文摘

背景。Cinobufagin已广泛应用于治疗癌和扮演重要的角色在癌症疼痛的缓解。但是相关机制尚不明了。目的。探讨热的变化和机械痛觉过敏在老鼠和爪子癌症疼痛cinobufagin用爪子癌症疼痛的作用机理模型。方法。60雌性小鼠随机分为5组:对照组,模型组,cinobufagin集团cinobufagin + NAL-M集团和吗啡组;除了的对照组小鼠接种H22肝癌细胞正确的后爪。从接种后第九天,老鼠管理药物每天一次持续8天。痛苦的行为是决定第二,第四,第六,八天之前和之后的管理。最后一天,他们牺牲了。的水平β端,CRF, il - 1β通过ELISA分析;进行免疫组织化学检测的表达式β端、POMC和μ或者在肿瘤和邻近组织。结果。热痛和机械痛阈值被cinobufagin显著增加。此外,的表情β端,CRF、POMC和μ或者被cinobufagin显著调节。的镇痛效应cinobufagin被周边阿片受体拮抗剂NAL-M。结论。Cinobufagin显著缓解癌症疼痛在小鼠和提高痛阈,主要的表达水平上调β端和μ或者后爪肿瘤及邻近组织。

1。介绍

癌症疼痛是恶性肿瘤最常见的症状之一。据统计,约有60% -90%的晚期恶性肿瘤患者有不同程度的疼痛,和大约30%的患者有持续的剧烈疼痛1]。所提出的三步疗法,患者应给予非甾体类抗炎药物和(或)阿片类药物根据疼痛的程度。虽然这些疗法有适当的疗效,但也有一些副作用,如上瘾,宽容,免疫抑制,和胃肠道反应;另外有些则不是有效的,大约45%的癌症患者没有痛苦控制(2]。最近的调查结果表明,有一个相当大的疗效相关免疫镇痛机制在活的有机体内,免疫细胞合成和释放阿片肽(3- - - - - -5),其活动和表达呈正相关。这些肽,β内啡肽(β端)及其前体(proopiomelanocortin POMC)已确定(6]。当肿瘤或炎症发生时,免疫细胞从周围循环系统访问这些位置释放POMC,可由蛋白酶处理形成肽激素和因素,如β端,促肾上腺皮质激素(ACTH)和α黑素细胞刺激激素(α-MSH) [7]。β端,由免疫细胞合成和释放到外部环境刺激后interleukin-1 (il - 1)、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF),和其他因素,结合外围的阿片受体局部感觉神经终端关心镇痛。

Cinobufagin是主要活性成分提取的完整皮肤以以卵泡中的康托尔。它行动清除热量和毒素,减少肿胀,缓解疼痛。最近的研究报告(8- - - - - -12]cinobufagin已经广泛用于治疗癌和发挥了重要作用在癌症疼痛的缓解,尤其是在缓解疼痛引起的肝癌,胃癌,骨癌小有毒副作用。它可以用于长期使用或结合其他止痛药为了加强持续时间的影响。现在,cinobufagin癌症疼痛的潜在机制仍不清楚。这严重限制了cinobufagin的进一步开发和使用。纳洛酮methiodide (NAL-M)是一种选择性周边阿片受体拮抗剂。

我们先前的研究[13]发现cinobufagin增加老鼠爪子撤军延迟(PWL)机械痛觉过敏和热痛觉过敏。此外,我们的水平决定的β端邻近组织的H22肝癌模型,结果表明,水平β端是模型组相比显著增加,表明antinociceptive cinobufagin是由于拮抗效果的表达增加β端在外围组织。王等人。14)报道,cinobufagin的镇痛效应可以被周边阿片受体拮抗剂纳洛酮。因此,我们假设cinobufagin的镇痛效果的主要机制可以增强机体的免疫功能提高的程度β端,因此激活外围mu-opioid受体(μ口服补液盐)调节周围癌疼痛。

2。材料和方法

2.1。材料

Cinobufagin注入(批号:090623 - 1)是由安徽金禅秉持生化集团有限公司;盐酸吗啡注射(批号:091217 - 2)是由东北制药集团沈阳第一制药;纳洛酮methiodide (NAL-M)购买的σ(美国);肝素(批号:0808131)是由江苏:生化集团有限公司凭证标本保存在国家第三类实验室中药药理学,医学科学学院、中国三峡大学。

2.2。动物

雌性昆明小鼠最初权重每个购买来自湖北疾病控制中心的实验动物研究所(武汉)。实验动物的权利是保证在实验量子满意的广告。老鼠被安置在恒定的温度条件°C,湿度%,12 h光暗周期。他们是美联储随意和条件nonstressful之前至少1周的实验环境。实验按照指南的护理和使用实验动物,三峡大学,得到伦理委员会的批准。整个实验室程序的许可和监督下进行动物安全委员会制度。

2.3。装置

议员200电子天平(上海Yueping,中国),2390系列IITC·冯·弗雷电子疼痛测量仪(美国森林山),pl - 200 caloradiance刺器(中国成都Taimeng)和DM-R多功能显微镜测量系统(德国徕卡)。

2.4。方法

2.4.1。制备H22肝癌细胞

的H22肝癌细胞株在昆明小鼠连续培养三代,和腹水中提取后7天。示例是水洗的D-Hanks解决方案和离心两次在800 r / min×5分钟和台盼蓝染色检测是否存活率≥95%。细胞悬液被调整至6×107 /毫升,这是放置在冰前使用。

2.4.2。成立后爪癌症疼痛模型

模型组小鼠皮下注射0.1毫升6×107 H22肝癌细胞,和对照组的小鼠注射0.1毫升生理盐水(NS)。整个过程进行无菌,并在1小时内完成。

2.4.3。组织和管理

48 60雌性昆明小鼠,小鼠管理肿瘤细胞,随机分为4组:模型组、cinobufagin集团(cinobufagin, 2.5克/公斤/天,i.p), cinobufagin + NAL-M集团(cinobufagin, 2.5克/公斤/天,i.p, NAL-M i.p 20毫克/公斤/天),和吗啡组(吗啡,8毫克/公斤/天,i.p), 12个人一组;剩下的12个正常小鼠肿瘤细胞没有管理选择对照组。分别实验老鼠管理相应的药物;老鼠在控制和管理NS模型组,分别每天一次持续8天。每只小鼠的疼痛行为决定在2日,4日,6日,分别治疗前后和8天。最后一天的治疗小鼠的体重和疼痛行为测量,分别和标本取样进行测试。

cinobufagin剂量的人10 g / 60公斤,据Meeh-Rubner方程(15]:

在哪里是常数,,;体重公斤,我们算出米²,米²。所以cinobufagin的剂量对小鼠是10 g×0.007 m²÷1.6米²÷0.02公斤≈2.19克/公斤。我们选择了2.5克/公斤cinobufagin剂量对小鼠。

2.4.4。测量的热痛觉过敏

热痛觉过敏用辐射热疼痛测量仪测量在一个安静的环境(室温°C) (16]。老鼠被放置在一个树脂玻璃笼子里,和实验中心使用一束强烈的光照射皮肤时正确的后爪老鼠适应安静的环境,和老鼠所花费的时间收回他们的爪子被记录。辐射热强度是正常老鼠爪子撤军设置为5 - 15秒延迟(PWL)。每个鼠标测量3次,每10分钟的间隔,计算平均值。20秒的上限设置为PWL防止烧伤。

2.4.5。测量机械痛觉过敏

机械痛觉过敏是衡量IITC•冯•弗雷(室温2390在一个安静的环境°C) (17,18]。老鼠放在一个特殊的玻璃网格,适合安静的环境,实验了。简单地说,正确的后爪的中心的皮肤刺激,观察PWL。每个鼠标测量3次,每10分钟时间间隔测量,计算平均值。

2.4.6。脾脏和胸腺指数

安乐死小鼠的胸腺和脾脏被剥夺了,体重、胸腺和脾脏指数的计算。胸腺指数=胸腺质量/小鼠体重,脾和脾指数=质量/老鼠体重。

2.4.7。分析等离子体β端,CRF, il - 1β通过ELISA和肿瘤周围组织

眼球的血液收获六从每组小鼠,立即放置在干净的埃普多夫(EP)与肝素管,在4°C离心10分钟,浮在表面的等离子体被转移到干净的EP管和储存在−80°C进行分析。正确的爪子硫化钠脱毛8%解决方案,和肿瘤及其周围组织被剔骨了。重量/体积比为1:9 + NS是10%的匀浆(低温)离心机(3000转/分钟)15分钟在4°C,和上层等离子体被转移到干净的EP管和储存在−80°C的分析ELISA的决心β端在鼠标套件。

2.4.8。免疫组织化学分析β端、POMC和μ或者在肿瘤和周围组织

其余每组6只老鼠牺牲来获得正确的后爪。爪子硫化钠脱毛8%溶液,10%甲醛溶液固定24小时,脱钙作用30%醋酸溶液为10天。组织被放置在70%乙醇溶液和获得免疫组织化学的石蜡包埋切片。streptomycinavidin-peroxidase试验是采用免疫组织化学显示适当的装备。积极的结果在光学显微镜下观察hyalomitome和细胞膜出现布朗(β端或μ或者)。

2.5。统计处理

所有定量数据来自本研究进行了分析统计。结果表示为的意思标准偏差(SD)。数据库设置了SPSS 13.0软件包(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。组间差异分析单向方差分析(方差分析)。如果方差是常规的,测试或Bonferroni测试使用,如果方差是不规则的,Tamhane方法被用作双边测试。结果值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。鼠标后爪癌症疼痛模型的建立

图1显示鼠标爪子癌症疼痛模型成功建立。与左爪(注射生理盐水),正确的后爪的体积注射H22肝癌细胞逐渐增加目视检查随着时间的流逝。正确的爪子被发现有大量的癌细胞(标有蓝色箭头)在接种后第4天的苏木精和伊红。有一个倾向于骨入侵在正确的后爪,在接种后第十天开始,骨组织毁于前20天,30天进一步受损。

3.2。Cinobufagin对热痛觉过敏

热痛阈值的老鼠在对照组7秒,这是更高的()比后注入H22肝癌细胞(3秒)8天。相应的药物管理的9天,和吗啡工作速度比其他疗法,并立即提高疼痛阈值正常。Cinobufagin也显著提高痛阈第四天,逐渐增加到第六天。cinobufagin在热痛觉过敏的影响被周边阿片受体拮抗剂NAL-M(图2)。

3.3。Cinobufagin对机械痛觉过敏

机械痛阈值在对照组小鼠为11.5 g,这远高于后注入H22肝癌细胞(4.0 g) 8天()。相应的药物管理的9天,立即和吗啡,增加正常小鼠的痛阈()。Cinobufagin也显著提高痛阈(第四天),逐渐增加到8天()。此外,cinobufagin的热痛觉过敏效果被周边阿片受体拮抗剂NAL-M(图3)。

3.4。Cinobufagin对脾脏和胸腺指数的影响

结果表明,模型组的脾脏和胸腺指数与对照组相比显著降低(和、职责)。然而,cinobufagin显著增加脾脏和胸腺指数较模型组(和、职责),和吗啡显示小影响这些免疫器官与模型组相比(表1)。

3.5。Cinobufagin效应的表达式β端,CRF, il - 1β正确的后爪肿瘤及邻近组织

的表达β端在等离子体、肿瘤和邻近组织癌症疼痛模型小鼠远低于控制老鼠的和、职责)。Cinobufagin显著增强的表现β端肿瘤和周围组织与模型组相比,(和、职责)。然而,的水平β端在等离子体显示Cinobufagin治疗(表后变化不大2)。CRF和il - 1的表达β在等离子体、肿瘤和邻近组织癌症疼痛模型小鼠远高于控制老鼠();治疗后与Cinobufagin CRF的表达在肿瘤显著增加,相邻组织相对于模型组()。然而,CRF的水平与cinobufagin等离子显示治疗后变化不大。此外,周边阿片受体阻断药,NAL-M,有一个小影响cinobufagin增加血浆CRF(表的水平2)。

3.6。Cinobufagin对蛋白表达的影响β端、POMC和μ或者正确的后爪肿瘤及邻近组织

在对照组,免疫组织化学结果显示,有显著的表达β端、POMC和μ或者和广泛分布的正面棕色染色观察在许多hyalomitome(或细胞膜)。然而,几乎没有正面彩色区域和更少的黄褐色细胞模型组,这意味着这些细胞的表达在癌症疼痛的老鼠很低。Cinobufagin显著增加细胞的数量表达β端和积极的颜色的数量远远高于癌症疼痛模型小鼠。相比之下,显示吗啡对表达的影响不大β端、POMC和μ——(图4,5,6)。

4所示。讨论

4.1。成立后爪癌症疼痛模型

机制说明和新疗法在癌症疼痛的研究一直阻碍由于缺少合适的癌症疼痛的实验动物模型。2001年,Wacnik和他的同事们19)建立移植动物模型的癌症疼痛的黑色素瘤后肢的不同区域。接下来的几个实验室使用不同的方法来模拟癌症患者,建立了各种不同的动物模型肿瘤导致的痛苦(20.]。随后,Medhurst et al。21- - - - - -24)成功地建立了大鼠模型骨癌疼痛的接种MRMT-1鼠乳腺癌细胞的胫骨Sprague-Dawley老鼠。这个模型显示后肢减肥,机械痛觉过敏和异常性疼痛和其他疼痛反应的行为。同时,建立了癌症疼痛的许多小鼠模型,包括骨癌疼痛模型小鼠胫骨、股骨癌症疼痛模型,和足跟疼痛模型,这些模型作出了巨大的贡献,阐明癌症疼痛机制和寻找新的药物来治疗癌症疼痛。然而,大多数的疼痛模型目前通过手术,导致疼痛和伤害身体和不匹配相关的临床癌症疼痛。

相比之下,由李等实验方法。25]HCa-1癌症疼痛模型的影响/ HeJ老鼠很简单,显示不仅机械热痛觉过敏和痛觉过敏,还一个“镜像痛苦”的现象。这种疼痛模型更成功,导致对身体损害较少,可以作为一个理想的模型识别癌症疼痛的药物治疗。基于这个模型,实验H22癌症疼痛模型成立于这项研究。癌症细胞渗透到骨的后爪观察,结果表明疼痛模型是成功的,对身体造成的伤害较小,可以作为一个理想的模型来确定药物治疗癌症疼痛的。

4.2。小鼠模型的评价骨癌疼痛和Cinobufagin效果

在人类肿瘤导致伤害和持续钝痛。由于骨破坏的加剧,疼痛逐渐增加和运动或触摸会引发剧烈的疼痛。在此基础上,最重要的因素的实验动物模型是痛苦的行为应该是类似于人类疾病。它的发生和程度正相关的骨破坏和溶骨的活动(26]。在我们目前的研究中,本研究癌症疼痛的动物模型是类似于疼痛的临床表现;管理药物之前,机械痛阈值为11.5 g和热痛阈值是7秒;在接种后的第四天,行为的迹象机械观察疼痛和辐射热痛觉过敏,分别。机械痛阈值逐渐恶化,下降到4.0 g 8天,而热痛阈降低了逐渐3秒8天。“镜像”痛苦了这些动物的第12天,和重大机械和热痛觉过敏持续了18天。疼痛的后爪注射癌细胞在两天后政府是由于显著肿胀比正常后爪(),疼痛逐渐增加。疼痛的爪子被发现有大量的肿瘤细胞在接种后第4天苏木精和伊红。有一个倾向于骨入侵在疼痛后爪开始接种后第十天,和骨组织被摧毁前20天内,进一步损害观察30天。

吗啡的政府9日天快速效应与模型组相比,小鼠的痛阈提高到正常水平。Cinobufagin显著增加热痛和机械痛阈值在注射后第四天。此外,cinobufagin逐渐引起高原机械痛阈值的第六天,第八天的热痛阈值趋于稳定后管理。NAL-M周边阿片受体拮抗剂,消除了热痛觉过敏cinobufagin的效果。

4.3。的作用机制Cinobufagin在癌症疼痛的治疗

最近,临床研究表明,cinobufagin显示疗效提高痛阈,减少有害反应的程度,通过改变心理环境,缓解疼痛,减少毒性的优点和没有上瘾或退出障碍。然而,cinobufagin衰减癌疼痛的机制尚不清楚。在这项研究中,cinobufagin的影响在小鼠癌症疼痛的症状,疼痛阈值,和免疫器官指数调查,建立小鼠模型后后爪癌症疼痛。结果表明,cinobufagin老鼠可以改善癌症疼痛的症状,提高痛阈,其机制可能涉及增加的内容β端后爪肿瘤及其周围组织。结果还表明,它的前体蛋白,POMC,明显表达,说明cinobufagin显著改善其合成增加POMC的表达。

考虑其他的结果,我们可以假设过程如下:cinobufagin增强POMC的表达增加的合成和释放β端,提高CRF的水平提高的表现μ阿片受体,并最终增加的机会β端绑定到μ阿片受体在外围镇痛起着重要的作用。

5。结论

在这项研究中,Cinobufagin比吗啡治疗癌症疼痛。尽管吗啡立即工作,cinobufagin会影响周边阿片受体,没有副作用,如成瘾就像吗啡等阿片类药物,并可以用作代替吗啡治疗癌症疼痛患者。到目前为止,几乎没有信息潜在癌症疼痛的机制。我们的研究提供了一种新的调查方法的机制和临床治疗癌症疼痛。cinobufagin治疗的作用机理相关的鼠标后爪癌症疼痛主要是改善外围的水平β端和周边阿片受体的作用;然而,的合成β端是复杂的27,信号通路的机制改进的合成和释放β端尚不清楚。什么类型的免疫细胞有高表达POMC,哪些细胞因子参与,和外围immune-induced镇痛的影响机制都需要进一步研究。cinobufagin的镇痛效应在其他类型的癌症疼痛模型和澄清的具体分子机制提高水平β端将提供更加坚实的理论依据cinobufagin的广泛的临床使用。

语句。Cinobufagin已被广泛用于治疗癌和发挥了重要作用在癌症疼痛的缓解。在这项研究中疼痛行为指数模型的免疫功能,合成和释放β端在肿瘤和周围组织的表达μ口服补液盐进行了识别cinobufagin的外周机制减轻癌症疼痛。

缩写

ACTH:	促肾上腺皮质激素
α-MSH:	α促黑素细胞激素
β端:	β-内啡肽
CRF:	促肾上腺皮质激素释放因子
ELISA:	酶联免疫吸附测定
il - 1β:	Interleukin-1β
μ或者:	Mu-opioid受体
NAL-M:	纳洛酮methiodide
NS:	生理盐水
POMC:	Proopiomelanocortin
PWL:	爪子延迟撤军。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

道陈和魏胡锦涛同样贡献了这项工作。Zipeng锣动物手术,进行行为测试,陈道和魏胡锦涛收集所有组织和免疫组织化学和数据分析进行写的草稿纸和cata他参与数据解读,论文的评论,和Jing Wang Xueqin Yu Ting Ai,凌和詹导致的概念和设计研究,协调所有的实验,数据分析和解释,论文的评论。

确认

这篇社论作者承认Baichang刘博士的帮助。本研究从国家自然科学基金共同支持的项目中国没有。81173612)和中国三峡大学科学基金会(没有。2011 KJ b016)。