文摘
动脉粥样硬化与许多心血管并发症的发展。血管平滑肌细胞的异常增殖(VSMCs)在动脉粥样硬化的发展起着至关重要的作用。VSMCs因此,细胞凋亡,这发生在血管增殖的恶化,可能会提供一个有益的策略来管理心血管疾病。Andrographolide,一种新颖的核因子-κB抑制剂,是最活跃和重要组成部分分离出的叶子穿心莲香。最近的研究表明,andrographolide是一个潜在的治疗通过诱导细胞凋亡剂治疗癌症。在这项研究中,凋亡诱导活性和机制在andrographolide-treated鼠VSMCs特征。Andrographolide显著诱导活性氧(ROS)的形成,激活p53,伯灵顿,和活跃caspase-3表达式,这些现象是由预处理抑制细胞N-acetyl-L-cysteine,活性氧清除剂,或二苯基碘鎓、一个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(Nox)抑制剂。此外,p47phox氮氧化物亚基蛋白,在andrographolide-treated鼠VSMCs磷酸化。与3-O-methyl-sphingomyelin然而,预处理,中性鞘磷脂酶抑制剂,显著抑制andrographolide-induced p47phox磷酸化以及伯灵顿和活跃caspase-3表达式。我们的结果共同表明andrographolide-reduced细胞生存能力可以归因于在VSMCs细胞凋亡,这与ceramide-p47phox-ROS信号级联相关凋亡诱导活性。
1。介绍
动脉粥样硬化仍然是一个主要和提高健康问题在发达国家,尽管预防战略已经大幅增加了。因此,开发新颖的治疗药物对动脉粥样硬化患者仍然是一个主要的研究重点1]。异常的血管平滑肌细胞(VSMCs)扩散可以扮演关键角色在atherosclerosis-related事件的发病机制包括支架内再狭窄,经皮腔间血管成形术后再狭窄,移植血管病变,静脉旁路移植失败(2,3]。因此,抑制VSMC增殖可能是治疗心血管疾病的一个主要目标。VSMCs细胞凋亡或程序性细胞死亡,这发生在血管增生性疾病的发病和进展,如动脉粥样硬化和再狭窄,通常代表一个血管重构的关键特性(4]。此外,neointima VSMCs病变发展和增长似乎受制于晚期凋亡[5]。生存和死亡之间的调节平衡细胞信号被用来控制细胞凋亡的启动(6]。因为细胞凋亡可以抑制VSMCs的增殖,诱导凋亡可能治疗增生性心血管疾病提供了药理学依据。
增加活性氧(ROS)的生产是在VSMC增殖和凋亡起着至关重要的作用,导致动脉粥样硬化的发展。细胞凋亡引起的VSMCs增强活性氧产量影响动脉粥样硬化病变的进展,可能导致斑块破裂(7]。ROS很小,极活性分子,因为他们的未配对价电子。有一些细胞内ROS生产商,包括2主要制造商、线粒体和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶。迅速扩大的实验证据收集自第一蕴涵识别VSMCs NADPH氧化酶(Nox)的根本原因是血管细胞氧化应激在各种心血管疾病(8]。氮氧化物是一个复杂的由膜结合(p22phox和Nox1-4)和胞质(Rac, p47phox p67phox)子单元。激活时,胞质单元连接与膜结合同行并生成一个活跃的氧化NADPH的复杂,导致活性氧的生产(9]。ROS的Nox-dependent生产被认为是一个至关重要的监管机构的平滑肌细胞生存能力被认为是与人类动脉粥样硬化病变的发展和严重性(10]。
Andrographolide(图1),一种新颖的核因子-κB (NF -κB)抑制剂,是最活跃和重要组成部分分离出的叶子穿心莲香(11]。答:香一直被用作中药预防和治疗上呼吸道感染、腹泻、类风湿性关节炎、喉炎在亚洲和斯堪的纳维亚半岛(11,12]。最近的研究表明,andrographolide抑制肿瘤生长,诱导细胞周期阻滞(13,14)或细胞凋亡(15,16在各种类型的癌细胞。最近,我们之前的研究证实,andrographolide增强了NF -κB亚基p65 Ser536脱磷酸作用通过中性鞘磷脂酶(nSMase)介导的神经酰胺形成VSMCs [17),包括环磷鸟苷/ PKG的增加,抑制p38MAPK / HO紧随其后−nf -κB-ERK2级联激活血小板(18,19]。然而,andrographolide抗增殖和对各种类型的癌细胞凋亡的影响,无论是发生凋亡VSMCs尚不清楚。此外,ROS穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯调节凋亡诱导活动,但在andrographolide-induced活性氧的来源形成凋亡仍不清楚。在目前的研究中,通过考虑异常VSMC增殖的关键角色发展的动脉粥样硬化和再狭窄,我们检查了详细的相关细胞信号事件andrographolide-induced VSMC凋亡。
2。材料和方法
2.1。材料
杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM),胰蛋白酶(0.25%)、谷酰胺、青霉素、链霉素、胎牛血清(的边后卫)从Gibco购买(盖瑟斯堡,医学博士,美国)。Andrographolide (≥98%), 3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT) N-acetyl-L-cysteine (NAC),氯化diphenyleneiodonium (DPI), 2, 7-dichlorofluorescein二乙酸(DCF-DA)和二甲亚砜(DMSO)获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。从Biomol 3-O-methyl-sphingomyelin (3-OMS)购买(美国普利茅斯会议上,PA)。Anti-caspase-3单克隆抗体(mab)和anti-Bax多克隆抗体(帕布)从细胞信号(美国贝弗利,MA);的anti-phospho-p47phox serine359帕布从收购Abcam(美国Cambridge, MA);反α微管蛋白得到马伯NeoMarkers(弗里蒙特、钙、美国)。的hybond-P聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF),增强化学发光(ECL)免疫印迹检测试剂和分析系统,辣根过氧化物酶(合)共轭驴anti-rabbit免疫球蛋白G(免疫球蛋白),和羊anti-mouse免疫球蛋白是从Amersham收购(英国白金汉郡)。Andrographolide溶解在0.1%二甲亚砜(DMSO)和储存在4°C到使用。
2.2。大鼠主动脉平滑肌细胞的主要文化
本研究中使用的雄性Wistar鼠从BioLASCO购买(台北,台湾)。VSMCs是具有分散的雄性Wistar鼠(250 - 300克)。胸主动脉的Wistar鼠被剥夺了内皮和动脉外膜。得到了VSMCs使用联合胶原酶和弹性蛋白酶消化方法的修改(20.]。这些细胞在DMEM补充20毫米消息灵通的,10%的边后卫,青霉素和链霉素1%,2毫米谷氨酰胺在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2。生长培养基是改变每2 - 3天,直到细胞达到融合。生长培养基被删除,单层与磷酸盐(PBS)冲洗。trypsin-EDTA的解决方案是添加,单层孵化在37°C 2分钟。菜肴文化相差显微镜下观察到的细胞分离。细胞被使用10毫升的DMEM和离心机在900转7分钟。的颗粒在DMEM resuspended培养皿,和细胞从段落4 - 8被用于实验。主要培养大鼠主动脉VSMCs显示“跌宕起伏”的模式,和的表达α光滑的肌肉肌动蛋白被证实(数据没有显示)。批准的协议都是台北医科大学动物保健和使用委员会。
2.3。细胞生存能力分析
VSMCs (细胞/)被播种在DMEM 24-well盘子和培养含有10%的边后卫24 h。VSMCs是使用NAC(1毫米)被处理之前andrographolide (50米)48 h。使用比色测定细胞数量测量基于可行的细胞中线粒体减少肝癌的能力(如前所述)(21]。细胞数量指数作为治疗细胞/控制细胞的吸光度计算×100%。
2.4。测量细胞内的活性氧
VSMCs (细胞/盘)装载DCF-DA (20米)为20分钟,然后按照实验设计进行处理。这些细胞被胰蛋白酶化之前用PBS。细胞内活性氧的水平被发现使用库尔特史诗XL流式细胞仪(美国贝克曼库尔特、迈阿密、FL)。数据收集从10000年每实验组细胞。所有的实验都重复至少4次,以确保再现性。
2.5。免疫印迹分析
免疫印迹分析如前所述[20.]。简单地说,VSMCs (5×105细胞/盘)被视为实验设计。实验周期后,蛋白质提取使用裂解缓冲。溶菌产物离心机,浮在表面的蛋白质(50g)收集并受钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和分离蛋白electrophoretically转移到0.45m PVDF膜用半干的转移(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。与TBST这些墨迹被封锁(10毫米Tris-base、100毫米氯化钠和0.01%渐变20)含5%牛血清白蛋白1 h,然后对各种主要抗体。细胞膜是孵化HRP-linked anti-mouse免疫球蛋白或anti-rabbit免疫球蛋白(TBST稀释1:3000)1 h。免疫反应性的乐队被发现使用一个发射极耦合逻辑系统。酒吧图表描述扫描获得的定量结果的比率反应乐队和量化的光学密度通过视频微(Bio-Profil;Biolight Windows应用程序版本2000.01;Vilber Lourmat、法国)。
2.6。转染和荧光素酶记者化验
细胞转染PG13-luc和Renilla使用Turbofect试剂luc质粒。处理和未经处理的细胞被收获,荧光素酶的活动水平是决定使用Dual-Glo荧光素酶检测系统设备。荧光素酶活性水平是规范化的基础上Renilla荧光素酶活性水平。荧光素酶活性水平的量化是细胞的活性比对待andrographolide的未经处理的控制细胞。
2.7。统计分析
实验结果表示为手段标准误差,并伴随着观测的数量。使用方差分析数据进行评估。如果分析显示显著差异当中唯一的手段,然后每组与其他使用Newman-Keuls方法。的值被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。ROS的角色在老鼠VSMCs Andrographolide-Reduced细胞生存能力
我们之前确定andrographolide导致损失的细胞浓度的方式可行性通过MTT试验(未发表的数据)。然而,这一现象相关的详细机制仍不清楚。活性氧的形成是在细胞凋亡中起关键作用7]。因此,我们调查了活性氧的作用andrographolide-induced VSMC死亡。图2(一个)表明治疗50μM andrographolide显著诱导活性氧的形成倍较对照组(10分钟,)。我们随后preincubated NAC(1毫米)活性氧清除剂,在andrographolide-treated VSMCs。图2 (b)表明治疗老鼠VSMCs andrographolide减少细胞的可行性%与对照组相比,与1毫米),而预处理NAC显著逆转andrographolide-induced减少VSMC可行性(,)。综上所述,这些数据表明,减少细胞生存能力andrographolide-treated鼠VSMCs有关细胞氧化还原状态,可能由于活性氧的形成。
(一)
(b)
3.2。Nox-Mediated氧化还原信号Andrographolide-Induced活性氧的形成
冠状动脉再狭窄,血管成形术的一个常见并发症,是伴随着Nox-generated ROS增加生产22]。因此,我们调查了Nox-mediated信号参与andrographolide-induced活性氧的形成。在图3(一个)预处理,NAC(1毫米)或DPI (10米)、氮抑制剂显著抑制andrographolide-induced ROS的形成。此外,越来越多的证据表明,氮氧化合物的活化单元p47phox需要血管细胞的活性氧产量(23]。我们随后决定是否需要氮单元激活在老鼠VSMCs andrographolide-induced ROS生产。如图3 (b),serine359磷酸化p47phox子单元是显著增加倍andrographolide刺激10分钟后与对照组相比,)。这些结果表明,磷酸化的氮氧化物亚基p47phox调节活性氧形成老鼠VSMCs andrographolide对待。
(一)
(b)
3.3。ROS拾荒者对Andrographolide-Stimulated p53激活,伯灵顿,活跃在老鼠VSMCs Caspase-3表达式
众所周知,氧化应激引起的激活和核易位p53 [24],p53诱导细胞凋亡涉及ROS的生成(25]。因此,我们使用一个PGl3-Luc记者构造包含p53 dna结合位点与基底控制表达的启动子荧光素酶报告基因(26)检查是否p53 transactivation增加细胞暴露于andrographolide。如图4(一)50,细胞治疗M andrographolide 24 h展出倍增加PG13-luciferase活动水平与对照组相比,)。预处理细胞与南汽或DPI PG13-luciferase活动显然抑制andrographolide-induced增加68.8%和65.6%,分别为()(图4(一))。
(一)
(b)
(c)
有人建议,激活p53的监管和促进细胞凋亡级联的离散步骤如upregulation伯灵顿基因(27)和伯灵顿的过度凋亡加速死亡通过与组件的交互渗透过渡孔复杂,导致开幕式和破裂的线粒体外膜(28]。如图4 (b)治疗50M andrographolide 48 h显著诱导伯灵顿的表情倍与对照组相比,),而预处理与南汽或DPI显著抑制andrographolide-induced减少伯灵顿表达59%和18%,分别为()。活动caspase-3的表达水平,apoptotic-pathway-related proapoptotic蛋白质,随后确定andrographolide-treated VSMCs。如图4 (c)、治疗与andrographolide活动caspase-3 48 h的含量显著增加50倍的浓度与对照组相比,(,),而预处理与南汽或DPI显著抑制andrographolide-induced减少活跃caspase-3表达了43%和29%,分别为()。这些结果表明Nox-mediated氧化还原信号诱导激活p53以及伯灵顿和活跃在andrographolide-treated鼠VSMCs caspase-3表达式。
3.4。神经酰胺的作用信号Andrographolide-Induced p47phox磷酸化,伯灵顿,活跃在老鼠VSMCs Caspase-3表达式
的精确机制参与p47phox andrographolide-induced磷酸化的老鼠VSMCs仍不清楚。一项研究报道神经酰胺是一个关键信号分子介导氧化氮在不同细胞的激活(29日]。此外,我们表明,andrographolide可以激活nSMase-ceramide鼠VSMCs串接在一起,和andrographolide-induced神经酰胺形成被3-OMS明显减弱,nSMase抑制剂(17]。如图5(一个),与3-OMS预处理(30米)30分钟显著抑制andrographolide-induced p47phox磷酸化38% (,)。预处理与3-OMS也显著减少andrographolide-induced伯灵顿和活跃在老鼠VSMCs caspase-3表达式(数字5 (b)和5 (c))。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
VSMCs代表一个移动组件的脉管系统和构成内侧层血管。VSMCs病理刺激后可以采用“去分化”表型或接受肥大和合成细胞外基质过剩和炎性细胞因子,划分和向内膜迁移。异常增殖和凋亡减少会导致过度积累VSMCs内膜和媒体的参与动脉粥样硬化病变(30.]。的变化之间的平衡的增殖和凋亡VSMCs被认为扮演着至关重要的角色在动脉粥样硬化和心血管疾病的发展31日,32]。因此,维持增殖和凋亡之间的变更VSMCs已被建议作为一种有效的治疗方法,预防和治疗血管疾病,包括动脉粥样硬化(33]。细胞凋亡(程序性细胞死亡)广泛的生理上的设置是删除废弃的细胞(34]。最近的研究表明,andrographolide抑制肿瘤生长,诱导细胞周期阻滞(13,14)或细胞凋亡(15,16在各种类型的癌细胞。在目前的研究中,andrographolide也观察到在老鼠VSMCs诱导细胞凋亡,而没有观察到的细胞毒性效应(数据没有显示),这表明andrographolide VSMC-proliferation-related疾病可能是一个潜在的治疗代理。
净平衡增殖、细胞凋亡和坏死决定细胞生长的程度。现在越来越多的证据表明,活性氧在细胞坏死和细胞凋亡中发挥作用(35]。Andrographolide据报道,诱导活性氧和caspase-dependent细胞凋亡在淋巴瘤细胞株和原发肿瘤样本(36]。因此,我们假设andrographolide可能导致老鼠VSMCs通过细胞凋亡机制,包括细胞氧化还原系统。我们确定,穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的浓度相关,伴随着活性氧生成(数字2和3(a))。
proapoptotic蛋白伯灵顿被破坏导致细胞凋亡的线粒体完整性(37]。杨等人证明andrographolide诱发伯灵顿的表达,还存在激活,刺激细胞凋亡在淋巴瘤细胞(36]。激活p53是增加伯灵顿的表情回应选择压力信号(38]。最近的一项研究发现,通过ROS-dependent andrographolide可以激活p53 TRAIL-induced细胞凋亡在肿瘤细胞(39]。在活性氧,是高活性和短暂的酶化后可以自发地或dismutate第二个信号中间,H2O2通过超氧化物歧化酶。虽然生产的对氮氧化物的主要生物活性,大部分的信号是由歧化作用的产品2O2。H2O2更稳定的并能穿过生物膜和诱导细胞核DNA损伤引起p53-dependent通路(40,41]。在目前的研究中,andrographolide-induced p53激活,伯灵顿,活跃caspase-3表达式被NAC治疗和DPI显著减少。这些数据显示的参与ROS-mediated p53-Bax-caspase凋亡通路在andrographolide-induced VSMC凋亡(图4)。
氮氧化物是multiprotein各种成分取决于细胞类型的配合物。这种酶,原本吞噬细胞中描述,包括(p22phox和Nox2)和3 2膜结合型子单位胞质子单元,如p47phox p67phox,和Rac1 (nonphagocytes)或Rac2(吞噬细胞),这是招募在激活膜结合Nox / p22phox复杂。VSMCs包含多个来源的活性氧,其中Nox1和Nox2是主要的。Barry-Lane等人认为p47phox是唯一的子单元,用于专门Nox2和Nox1 VSMCs表达(42]。此外,p47phox氧化酶激活需要一个磷酸化丝氨酸在359的位置,绝对是氧化酶活动所需和必须磷酸化允许易位(43]。功能角色p47phox也被证明利用p47phox VSMCs基因敲除小鼠,ROS的受体激动剂刺激的减少(44,45]。在目前的研究中,我们观察到,DPI,氮氧化物抑制剂,明显恢复ROS形成和凋亡诱导活动andrographolide-treated老鼠VSMCs,穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和孵化显然增加了p47phox的磷酸化,氮氧化物亚基。这些数据都表明,Nox-mediated氧化还原信号在老鼠VSMCs andrographolide处理中扮演着关键角色。然而,精确的机制参与p47phox andrographolide-induced磷酸化的老鼠VSMCs仍不清楚。
神经酰胺,中央核心脂质鞘脂类的代谢,是通过水解产生的复杂的鞘脂类,如鞘磷脂,哺乳动物的sma材料或通过酰化长链sphingoid基地(鞘氨醇)新创生物合成途径。sma材料及其在神经酰胺代谢作用是最广泛的研究。最近的研究表明,神经酰胺增加内皮细胞暴露于死亡因素,包括肿瘤坏死因子α白介素2和血管内皮抑制素,在缺血性reperfused心肌(46,47]。在这些研究中,神经酰胺信号通路已被证实参与氮氧化物和顺向的激活生产(48,49]。神经酰胺也增强了在哺乳动物细胞ROS生成直提高线粒体的膜的通透性细胞色素c (50和抑制线粒体分离复杂三世51]。此外,神经酰胺的积累造成的激活sma材料已被观察到的不同刺激,如氧化剂和热应力52,53]。另一方面,我们之前的研究发现,在VSMCs andrographolide可以直接提高神经酰胺水平,和这种现象被3-OMS明显减17]。在目前的研究中,我们观察到3-OMS显然废除andrographolide-induced p47phox磷酸化,伯灵顿,活跃的caspase-3表达鼠VSMCs(图5)。总的来说,这些结果表明,andrographolide增加的营业额在老鼠VSMCs鞘磷脂,这lipid-signaling通路可能调解的作用andrographolide-induced氮氧化物的激活,导致生产和凋亡诱导鼠VSMCs活动。
在目前的研究中,我们表明,andrographolide,植物的活性成分答:香有能力,减少老鼠VSMCs细胞生存能力。其凋亡诱导活性的深入机制有关Nox-mediated氧化还原信号的细胞,因为这个信号被南汽和DPI。此外,这是第一个研究表明ceramide-p47phox信号通路的作用在andrographolide-induced ROS-mediated细胞凋亡(图6)。总之,我们表明,ceramide-p47phox-ROS信号级联可能导致andrographolide-induced VSMC凋亡。使用这个小说自然内酯二萜作为心血管疾病的治疗策略包括VSMC增殖和血管硬化需要进一步临床前和临床研究。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是由美国国家科学委员会的支持,台湾(nsc97 - 2320 - b - 038 - 016 - my3和nsc100 - 2320 - b - 038 - 021 - my3),和台北医科大学(本校- r - 100 - 03年和TMU102-AE1-B20)。