文摘

电针刺激(EA)被证明能增加脑血流量(CBF)和减少缺血性梗塞脑缺血大鼠模型(大脑中动脉闭塞,MCAO)。自从推荐治疗脑缺血的多个穴位,我们进行了本研究调查是否有任何变化在EA预防脑缺血刺激老鼠的某些“穴位”。一个小时的对MCAO血流量减少85%的诱导广泛梗塞(32.9%大脑的3.8%)、严重神经赤字(规模= 6.00.5、鹿的规模)和17%(10 60)的死亡率。EA, sparse-dense波(5赫兹/ 20 Hz) 1.0 mA 30分钟,杜20,Du 26大大减少梗死到4.5%1.5% (),显著提高神经赤字(规模= 1.00.5,)和死亡率下降到7% (2 30,)。同样,EA离开李11 & PC 6梗塞体积减少到8.6%3.8% (),改善神经赤字(规模= 2.01.0,)和死亡率下降到8%(2的24岁)。与此形成鲜明对比的是,EA对李11 & PC 6没有导致任何明显的梗死体积(33.4%的变化6.3%),神经赤字(规模= 6.50.5),死亡率(20%,5个24)。EA左边阳陵泉& SP 6,也有不显眼的缺血性损伤。EA Du 20 & Du 26或离开李11 & PC 6瞬间诱发脑血流量显著增加。无论是EA对李11 & PC 6 GB 34 & SP 6增加脑血流量。这些结果显示,EA保护脑缺血相对特定穴位。

1。介绍

大脑缺氧/缺血,如中风,导致神经损伤(1- - - - - -4),导致神经系统残疾和死亡。预防和早期治疗是最重要的在减少其对受影响的个人和他们的家庭造成毁灭性的影响。然而,治疗策略目前非常有限的几十年来尽管广泛的研究。寻找新的和有效的治疗,包括补充和替代方法来预防/治疗缺血性损伤,是至关重要的。

中药(TCM)一直提倡使用针灸治疗中风和其他神经系统疾病。事实上,一些古老的中医书籍,例如,黄帝内经》(黄帝的内部经典)和紧急情况下处方手册》(周侯方),包含描述的针灸治疗类似中风的疾病。近年来,大量的文学作品出现在使用手动针灸或EA对大脑保护缺血性损伤人体和动物模型(5- - - - - -15]。然而,仍然有争议的临床结果(16- - - - - -18]。针灸的有效性证据在中风患者是不确定在临床环境中,这可能归因于方法学质量差和小样本。更多高质量的随机对照试验,需要长期跟踪(18]。

针灸诱发复杂影响中枢神经系统(19- - - - - -22),从而显示治疗对身体的影响,这是受到多种因素的影响,特别是刺激方式/参数和位置(穴位)。各种方法的差异和穴位的针灸操作可能大大影响即时疗效和患者的长期预后。然而,缺乏知识最佳针灸治疗缺血性损伤的条件。中医推荐各种穴位位于身体的不同部位和不同的方法acupunctural刺激。然而,大多数的这些建议都是基于个人经验和没有受到科学测试。因此,优化针灸条件最大功效是针灸的临界值,因为不同的操作会导致完全不同的结果。很明显,它是困难的,如果不是不可能的话)对病人进行这样的测试,因此必须主要通过动物研究完成。

最近,我们决定适当的EA参数对缺血脑保护(9,13]。事实上,我们的研究结果表明,目前EA刺激不同的频率和强度改变脑血流量和老鼠大脑梗塞体积暴露在大脑中动脉阻塞(MCAO)。因为有多个穴位在身体和EA的影响通常是特定穴位,同样重要的是定义每个相关穴位相对应的特定角色。尽管有零星的研究表明Baihui (Du 20)可能比其他穴位EA-induced保护脑缺血(11,15,23),比较各种穴位尚未执行的评估。

为了澄清基本问题有关的穴位特异性EA-induced脑保护缺血,我们进行了大量的实验老鼠调查的具体结果刺激穴位位于不同地区的身体在缺血条件下。我们特别选择了4双“穴位”头,左下肢,左右前四肢,除了分别控制。我们进行持续的监控来记录对血流的影响,神经赤字,和在缺血性脑缺血性梗塞可靠的所有组之间的比较。我们目前的数据,符合我们的初步研究结果10),表明穴位在头部和左(侧)前肢体带来最大保护缺血性损伤在MCAO大鼠模型中,暗示这些穴位在脑保护的重要性在中风。

2。材料和方法

2.1。动物

成年男性Sprague-Dawley老鼠(250 g±10 g)购买上海实验动物中心的中国科学院和居住的环境温度°C和免费的食物和水。所有手术麻醉下进行(氯酸盐水合物,400毫克/公斤,i.p)。所有动物程序批准的动物保健和使用委员会复旦大学上海医学院,上海,中国。

2.2。监测脑血流量

激光多普勒灌注监视器(LDPM, PeriFlux5000, Perimed,瑞典)是用于测量脑血流量。的主要过程(24)是如下。一个小圆孔位于1.5毫米后,前囱和5毫米侧矢状缝钻在右顶骨和激光多普勒探针(0.45毫米直径)然后插入2毫米的深度方法在脑软脑膜微血管浅皮层的血液灌注测量脑血流量的指数。头骨上的探针被固定骨头。脑血流量的变化被不断地监控所有的动物开始前至少5分钟的诱导脑缺血再灌注后约15分钟(直到动物复苏)。根据制造商,灌注值的变化取决于血细胞的数量目前在该地区被调查技巧和速度移动。血液灌注的变化记录的测量脑血流量的动态变化在局部地区经常使用LDPM实时监控。值衡量LDPM被表示为自动灌注单位(脓),移动血细胞浓度(在CMBC)和血液细胞的速度(速度)。这些值,聚氨酯是脑血流量的最重要指标,代表了产品的相对数量的血细胞和它们的相对移动速度。

2.3。诱导脑缺血

局灶性脑缺血模型建立了执行大脑中动脉阻塞(MCAO)基于巴隆等描述的方法。25]。短暂,老鼠手术麻醉操作暴露他们的右颈总动脉,颈外动脉、颈内动脉。切断后右颈外动脉的远端,刻画的是一段4 - 0单丝尼龙缝线(30毫米长度,直径0.18毫米,0.24毫米直径圆,MONOSOF, sn - 1699 g,美国)从右侧颈外动脉插入了右颈内动脉的长度~ 20毫米(到达右大脑中动脉)的起源,封闭右侧大脑中动脉的血流量。

规范我们的所有实验的实验条件组,我们不断地监控所有动物的血流量,以确保一个相对统一的水平的脑缺血实验之前就存在了。血液流动控制通过调整缝合动脉缺血的感应。缺血性老鼠显示稳定的~ 85%下降到基线水平相比,聚氨酯(MCAO之前),也就是说,达到一定程度的~ 15%的基线PU,被用于进一步的实验。这缺血性条件保持不变,小波动在整个缺血性时期。阻塞后,再灌注缺血区域的被允许通过撤回从右颈外动脉缝合。皮质血流量的变化不断监视所有的动物开始前至少5分钟MCAO和持续15分钟后再灌注(直到动物从麻醉中苏醒过来)。这段时间包括MCAO的整个过程以及EA的全部长度。

体温是由直肠温度计监测和维护为36.5°C±0.5°C从手术开始到动物从麻醉中恢复过来。再灌注后,动物被安置的环境温度为24小时°C。sham-operation组,同样的手术进行动脉阻塞。

2.4。应用电针刺激

EA是交付给4双“穴位”来比较其对脑保护和血流量的影响,那些被“Shuigou”杜(26)和“Baihui”(Du 20),离开“Quchi李(11)”和“Neiguan”(电脑6),对“Quchi李(11)”和“Neiguan”(电脑6),和左(GB 34)和“Yanglingquan Sanyinjiao (SP 6)如前所述。13,19,26),”Shuigou (Du 26)”和“Baihui (Du 20)”穴位在头和脸。杜Shuigou(26)位于上唇的中心位于一个点的2/3的口线连接的嘴巴和鼻子。Baihui杜(20)位于头部的中线,大约在这条线的中点的顶端连接两个耳廓。针的深度上使用Du 26是1毫米垂直成皮肤和2毫米间接Du 20。李“Quchi(11)”和“Neiguan”(电脑6)在前肢体穴位。李“Quchi(11)”是在大萧条时期肘关节外侧,和“Neiguan”(电脑6)之间的缝合尺骨骨和径向距离的3毫米优于腕关节。李左”Quchi(11)”和“Neiguan”(电脑6)对缺血侧大脑半球。正确”Quchi李(11)”和“Neiguan”(电脑6)侧缺血性脑半球。针的深度在李11日是4毫米垂直皮肤和PC 6是垂直2毫米。34 (GB)和“Yanglingquan Sanyinjiao (SP 6)后肢体穴位。 “Yanglingquan” (GB 34) is located in the depression below the capitulum fibulae posterolateral to the knee joint, and “Sanyinjiao (SP 6) is at a point 10 mm superior to the tip of the medial malleolus. Left “Yanglingquan” (GB 34) and “Sanyinjiao (SP 6) are contralateral to the ischemic cerebral hemisphere. The depth of the needle under GB 34 was 5 mm vertically to the skin and that under SP 6 was 6 mm vertically to the skin.

“最优”的刺激参数,即sparse-dense波(5赫兹/ 20 Hz) 1.0 mA,选择基于我们之前描述的报告(9,13]。在所有四个EA组,采用同样的参数只有一个不同穴位刺激。EA开始出现MCAO后5分钟,持续了30分钟。通过不锈钢丝状针(15毫米长度与直径0.3毫米,苏州医疗器械限制有限公司,中国)由一个EA装置(模型g - 6805 ii,上海医疗器械高新技术有限公司,中国)。这个EA装置已广泛应用于临床的实践在中医针灸。输出的强度和频率波与负向的脉冲(脉冲宽度=后缘女士;组件的直流电= 0)被一个通用示波器监视(模型XJ4210A,上海新建仪器设备有限公司,中国)。

缺血性与MCAO大鼠随机分为5组:只宏观(缺血,),缺血+ EA Du 20和Du 26 (李),缺血+ EA左11和PC 6 (),缺血+ EA对李11和PC 6 (),和缺血+ EA左边SP 6 GB 34 ()。最后,实现严格控制,我们使用相同的EA应用相应的穴位刺激参数对缺血性和非缺血型老鼠和测量脑血流量的变化(EA)来确定有一个acupoint-specific缺血下对脑血流量的影响。

2.5。评估死亡率和神经赤字

在我们的实验中,一些脑缺血大鼠再灌注后2至20小时死亡。死亡率计算基于死老鼠的数量在这一时期和老鼠在给定组的总数。虽然死亡可能是由于各种各样的原因包括出血,我们没有调查死因作为研究目标的一部分作为我们的目的是比较不同群体之间的死亡率。

在所有组神经行为进行评估,不包括大鼠MCAO后24小时内死亡。神经赤字进行评估在再灌注后24小时(之前抽样检测脑组织的缺血性梗塞和其他测试)。评估神经赤字是盲目的,也就是说,判断,得分神经赤字的程度根据预设标准也没有任何关于分组和治疗的知识。神经赤字的学位分级规模(0)到7 (13]。标准设定如下:年级0 -“正常”,对称的运动没有任何异常迹象;年级1-incomplete的左前翼举起尾巴时;年级2-doddery爬连同1级的迹象;年级3-kept左前肢体接近乳房举起尾巴时;年级4-left当爬行;年级5-left前爪向后推连同4级的迹象;年级6-repeated旋转运动与一个不能移动的后左肢;年级7-left卧位,因为身体支持无能。

2.6。测量脑梗塞体积

评估后神经赤字再灌注后24 h时,老鼠牺牲在麻醉下,和部分他们的大脑得到2.0毫米片()。大脑切片被孵化解决氯化三苯基四氮唑(TTC), 20 g / L) 30分钟37°C,然后转移到多聚甲醛溶液(40 g / L)修复梗死的面积。梗塞区域呈现白色或淡的颜色,而“正常”的组织显示为红色(13,27,28]。大脑的图像片都用数码相机连接到计算机系统。梗塞的面积/体积与ACT-2U软件由计算机辅助图像分析系统(尼康)。相对梗塞比计算使用以下方程(24]:(2 *左半球区域(non-ischemic)−noninfarct面积全脑片)/(2 *左半球区域)* 100%。这个方程不包括的因素可能导致的不准确计算梗死体积(如水肿)。

2.7。数据分析

脑血流量测定作为衡量聚氨酯,在CMBC和速度。所有的值在每个动物比较MCAO前基线值测量。分组值比较不同组。神经赤字进行评估和表达为年级每组的平均价值。脑梗死体积表示为一个百分比的整个大脑。

所有数据提出了平均数±标准差,进行统计分析。死亡的比率比较采用卡方检验。所有其他数据进行方差分析(方差分析),t以及,Rank-Sum测试,和/或卡方检验。这些变化被认为是重要的如果值小于0.05。

3所示。结果

3.1。EA预防缺血性损伤随不同的穴位

缺血组(MCAO只有,),17%(10/60)的老鼠死于60分钟MCAO后不到24小时。在再灌注后24小时,其余大鼠显示严重神经赤字(年级,)与脑梗死体积大约三分之一的整个大脑的体积(32.9%±3.8%,)(表1,图1(一))。梗塞地区广泛分布的右额-顶叶皮层和纹状体。缺血性一边很肿。

在组缺血+ EA Du 20, Du 26 (),7%(2/30)大鼠MCAO后2 - 10小时内死亡的对缺血)。在再灌注后24小时,剩下的小鼠表现出明显改善神经赤字相比仅缺血组(等级,,对缺血)与更大的减少梗塞体积,主要局限于右侧纹状体(,,与缺血)(表1和图1 (b))。

李在EA组缺血+左11和PC 6 (),8%(2/24)大鼠MCAO后2 - 10小时内死亡的对缺血)。在再灌注后24小时,其余大鼠显示显著减弱神经赤字(年级,,与缺血),梗死体积大大减少(,,与缺血)(表1和图1 (c))。

在组缺血+ EA对李11和PC 6 (),20%(5/24)大鼠MCAO后2 - 20小时内死亡的对缺血)。在再灌注后24小时,其余大鼠显示严重神经赤字(年级,,对缺血)与脑梗死体积大约三分之一的整个大脑(,,与缺血)(表1和图1 (d))。

在EA组缺血+左SP 6和GB 34 (),13%(3/24)大鼠MCAO后2 - 10小时内死亡(对缺血)。在再灌注后24小时,其余大鼠显示严重神经赤字(年级,,对缺血)与脑梗死体积大约三分之一的全脑(29.8%±4.5%,,与缺血)(表1和图1 (e))。

3.2。EA-Induced脑血流量的变化随不同的穴位

考虑到血流量不足导致脑缺血性损伤,我们想知道如果EA对脑缺血神经保护是通过监管呈现缺血性脑的血液供应和本条例是否改变了不同穴位刺激。使用激光多普勒灌注监视器,我们监控实时脑血流量的变化在所有实验小组。

首先,我们测试了如果短暂刺激这些穴位改变在脑缺血大鼠血液流动(,重复每一对穴位≥6倍)。EA 5/20 Hz sparse-dense电流1.0 mA的方式交付给穴位刺激5分钟/ 5分钟停止。当一个尼龙缝线成功插入到适当的地方右大脑中动脉,监控皮层的血液灌注减少立即从平均水平聚氨酯,聚氨酯,~ 85%下降血液供应和减少在CMBC ~ 80%和相对轻微减速的血细胞速度~ 25% ()(数据2(一个),2 (b)(1)2 (c))。EA刺激Du 20和杜26立即引起血流量显著增加。血液灌注的增加同步EA。血流量的变化,EA诱导2倍增加聚氨酯(~ 15% ~ 32%的基础水平MCAO之前,)在CMBC三倍增加(~ 20% ~ 65%的基础水平,)和一个轻微的下降速度(~ 75% ~ 50%的基值,)(数据2(一个),2 (b) ,2 (c))。同样,EA李左11和PC 6还显著增加血流后立即EA的发病,在EA刺激,PU增加近2倍(~ 15% ~ 29%的基值,)在CMBC显著增加三倍(~ 20% ~ 60%的基础水平,)和一个轻微的下降速度(~ 75% ~ 50%的基础水平,)(数据2(一个),2 (b)(3)2 (c))。与此形成鲜明对比的是,EA对李11和PC 6(数字2(一个),2 (b) ,2 (c))和左SP 6和GB 34(数字2(一个),2 (b)(5)2 (c))没有引起任何显著变化在EA血液流动,尽管使用相同的参数。

根据这些最初的观察,我们系统地研究了血液流动的变化从时间MCAO再灌注的早期阶段。具体来说,录音开始MCAO,继续前5分钟到15分钟后再灌注(缝合撤军)。EA开始5分钟后MCAO 30分钟的时间用相同的刺激参数,即5/20 Hz sparse-dense脉冲在1.0 mA组(数字3- - - - - -6)。然后,我们比较了不同的脑血流量在pre-MCAO级别,并在MCAO /没有EA在不同组。

缺血组(MCAO 60分钟,),立即~ 85%监控皮层的血液灌注减少。血流量保持不变在这低水平MCAO的整个持续时间。在CMBC也减少了~ 20%的基线水平(MCAO)前的水平,而血细胞速度降低了75%的基线数据3(一个)和4- - - - - -6)。

在组缺血+ EA Du 20, Du 26 (),EA显著增加血液流动的发病后立即刺激血液灌注的增长是同步的EA的应用程序。EA-induced血液流动的变化引起的患病率增加聚氨酯在缺血性级别(在CMBC增加了3折(),),速度稍微下降了~ 33% ()(数据3 (b),4(一),5(一个),6(一))。立即停止刺激,血流量降低MCAO水平。

李在EA组缺血+左11和PC 6 (),EA血流量显著增加区域后立即应用程序。具体来说,PU增加了2倍/缺血性(MACO)级(在CMBC显著增加了3折(),),而速度略微降低了MCAO > 30%的水平()(数据3 (c),4 (b),5 (b),6 (b))。刺激停止,血液流动迅速回到MCAO的水平。

在前一组形成鲜明对比,EA对李11和PC 6 ()没有产生任何重大改变血液流动在MCAO(数字3 (d),4 (c),5 (c),6 (c))。也是如此的EA左边SP 6和GB 34 ()。在这个群,EA也并未显著改变血液流动在第一个10 - 15分钟。然而,在EA的后期,在CMBC略微下降速度逐渐增加,虽然,PU的价值没有显著变化(数据3 (e),4 (d),5 (d),6 (d))。

3.3。恢复血流再灌注期间的变化在不同组

缺血组,尼龙缝线拆除后点MCAO, PU略微增加到25%的控制(pre-MCAO)水平(在CMBC增加到与MCAO)和控制水平的~ 55% (对MCAO)。然而,血液细胞的速度进一步降低过渡从缺血再灌注期间,也就是说,从75%到50%的控制(pre-MCAO)水平(对MCAO)在第一个15分钟后血液再灌注。这些结果表明在MCAO常数低灌注,即使再灌注,这主要是由于移动血细胞减少(在CMBC) MCAO再灌注期间或血细胞减少速度(数字3(一个)和4- - - - - -6)。

在组缺血+ EA Du 20, Du 26(数字3 (b),4(一),5(一个),6(一))和组缺血+ EA李左11和PC 6(数字3 (c),4 (b),5 (b),6 (b))、脑血流量(PU、在CMBC和速度)逐渐增加到再灌注期间控制(pre-MCAO)。

李组缺血+ EA右侧11和PC 6演示了一个类似的血流再灌注期间看到的变化仅在缺血组(数字3 (d),4 (c),5 (c),6 (c))。左边的EA组缺血+ SP 6 GB 34(数字3 (e),4 (d),5 (d),6 (d)PU)变化和在CMBC可比期间仅缺血组再灌注的开始。然而,复苏速度快仅在这组与缺血组。在这个EA组,血液灌注在很大程度上改善从大约10 - 15分钟后灌注。

3.4。EA没有明显的Non-Ischemic脑对脑血流量的影响

EA以来一些穴位,像杜杜20到26日,李11和PC 6,缺血性脑血流量显著增加,我们进一步问到这个反应是特定于缺血性EA刺激大脑或一般的反应。研究这个问题,我们应用EA 1.0 mA 5/20 Hz sparse-dense脉冲相同的穴位与控制老鼠和测量脑血流量的变化()。有趣的是,我们发现没有明显的EA对脑血流量的影响在EA non-ischemic动物尽管使用相同的参数用于脑缺血大鼠(图7)。这些观察表明,EA的应用在特定的穴位血流增加缺血性但不是non-ischemic大脑。

4所示。讨论

这个研究首次系统地比较EA的影响在不同穴位对脑血流量和脑缺血性损伤。我们的全面的数据明确显示,EA Du 20和杜26诱导最大保护脑缺血而不是肢体穴位。侧的刺激(缺血性一侧)穴位(李11和PC 6)在左前肢也诱发脑缺血性损伤防护,而相同的穴位的刺激同侧前肢和后肢的侧穴位(SP 6 GB 34)没有这样的效果。

在这项工作中,我们使用优化参数,即5/20 Hz parse-dense波1.0 mA,带来最优的EA刺激刺激基于我们之前的系统研究[9,13]。因为我们这些参数用于所有穴位在相同的实验条件下,实验组结果中观察到的差异可以归因于特定EA在这些穴位的影响。因此,重要的是要选择特定穴位治疗缺氧/缺血性脑病,如中风。我们的观察可以提供一个有用的资源,为针灸治疗中风的标准化应用程序在临床的设置。

由于缺血性损伤的主要原因是大脑血液供应不足,血液流动的任何变化都可能极大地影响脑损伤的程度。我们的结果表明,在所有“EA有效”的团体,EA缺血性脑血流量显著增加,从而衰减的影响大脑的缺氧/缺血性环境。这进一步表明EA-induced保护的关键依赖在改善脑血流量。

血流量的增加开始爆发后不久,消失后几乎立即停止EA。因此,快速而且机制构成了这一行动,很可能涉及神经系统。在EA刺激,针灸针显示周围的肌肉轻微收缩的EA的节奏。可能电流直接拉伸身体组织和影响血管,从而导致增加血液流动。然而,事实我们注意到在这个研究并不支持这种可能性。例如,EA在李11和PC 6,身体上的穴位接近缺血区域(大脑的右侧),不增加血流量或保护大脑。与此形成鲜明对比的是,EA李左11和PC 6侧到缺血性和相对远离缺血区域,引起血流量显著增加,更好的保护大脑免受缺血性损伤。这个观察提供了进一步的证据支持EA来自周围神经信号的生成和传输侧大脑调节神经递质释放和神经功能,进而调节各种生理现象(19- - - - - -22]。完全,EA-induced增加血液流动很可能基于neural-controlled监管。然而,EA的信号的精确机制移植缺血性脑血液流动在这个阶段是未知的,需要进一步的研究。

有趣的是,我们没有注意到任何non-ischemic大脑的血流量明显增加,当动物被EA相同的刺激参数。这表明,脑血流量随的EA-induced监管的条件/身体器官。在正常情况下,EA信号可能不改变血液流向大脑,因为它是不必要的。压力像缺氧/缺血,然而,同样的EA信号赠款大脑缺氧/缺血性微环境的适应能力,增加局部血液灌注。因此,该EA-mediated upregulation脑血流量可以是一个有用的策略不仅对缺血性中风,而且对脑血管痉挛和其他类似的疾病。

总之,我们的工作显然表明穴位的特异性EA保护脑缺血和表明穴位的头部或侧前肢是有效治疗中风。刺激这些穴位通过优化EA参数生成一个信号到大脑,导致脑血流量的增加和救助的大脑缺血性损伤。虽然底层机制需要进一步的研究,EA-induced upregulation脑血流量是一个有效的策略与多种神经疾病的临床应用潜力。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金委(30672721,30873318),NBRP (2009 cb522901和2012 cb518502), STCSM (10 dz1975800), NIH(- 004422和hd - 034852)和维维安·l·史密斯的神经基础。