文摘

急性脊髓损伤是最常见的一种人类脊髓损伤和复杂的疾病。我们旨在探索point-through-point针灸治疗的效果与细长的针在兔急性脊髓损伤及其可能机制。成年兔子被随机分为模型组、细长的针治疗组和空白组。免疫组织化学染色显示,Fas的蛋白质含量和caspase-3模型组明显高于空白组在每个时间点()和细长的针治疗组显著低于手术后第3和第5天()。rt - pcr显示模型中的Fas和caspase-3 mRNA水平组和细长的针治疗组显著高于空白组(0.01)。Fas的mRNA水平和caspase-3细长针治疗组明显低于模型组(第三天0.01)。因此,我们证实,细长的针疗法对急性脊髓损伤具有明显的影响在兔子。其机制是通过抑制Fas的表达→caspase-3级联,从而抑制脊髓损伤后细胞凋亡。

1。介绍

中医从所有年龄段集中中医的智慧,这导致了一个巨大的数量的信息。针灸是中国传统医学疗法,使用细长的针和现代渗透针刺。这种疗法具有良好的临床护理和针灸研究结果。与其他医疗技术相比在中国和在国外,细长的针疗法闻名更好的经济效益,先进性和代表性。

症状、发病条件、发病机理和病理的脊髓损伤(SCI)是复杂的。SCI是危害人类健康最严重的疾病之一,其机制是复杂的。最近的研究发现,细胞凋亡和各种脊髓损伤后基因的作用[1]。有临床报告2,3]。主张采用针灸治疗脊髓损伤的疗效。然而,其治疗机制尚不清楚。我们使用一个修改艾伦的成膜方法,脊髓损伤构建脊髓陪审团模型称为兔子T13-L1并耦合细长针刺穴位治疗。然后通过形状变化兔脊髓损伤后,我们测试了Fas受体细胞凋亡、蛋白质Caspase-3和mRNA的表达。

2。材料和方法

2.1。模型建立

聚氨酯为20%,1克/公斤注入耳静脉麻醉。然后,兔子在卧姿固定在手术台上,在无菌条件下,用T13为中心,中间的兔子的背上被割开约2 - 3厘米。T13-L1棘突和椎板被折下来,和一个3毫米宽的硬脑膜被曝光。修改艾伦的引人注目的设备被用来影响T13-L1脊髓与80克cm的力量。成功建立模型被认为是当时痉挛性摆动的尾巴,两下肢和身体颤动的,下肢弛缓性麻痹。操作后,“你的操作是用来按摩兔子的腹部每天帮助排便,排尿2 - 4次。连续三天,800000单位的青霉素注射预防伤口感染。

2.2。实验动物的准备和组织

八十四纯种日本兔子,未知的性别,体重2.5±0.25公斤是来自中国浙江医科大学动物实验研究中心。兔子被随机分成三组:模型组、SCI模型的建立没有细长的针疗法;细长的针组;和对照组。细长的针治疗,双方的细长的针是用来穿透”Chihpien”,“水槽”,每天“Qihai,”和“中间”。与此同时,“Chihpien”和“水槽”形成了一个循环,并与JL2B电脉冲刺激器15分钟20 - 40次/分钟的速度在1.5 - 3 V的强度。虚假的操作组,我们经营T13-L1棘突椎板,和一个3毫米宽的硬脑膜开放但是脊髓没有感动,没有电刺激。我们发现穴位位置对实验动物”实验的主题。”

2.3。切片制备

每个动物组是牺牲了一日,3日,手术后5天。麻醉后,纵向切了胸部的中间;心被曝光。然后,左心室和右心房打开,从左心室,一根管子插入主动脉。然后,生理盐水注入到灌流液变得清晰和明亮。接下来,热量迅速充满了4%多聚甲醛PD方案(pH = 7.4) 50毫升/分钟的流量3 - 4分钟,其次是10毫升/分钟的流量20分钟。后,一个1厘米T13-L1椎段脊髓被移除。最后,4%多聚甲醛溶液用于修复标本24 - 48 h。样本通常嵌入在石蜡和切片的厚度4μ为保护m。

2.4。苏木精和伊红染色(他)

片来自每个兔子随机和通常与苏木精和伊红染色。然后,脊髓的形状变化通过光学显微镜观察。

2.5。免疫组织化学染色法(SP)

部分从每个兔子被随机选择和染色根据制造商的指示。Fas的抗体浓度是1:100和caspase-3 1: 4000。涂颜色是用苏木精复染色。二甲苯是用来使组织透明和部分被安装。PBS是用作负控制。阳性细胞和endochylema淡棕色。奥林巴斯BX-50光学显微镜在400字段,三个字段被随机选中的每部分观察前所有阳性细胞的表达和脊髓后角(endochylema有淡棕色细胞和细胞核)。图像分析软件Image-Pro +被用来计算光学密度。

2.6。半定量rt - pcr作证Fas和Caspase-3 mRNA的表达

三只兔子从每组选择在每个时间点和试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)是用于提取每个脊髓组织的总RNA。OD也决定。逆转录工具包(所有应用生物系统公司,促进城市,CA)被用于制造cDNA、和PCR扩增。Gre-pro被用来分析电泳灰色Fas和caspase-3 mRNA和计算相对表达式。相对表达量=实验灰度级/内部参考灰色的水平。

根据基因序列中,我们使用底漆5.0软件(加拿大总理公司)为Fas和caspase-3设计引物。引物序列见表1。β肌动蛋白作为内部参考。

2.7。统计处理

统计软件SPSS17.0(美国公司SPSS,芝加哥,IL)被用来分析数据,并作为结果。方差分析和LSD。当,被认为是具有统计学意义的差异。

3所示。实验结果

3.1。由于他的染色

sham-operation后第五天,一个灰白色的边界脊髓和核神经元的形状像波有两个高峰,胶质细胞分散,核尼氏小体明显(他×400,图1(一))。模型组手术后第一天,失去了脊髓组织的正常结构;有出血、水肿和坏死;灰质和白质之间的边界是不清楚;神经核减少的一部分;有腔消失。神经胶质细胞扩散,当地的淋巴细胞浸润(他×200年,图1 (b))。细长的针治疗后第一天,失去了脊髓组织的正常结构;有出血、水肿、坏死和髓鞘脱失;灰质和白质之间的边界是不清楚;神经核减少的一部分;和gliocytes受损区域周围扩散(他×200,图1 (c))。模型组手术后第五天,脊髓组织的结构紊乱,有严重的karyopyknosis,和一个更大的空腔形成过度gliocyte扩散(他×400图1 (d))。细长的针治疗后第五天,仍有一些完整的神经核。灰色和白色之间有一个清晰的边界问题,少gliocyte扩散(他×200,图1 (e)),没有流血。

3.2。结果免疫组织化学

Fas和caspase-3光密度值的结果兔脊髓组织中每一组在不同时间点提出了表2。积极的表达模型中每个样本点组明显不同于虚假的操作组。积极的表达每个Fas蛋白采样点在细长的针组比模型组显著不同。积极表达caspase-3术后第3和第5天细长针组与模型组明显不同。

3.2.1之上。Fas免疫组织化学结果

没有积极的表达每个采样点在虚假的操作组(SP×400;图2(一个))。一些积极的表情出现在术后第一天在模型和细长的针组(表2)。表达在手术后第三天达到高峰。模型组的阳性细胞分散与受损的灰色和白色的神经元,和内白质表达阳性的细胞。发现积极的信号在胞外酶和endochylema (SP×400;图2 (b))。细长的针组一个小得多的可见阳性细胞的表达区域灰质比模型组(SP×400,图2 (c))。

3.2.2。结果Caspase-3免疫组织化学

几乎没有积极的表达每个采样点sham-operation组(SP×400;图2 (d))。术后第一天上有积极的表达模型和细长的针组(表2)。表达在手术后第三天达到高峰。模型组的阳性细胞主要分布在受损的背角灰质。发现积极的信号在胞外酶和endochylema (SP×400;图2 (e))。细长的针组,阳性表达的背角地区脊髓灰质。然而,阳性细胞的表达更分散比模型组(SP×400;图2 (f))。

3.2.3。半定量rt - pcr结果Fas和Caspase-3 mRNA的表达

表3显示了Fas的表达式,脊髓损伤后caspase-3信使rna。RNA提取如图的完整性3。电泳的结果呈现在图4。Fas和caspase-3 mRNA表达每个采样点的模型和细长的针组显著增加比虚假的操作组。Fas mRNA的表达在第一和第三天后操作细长针组比模型组显著不同。caspase-3 mRNA的表达在术后第3和第5天细长针组比模型组显著减少更多。

4所示。讨论和分析

“细长针”一词来源于长针的“经典九针”《黄帝内经》(内部医学佳能),wheat-like闻名的形状。细长的针是最薄的针灸针,和渗透针刺针刺是小说风格的深。细长的针疗法可以帮助疏通内脏气血和经络。然后,通过经络的感应,气到达受灾地区。这种疗法的效果超越普通的丝状针。毛(4)总结使用细长的针疗法的临床报道,细长的针治疗的重点应该放在深渗透。因此,细长的针疗法适用于疾病的神经,肌肉和韧带。Chihpien hand-manipulating路线和水槽,伴随着血管解剖,可以确认的血管和神经束存在于盆腔自主神经。细长的针用来刺激可以调整膀胱逼尿肌和尿道sphincterismus盆腔自主神经,同时也会影响协调肌肉。此外,它可以到达脊髓中心或大脑皮层,这神经信号的传导影响修复受损脊髓组织。

在我们的实验中,我们发现神经细胞凋亡存在脊髓损伤后与坏死。在初选期间的损失,细胞器损伤或溶解,区域结构的质量,和细胞凋亡,karyopyknosis,凋亡的身体形成。还有一个或多个凋亡周边地区脊髓组织。因此,细胞凋亡是一个因素导致病变区域的扩张,它同意先前的研究[5,6]。使用“Chihpien-Flume”细长针穿透点可以节省更多的脊髓损伤组织神经元比模型组。这种技术也澄清了神经细胞结构,减少水肿和坏死,与模型组相比。也有更少的神经胶质细胞扩散,Fas和caspase-3蛋白质表达式和Fas和caspase-3 mRNA表达的细长的针组比模型组。因此,细长的针技术是有效的治疗脊髓损伤和减少细胞凋亡是其疗效机制之一。

脊髓损伤包括两种类型,一种是原发性脊髓损伤,另一个是连续的脊髓损伤。原发性脊髓损伤是由于机械压力,出血,或细胞内电解质变化。脊髓损伤主要发生在几个小时,是不可逆转的。顺序脊髓损伤是指一系列的生物化学变化,包括缺血再灌注、炎症、细胞凋亡、免疫反应,血脊髓屏障损伤,细胞内和细胞外离子干扰,自由基反应。推迟死亡的神经细胞从脊髓损伤可能是可逆的7]。药物、physicotherapeutics和操作可以对待SCI后二次伤害,能促进脊髓的再生。连续的脊髓损伤的有效治疗可以改善患者的预后和生活质量(8]。因此,连续的脊髓损伤后神经复苏也是我们研究的重点。

细胞凋亡是一个重要的组成部分,顺序脊髓损伤。从病理学的角度来看,机械力可以引起出血,这是紧随其后的是组织血管痉挛、血栓形成毛细血管内和在当地神经组织缺血。机械力和在当地神经缺血组织可以reinjure毛细血管内皮细胞,导致炎症介质的表达和激活的胶质细胞和单核巨噬细胞系统。然后,炎症细胞聚集并堵塞毛细血管,加剧了局部缺血(9]。脊髓损伤后,稳定的变化参与病理变化的因素,如氧自由基和兴奋性氨基酸,能引起氧自由基反应,脂质过氧化反应,会引起。这可能导致细胞膜通透性的改变,细胞内钙、钠离子超载,细胞水肿(10]。这些变化会最终导致细胞凋亡。大量炎症介质的表达和肿瘤坏死因子也可以诱导细胞凋亡的死亡受体Fas / TNFR介导途径[11]。

Fas 45 kDa膜蛋白受体,属于家庭肿瘤坏死因子受体(TNFR) (12]。Fas可以结合caspase-8 death-inducing信号复杂。因此,Fas能促进细胞凋亡的表达(13]。细胞凋亡的共同通路在后期是半胱天冬酶的激活。半胱氨酸蛋白酶半胱天冬酶功能作为最后一个中心与几个激活细胞凋亡的因素。激活caspase-3可以减少许多蛋白质基质,包括细胞骨架蛋白(α血影蛋白,β血影蛋白、肌动蛋白和τ蛋白),蛋白参与细胞骨架的规定,和酶参与DNA修复,如PARP DNA-PKcs,细胞凋亡蛋白bcl - 2。这最终可能会导致细胞死亡14,15]。在我们的实验中,我们观察到更少的Fas和caspase-3蛋白质的表达和Fas和半定量rt - pcr caspase-3 mRNA表达低于模型组。Fas mRNA表达1日、3日和5日天模型组的2.1、4.0和3.4倍的虚假的操作组。通过统计分析,这对应于方差的同质性。我们观察到,Fas mRNA的peak-expression比早些时候caspase-3 mRNA。这表明,细长的针疗法的机制是首先激活Fas,经过一连串的反应,激活caspase-3级联。细长的针针灸对脊髓损伤的疗效,并抑制细胞凋亡是其机制之一。的Fas→caspase-3级联的方法可能是细胞凋亡抑制脊髓损伤后在使用细长的针。这为科学提供了新的证据,为治疗脊髓损伤提供新的线索。

5。结论

鼓励综合治疗是SCI的常见的临床治疗方法,和针灸作为传统和经济技术在治疗脊髓损伤有影响(16]。本研究尝试建立一个新的理论基础使用细长的针疗法治疗脊髓损伤。

承认

作者想感激地承认金融支持浙江省和杭州市科技计划。