCAO后24小时内死亡被排除在外。评估了24小时后再灌注前抽样的脑组织。评估神经赤字被蒙蔽,也就是说,评价和评分的人神经赤字根据预设的标准没有先验知识在组织和治疗。神经赤字的程度从鹿成绩评分(14,17]。标准设定如下:年级0 -“正常”,对称的运动没有任何异常迹象;年级1-incomplete的左前翼举起尾巴时;年级2-doddery爬连同1级的迹象;年级3-kept左前肢体接近乳房举起尾巴时;年级4-left当爬行;年级5-left前爪向后推连同4级的迹象;年级6-repeated旋转运动与一个不能移动的后左肢;与品位7-left卧位,因为身体支持无能。

2.7。脑梗塞的测量

评估神经赤字后,动物们牺牲了麻醉和大脑的样本。大脑切片准备2.0毫米的部分(12日至16日)和被孵化解决氯化三苯基四氮唑(TTC), 20 g / L) 30分钟前在37°C被转移到多聚甲醛溶液(40 g / L)修复梗塞的面积。梗塞区域出现白色或淡而“正常”组织出现红色(35,36]。照片拍摄的大脑切片和数码相机的体积梗塞ACT-2U使用计算机辅助图像分析系统软件(尼康)。相对梗塞比计算使用以下方程(14,17,31日]:(2左半球区域(non-ischemic)−non-infarct全脑片)/ (2左半球区域)100%。这个方程不包括的因素可能导致的不准确计算梗死体积(如水肿)。

2.8。数据分析

聚氨酯的脑血流量进行了计算,在CMBC和速度测量。所有单个测量基线值相比,在MCAO(控制水平),在每一个动物。不同群体之间的组合值进行比较。平均品位神经赤字每组被用于制造对比组。脑梗死体积分数表示为百分之一的整个大脑体积。

所有数据提出了平均数±标准差和进行统计分析。死亡的比率比较采用卡方检验。所有其他数据进行方差分析(方差分析),t以及,Rank-Sum测试,和/或卡方检验。这些变化被认为是重要的如果值小于0.05。

3所示。结果

3.1。不同的影响引起的EA MCAO的发病与Post-MCAO后开始

在缺血组(),1小时MCAO 24小时再灌注,约18%(8/45)的大鼠再灌注的发病后2 - 20小时内死亡。在再灌注24小时,活着的老鼠显示严重神经赤字(年级,)。TTC染色显示,脑梗塞的体积大约是三分之一的整个大脑(,)(表1,图1(一))。梗塞区域主要是局部frontoparietal叶皮层和纹状体的右脑(缺血性,图1(一))。

EA开始5分钟后MCAO诱导显著保护脑缺血,导致梗塞体积的显著减少,神经赤字,和死亡率(表1,数据1 (b)- - - - - -1 (d))。EA开始5分钟后,在脑缺血大鼠MCAO诱发类似的结果(见图6)。然而,似乎EA诱发更大的减少梗死体积比后来在前组。EA MCAO后梗塞体积减少了~ 85%(表1和图1),而EA MCAO后,由~ 45%(参考图6)。这些结果表明,艺电刺激诱发的早期机构更好的保护对脑缺血性损伤。

3.2。EA保护与时间的增加刺激增加从5到30分钟

在MCAO + EA组为5分钟(EA-5最小值,),除了2老鼠死于发病后5和15个小时再灌注(11%,2/18,对缺血),活脑缺血大鼠的平均神经赤字程度略(等级提高,,对缺血)。梗死体积略减少(,,与缺血)(表1和图1 (b))。在MCAO + EA组15分钟(EA-15最小值,),只有一个老鼠死在~ 3小时后出现再灌注(6%,1/16,与缺血),更大的改善神经赤字(年级平均水平,,对缺血)连同显著减少梗塞体积(,,与缺血)(表1和图1 (c))。MCAO + EA组的30分钟(EA-30最小值,),神经赤字大大减毒(年级,,与缺血)和死亡率的显著下降(7%,2/30,对缺血)。梗死体积减少85% (,,与缺血)(表1和图1 (d))。相比5分钟和EA组15分钟,EA为30分钟诱导更有利的影响在各个方面包括神经赤字,缺血性梗塞和死亡率(表1,数据1 (b)- - - - - -1 (d))。这些结果表明,EA保护依赖于一个适当的EA持续时间。

3.3。恶化的缺血性损伤EA的“超长”刺激

我们调查是否EA保护将进一步加强EA刺激持续时间更长。因此,我们几个老鼠分配给一个新组与MCAO + EA 45分钟(EA-45最小值,)。令我们吃惊的是,EA 45分钟显著增加这群脑缺血大鼠的死亡率。超过一半的动物在这一组(60%,18/30)在0.5到10小时内死亡后再灌注。所有的死老鼠表现出症状,如抽搐、翻滚,立毛,汗水(湿羽毛)和其他异常。缺血组相比,死亡率增加了3折(60%,18的30这组和缺血)。尽管剩下的12大鼠生存再灌注后24小时,他们患有严重神经赤字(7级),甚至比只有缺血(年级组5 ~ 7范围,)。的梗塞体积,EA 45分钟不会降低梗死体积(,,对缺血)。(表1,图1 (e))。这些结果表明,EA刺激的持续时间增加应用程序进一步加剧了缺血性侮辱,而不是授予任何保护。

3.4。在MCAO EA-Induced增加脑血流量

使用激光多普勒灌注监视器,我们不断监控实时脑血流量的变化在所有团体开始前5分钟MCAO直到15分钟后再灌注(缝合撤军),并比较不同的脑血流量在pre-MCAO层面,在MCAO /没有EA和不同群体之间的早期再灌注(数字2,3,4,5)。

符合我们之前的研究(14,17插入后,尼龙缝合到右大脑中动脉,血液灌注(PU)监控皮层立即下降了~ 85%(即。,达到的水平~ 15% pre-MCAO级别)。MCAO的整个期间,局部血流量保持与未成年人在这样的低水平波动。在CMBC下降了~ 80%的基值(即。,reaching a level at ~20% of the pre-MCAO level) with a slight deceleration of blood cell velocity (reduced by ~25% of the pre-MCAO level). These changes indicated that MCAO induced a greater reduction in the blood volume as compared to the velocity of blood cells (Figures2(一个)和3- - - - - -5)。

在所有EA组,EA诱导瞬间和显著增加缺血性脑的血流量。血流改变与当前脉冲同步在EA刺激(数字2 (b)- - - - - -2 (e)和3- - - - - -5)。EA诱导增加聚氨酯~ 30%的控制(没有EA)和宏观(图3),在CMBC超过65%的控制(而没有EA MCAO)(图4),同时减少血细胞~ 55%的速度控制(而没有EA MCAO)(图5)。这些结果表明,“合适的”和“结束”时间的EA在MCAO刺激增加血流量。

3.5。微分复苏再灌注后的脑血流量在EA组

缺血组(撤军后),尼龙1 h MCAO后缝合,PU逐渐增加到~ 25%的控制水平(pre-MCAO) (与在MCAO)和在CMBC增加到~ 50%的控制(对在MCAO)与血细胞被减少的速度~ 75% ~ 55% (,而在MCAO)在血液再灌注后的第一个15分钟(数字2(一个)和3- - - - - -5)。

EA血液再灌注的模式改变了。然而,不同EA组之间存在显著差异,这是明显的再灌注的早期阶段,例如,在第一次MCAO后15分钟。在EA-5 min组(),EA-15 min (),EA-30 min ()、血液灌流(PU)增加到超过90%的基值(preischemia)(图3,与缺血组再灌注下),在CMBC恢复(图preischemia > 80%的水平4,与缺血组再灌注)和速度增加到> 80%的控制水平(图5,与缺血组再灌注)再灌注后15分钟内。

与此形成鲜明对比的是,EA-45 min组()展示了一个完全不同的模式。例如,PU保持在一个相似的水平,在MCAO(~ 15%),也就是说,再灌注后,甚至低于水平仅缺血(~ 25%,而在组缺血再灌注+ EA(图45分钟)3)。同样,在CMBC仍然保持在一个较低水平,再灌注后(~ 20%),甚至低于水平(50%)的缺血组再灌注期间(,图4)。这些发现表明,EA 30分钟或更少在MCAO增加血流量,促进血流再灌注期间的复苏,而“超长”(45分钟)刺激,尽管在MCAO增加血液流动,阻碍血液流向大脑的复苏MCAO后(数字2 (e)和3- - - - - -5)。

3.6。金龟子拮抗剂减毒EA-Induced保护缺血性梗塞

我们之前发现金龟子拮抗剂的显微镜下注射侧脑室主要减毒EA保护脑缺血性损伤(10]。为了进一步重申这一观点,我们应用Naltrindole缺血性老鼠和决定对EA-induced神经保护的影响。结果表明,缺血组()梗塞大小减少~ 40%(从来,)与EA MCAO后立即开始治疗后()。尽管Naltrindole(10毫克/公斤,注射。)应用程序增加了梗塞体积,变化无统计学意义(,,仅与缺血)。然而,它完全废除了EA-induced预防缺血性梗塞(,,与缺血+ EA)(图6)。这些结果表明,阿片受体发挥着非常重要的作用在EA-induced预防缺血性损伤。

4所示。讨论

这个研究首次系统地定义最佳EA刺激诱导时间对缺血性梗塞有利影响,神经赤字和死亡率。我们的结果表明,EA给5 - 30分钟可以显著减少缺血性梗塞体积,减少神经赤字和死亡率。另一方面,EA给45分钟不显示神经赤字减少或梗塞体积,而证明这组死亡率的增加。然而,所有组显示血流的增加在EA刺激MCAO期间。这些发现符合我们的初步观察37),表明EA保护缺血性损伤依赖于EA刺激的长度,和一个“超长”刺激可能增加缺血性损伤,而不是保护大脑免受伤害。

这个观察是超出了我们的预期。由于缺血性脑损伤的主要原因是大脑血液供应不足,增加血液流向大脑应该减少脑缺血性损伤。我们先前的研究得出的结论是,EA在MCAO 30分钟增加血流量,降低缺血性侮辱到大脑(11,12,14,17]。在扩展,我们推测,一段EA刺激会产生更好的结果。很显然,这并非如此,我们观察到相反的结果;长期刺激EA强化,而不是防止脑损伤在脑缺血性损伤。有趣的是,王博士等。38]也观察到类似的现象在学业EA-induced痛觉减退在健康志愿者。受试者被随机分配接受不同的持续时间(0分钟,20分钟、30分钟或40分钟)异步EA的刺激,然后被痛觉减退的考验人类实验冷热痛阈模型使用。他们发现,30分钟的异步EA刺激导致最重要hypoalgesic效应与0相比,20或40分钟刺激。因此,30分钟内似乎是最优的持续时间对缺血性损伤EA-induced镇痛和脑保护。

目前,这种现象背后的机制尚不清楚。在这工作,然而,值得注意的是,EA 5 - 30分钟,显著改善MCAO后再灌注,有利于快速恢复的血液流向pre-ischemic水平,在MCAO除了增加血流量。与此形成鲜明对比的是,EA 45分钟不促进MCAO后恢复血流,但相反,进一步恶化这见我们目前的工作。这种现象部分占结果之间的差异“最佳时期”和“超长”EA治疗虽然底层机制仍然未知。

这一事实的“超长”EA刺激MCAO下的血流量增加,但不会导致任何预防缺血性损伤强烈表明,最优艺电刺激诱发大脑通过一个复杂的多层次的监管机制。单因素,比如,增加血液流动在缺血条件下,可能不足以诱导保护缺血。适当的刺激是极其重要的最大动员各种生存信号和保护途径的激活大脑缺血。

这些途径可能涉及DOR-mediated生存信号之一。我们之前已经证明金龟子是重要的诱导神经保护3,6]。金龟子激活减弱缺氧、缺血性或兴奋性损伤的神经元和大脑1,3,6]。证据表明,手动针灸和EA增强内源性阿片系统的活动,包括金龟子,大脑中26- - - - - -29日,39]。因此,DOR-mediated保护可能扮演非常重要的角色在EA-induced预防缺血性损伤。的确,我们首先报道,显微镜下注射金龟子拮抗剂,Naltrindole,进入脑室减毒EA-induced脑保护缺血性梗塞,暗示金龟子参与EA-induced保护脑缺血(10]。此外,我们和其他人的研究表明,EA的密度显著增加缺血皮层的金龟子,金龟子信号可能调解EA对缺血性损伤诱导神经保护15,39,40]。在目前的研究中,我们观察到静脉注射Naltrindole几乎完全封锁了EA-induced对缺血性脑损伤神经保护。所有这些观察一贯偏向金龟子的关键作用EA-induced对脑缺血神经保护。另一方面,EA可以激活其他神经递质系统,如在大脑中神经营养因子,使进一步的保护在缺血条件下(13]。

因此,EA目标多种机制来实现对缺血性损害的保护作用,包括增加在缺血脑血流量,改善血流再灌注后的复苏,upregulation金龟子的通路,和其他生存信号。最优时间EA刺激可以结合所有这些保护途径和直接对缺血性压力,而EA的过度亢奋,尽管在MCAO增加血流量,可以设置这种平衡的综合保护。

此外,我们目前的结果表明,应用在MCAO诱发更强的保护比EA MCAO后,表明EA的早期机构必须取得更好的神经保护治疗对缺血性损伤。这类似于tPA治疗的目标的治疗窗的重要性(7,8]。保护权力可能会阻止神经元的早期动员启动细胞凋亡/坏死的过程在大脑中。“时间是大脑”,这也是如此的EA治疗缺血性脑损伤。

总之,我们的结果表明早期EA治疗最佳刺激参数适当的时期达到治疗效果至关重要对缺血性神经保护的侮辱。前面的争议在文学EA治疗中风可以部分归因于病人的治疗条件的差异和EA参数。进一步深入调查“最优”EA参数和其潜在机制可以帮助改善临床结果缺血/缺氧损伤患者的大脑。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金委(30672721,30873318),NBRP (2009 cb522901;2012 cb518502), STCSM (10 dz1975800), NIH(- 004422和hd - 034852)和维维安·l·史密斯神经基础。