文摘
强力生天马杜仲胶囊(TMDZ),中药药物,在临床上用于改善功能结果缺血性中风患者在中国。这研究是建立缺血后是否进行长期治疗TMDZ可以减少受伤的半球和带来的损失的改进神经结果在慢性2 h的老鼠生存的大脑中动脉阻塞(MCAO) /再灌注脑损伤和它的主要机制。我们发现TMDZ(44.5, 89,或178毫克/公斤),管理/操作系统缺血的发病后6 h和连续28天,显著提高赤字,行为开始7天,然后进一步提高。TMDZ治疗也明显减少了受伤的半球的组织损失和提高组织病理学。与此同时,TMDZ治疗可以改善血液流变学和抑制血小板聚集。这些结果提供了第一个证据,post-ischemic长期治疗TMDZ赋予神经结果的改进和受伤的半球在缺血性中风的动物模型中,和其机制可能与改善血液流变学和血小板聚集的抑制作用。
1。介绍
脑缺血和中风,死亡和长期残疾的主要原因之一,在年龄的人群,往往导致不可逆的脑损伤和随后的神经功能丧失。中风的常用药物可分为四组:溶栓药物,抗血小板药物、抗凝血剂,神经保护代理(1]。唯一批准中风药物、组织纤溶酶原激活物,是一个目标血管中的血栓的溶栓。神经保护药物,这可能会让大脑更耐损伤从中风,产生多的兴趣中风治疗的另一种方法。然而,迄今为止,神经保护药物还没有达到常规临床使用和保持不到理想(2]。
近年来,已经受到了人们足够的重视传统草药(3- - - - - -7]。强力生天马杜仲胶囊(TMDZ)主要包括传统的草药,天马和杜仲。从传统医学的角度,TMDZ的功能是促进血液循环,消除血瘀,放松肌肉疼痛和被用于缺血性中风的治疗在中国。到目前为止,临床研究已经证实的有益影响TMDZ在中风患者的功能恢复。然而,功能恢复的细节包括解剖和组织学恢复如何变化的特征与TMDZ脑缺血后受到了治疗,及其机制主要是在文献中缺席。在这里,我们表明,缺血管理4周后,TMDZ可以减少大脑半球受损的损失和改善组织病理学和神经系统的结果,和其机制可能与改善血液流变学及血小板聚集的抑制大鼠2 h MCAO再灌注模型。
2。材料和方法
2.1。动物和治疗
雄性SD雄性大鼠(SD)中(280 - 310 g)从实验动物中心购买,东吴大学(证书号20020008,二级),他们被安置四个每笼在一个标准的动物房间12 h光/暗周期和免费的食物和水。国家卫生研究院实验室动物保健和使用指南遵从所有动物程序。
强力生天马杜仲胶囊(TMDZ)是由ChunKe贵阳医药研发有限公司有限公司TMDZ 44.5, 89,或178毫克/公斤(indistilled水中溶解)或车辆(蒸馏水)是管理/操作系统6 h后缺血和缺血后连续28天。Sham-operated或ischemic-reperfusion (IR)控制动物收到车辆(蒸馏水)操作系统。
2.2。大鼠大脑中动脉闭塞2 h模型(MCAO)和再灌注
大鼠(/组)与4%的腹腔内注射麻醉合唱水合物(350毫克/公斤)。通过下腹正中切口,右颈总动脉(CCA),颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)被孤立,和ECA CCA的结扎。30毫米长度的单丝尼龙缝线(Φ0.22 - 0.24毫米),提示集中加热附近的火焰,从右边插入CCA通过小切口ICA的颈总动脉,然后先进到动脉环封闭右侧大脑中动脉的起源了2小时,然后缝合被撤回。体温是密切监测直肠探头和维护在37.0±0.5°C和加热垫(生物医学工程研究所、凸轮bme - 412 a动物监管机构,308005669)从麻醉手术期间及之后,直到复苏。Sham-operated老鼠接受了相同的程序除了削减一个小切口,插入一个单丝尼龙缝线的动脉。行为测试是评估在中风和2 h缺血和4 h, 1、3、7、14、21、28天再灌注。每周体重测量。脑损伤的观察,动物被杀,和大脑解剖和切片在塑料模块(哈佛装置,3毫米厚度)缺血后28天。形态学分析、动物牺牲了缺血后28天(/组)transcardial生理盐水灌注0.9%,其次是4%多聚甲醛在100毫米磷酸盐缓冲剂。大脑被固定的,嵌入式和石蜡。大脑日冕部分的尾状核显示典型的梗死选择和切割到10μ米,然后大脑日冕部分沾hematoxylin-eosin(他)。的金字塔的皮层细胞用显微镜检查。量化的细胞,10微观领域(放大20 x)在每个部分缺血侧大脑半球皮质地区进行了分析。三个部分被用于每个动物。细胞的数量在每个字段被一位失明的考官统计实验条件(8]。
2.3。行为测试
神经赤字检查2 h缺血和再灌注4小时时使用潜油电泵规模调整和修改从Zhang et al。9]。具体来说,没有神经赤字= 0;霍纳氏综合征计数1点;未能延长左前肢和后肢计数1点每一个;转向左数1点;和绕到左1点。
2.4。不对称前肢的使用姿势支持(缸测试)
缸测试进行了1、3、7、14、21日和缺血再灌注后28天。简单地说,动物被置于一个树脂玻璃圆柱,并观察他们的行为前肢使用不对称在沿墙垂直运动的气缸。还计算出最后得分(nonimpaired前肢运动−受损的前肢运动)/ (nonimpaired前肢运动+受损的前肢运动+运动),正如前面所描述的大鼠(10]。总共有20个动作记录在10分钟测试。
2.5。Asymmetry-Corner测试
角落测试进行了1、3、7、14、21日和缺血再灌注后28天。简而言之,在家里笼子里,动物被两个角度之间的董事会。当进入深入到角落时,双方的鼻毛刺激在一起。然后动物饲养向前和向上然后转回脸开口。20为每个老鼠试验进行,左和右转的百分比与计算。只有把涉及饲养在要么董事会记录(11,12]。
2.6。磁共振影像(MRI)分析病变的大小
老鼠与异氟烷麻醉,被安置在一个动物持有人/核磁共振探测装置,并放置在磁铁。动物的头在成像线圈内的地方举行。使用7 Teslar MRI测量都是执行,18厘米的孔超导磁体(牛津磁铁技术)界面的UNITYINOVA控制台(英国牛津仪器和瓦里安公司,帕洛阿尔托,CA,美国)。T2三图片(T2WI)从1.0毫米厚日冕部分获得了0.5毫米的差距使用30毫米×30 mm的视野,TR = 3000毫秒,TE = 37女士,和b值= 0和重新使用图像矩阵。大脑执行中心的精确定位图像片5毫米后的鼻腔的裂头鼠在平坦的颅骨的位置。对于每个块,高强度损伤T2WI被标记为缺血性病变区域(13]。核磁共振测量得到MCAO后28天(为每个组)。
2.7。测定血液流变学
血液样本被从大鼠的腹主动脉和李与肝素混合血粘度和血浆粘度、3.2%柠檬酸对光纤光栅,EDTAK2HCT、ESR和3.2%柠檬酸钠。血液粘度测量椎-粘度计(马斯托顿,布鲁克菲尔德工程实验室、公司、美国)。血浆粘度(PV)离心机在3000 rpm 15分钟离心获得等离子体。血浆粘度测定的自动血液流变仪LBY-N6B(北京Precil仪器有限公司、北京、中国)。纤维蛋白原(Fb) heamatocrit (HCT)和红细胞沉降率(ESR)发现了一个激光辅助自动行分析仪(修改MDK-B100, MDK有限公司、重庆、中国)。所有测量在4°C。
2.8。血小板聚集
大鼠血小板悬浮液准备如前所述[14]。总之,血液收集从老鼠有或没有中风了TMDZ为4周,并与3.2%柠檬酸混合ADP或EDTA K2凝血酶。富含血小板血浆(PRP)是由在500转离心3分钟在室温下,和ADP引起的血小板聚集(4μ摩尔/毫升,Solarbio)是使用一个集合度计测量(tyxn - 96,上海通用机电力技术研究所,上海,中国。凝血酶,PRP在1500转离心5分钟,和由此产生的血小板颗粒resuspended洗涤缓冲(氯化钠140毫米,氯化钾2.7毫米,不2阿宝4 2 h20.4毫米,NaHCO312毫米,MgCl2 6小时21毫米,葡萄糖5毫米,消息灵通的10毫米,PGE1 100海里,BSA 3.5毫克/毫升,pH值6.6),然后在1000转离心5分钟。血小板是resuspended暂停缓冲(氯化钠140毫米,氯化钾2.7毫米,不2阿宝4 2 h20.4毫米,NaHCO312毫米,MgCl2 6小时21毫米,葡萄糖5毫米,消息灵通的10毫米,和BSA 3.5毫克/毫升,pH值7.4),凝血酶诱导的血小板聚集(3 U / mL,σ)测量。
2.9。统计分析
统计分析是由单向方差分析(方差分析),后跟一个事后图基测试。差异被认为是重要的时候。
3所示。结果
3.1。强力生天马杜仲胶囊(TMDZ)增加体重
相比缺血再灌注大鼠的控制(红外控制),TMDZ治疗明显增加体重从7天(第二周),坚持在四周的生存期(图1)。
3.2。TMDZ大脑减少损失和损伤的大小
减少错误处理组织进行组织学分析,剩余的大脑体积的百分比作为侧(右)半球体积的侧(左)半球体积(间接体积计算)。残脑容量(集成右半球卷)四周中风后减少而sham-operated半球或侧半球缺血再灌注控制和TMDZ-treated组。然而,相比之下,残留在缺血再灌注脑容量控制老鼠,TMDZ连续治疗后显著增加残脑容量管理(图4周2)。与这些结果一致,他染色分析还发现,缺血再灌注控制老鼠显示ipsilateral-hemisphere组织损失和广泛的囊性坏死区。相比之下,老鼠接受TMDZ表明广泛的皮质和皮质下的损伤更少(图3)。治疗TMDZ显著增加皮质细胞相比vehicle-treated老鼠(图3)。
(一)
(b)
(一)
(b)
(c)
(d)
此外,缺血性病变大小估计使用体内磁共振成像。T2威斯康星州得到TMDZ或车辆连续治疗后28天。日冕前脑部分得到的caudate-putamen复杂(图4)。病变大小(高强度地区)在大鼠缺血再灌注控制相比TMDZ-treated(图4)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
这些结果表明post-ischemic长期治疗TMDZ减少中风后大脑损伤和脑组织损失。
3.3。TMDZ提高神经系统的结果
神经系统评分是正常的在所有动物MCAO(得分,0)高档侧赤字(得分,2 - 5,表1)提出了再灌注2 h MCAO和4小时时在所有的老鼠,和各组之间没有显著差异(表1)。TMDZ连续治疗7天后,老鼠TMDZ组显示功能恢复比大鼠缺血再灌注组和授予一个额外的三星期的生存期间进一步改善随着时间的推移在角落里测试(图5(一个)(图)和缸测试5 (b))。没有不良行为与TMDZ政府观察到的副作用。这些结果表明,post-ischemic长期治疗以TMDZ改善卒中后神经系统的结果。
(一)
(b)
3.4。TMDZ改善血液流变学
TMDZ后的血液流变学参数没有改变任何正常的老鼠与TMDZ管理(表4周2)。中风在老鼠,4周后,全血粘度(WBV)的低剪切速率、剪切速率适中,和高剪切速率,降低全血粘度(WBRV)的低剪切速率、剪切速率适中,高剪切率、纤维蛋白原(Fb)高得多的比sham-operated老鼠(表3)。相比之下,显著降低WBV TMDZ治疗4周,WBRV, Fb(表3)。此外,中风引起的血浆粘度(PV)的增加,heamatocrit (HCT),红细胞沉降率(ESR)、红细胞沉降率方程K值(ESRK),红细胞聚集指数(RBCAI)和红细胞刚性指数(RBCRI),但这些参数没有达到统计上的显著水平。然而,TMDZ明显降低中风诱导增加光伏、HCT, RBCAI和RBCRI(表3)。没有明显差异的红细胞变形指数(RBCDI)和红细胞电泳指数(RBCEI)在所有组(表3)。
3.5。TMDZ抑制血小板聚集
TMDZ显著降低体外ADP或thrombin-induced血小板聚集与TMDZ正常老鼠管理后4周(图6)。此外,体外ADP或thrombin-induced控制缺血再灌注大鼠血小板聚集是显著增加,TMDZ治疗4周显著降低血小板聚集(图ischemia-reperfusion-induced增加7)。这些结果表明,TMDZ有很强的抑制血小板聚集的影响。
4所示。讨论
缺血缺氧脑损伤常常引起不可逆的脑损伤和永久行为表现赤字。控制动物模型大鼠MCAO的产生一致的皮层和皮层下梗死,相似的大型半球梗塞造成近端MCAO的病人(15]。迄今发表的大多数研究都集中在这一事实在大脑受损的组织病理学变化发生在急性缺血性中风,和最近,也一直在注意受损大脑的组织病理学变化发生在亚急性和远程缺血性中风。已经证明了半球水肿会发生在急性缺血性中风,而脑组织损失和萎缩将发生在亚急性和远程的缺血性脑缺血性中风和半球在很大程度上减少了受伤的体积比侧半球[16,17),在我们目前的研究也证实了卒中后4周2 h MCAO大鼠模型和再灌注。评估神经行为和组织学方法,这项研究表明连续口服强力生天马杜仲胶囊(TMDZ)治疗脑梗塞后4周的结果减少脑组织的缺血性病变大小估计损失和从大脑切片测量和核磁共振分析,增加体重,从他和改善行为表现和组织病理学分析。
目前,TMDZ不是非凡的效果很大程度上理解。血液粘度升高值已经证明在病人急性脑缺血后(中风的发病后24 h)和远程脑缺血性发作(3 - 6个月后中风)虽然有一些差异在急性脑缺血患者和患者之间行参数与远程脑缺血性发作(18,19]。之一,因此,临床药物治疗在缺血性中风患者修改hemorrheological属性,导致血液粘度降低,从而导致更好的大脑灌注和促进卒中后功能的恢复赤字。符合文学的作品(18,19),在目前的研究中,我们还证实显著增加的全血粘度(WBV)低剪切速率、剪切速率适中,高剪切率和全血粘度(WBRV)的低剪切率降低,中等剪切速率和高剪切速率中风后4周2 h MCAO大鼠模型和再灌注。血液粘度取决于许多因素。最重要的是血细胞比容,血浆粘度,红细胞及其弹性aggregability [18]。增加血液粘度在当前的研究中可能导致中风诱导一些倾向更高的价值在血细胞比容,血浆粘度和红细胞的aggregability(统计上不显著),和低价值的弹性红细胞(统计上不显著)。TMDZ治疗卒中后4周显著降低WBV和WBRV也同时降低血浆粘度(PV)、heamatocrit (HCT),红细胞聚集指数(RBCAI)和红细胞刚性指数(RBCRI),这可能导致这一事实TMDZ诱导血液粘度下降。此外,我们发现中风诱导高纤维蛋白原水平,这是符合病人的观察Velcheva和Nikolova19],TMDZ减少它。
的级联事件导致缺血神经元损伤和死亡包括细胞因子的释放、自由基和血小板激活(20.,21]。的参与激活血小板一直观察缺血性脑微血管的微血管床实验后大脑中动脉阻塞(MCAO) [21]。微血管血栓继续积累甚至MCAO再通后,导致缺血后低灌注和持续的神经损伤(22]。因此,血小板聚集可能在MCAO-induced脑损伤起到至关重要的作用。在目前的研究中,我们表明,血小板聚集在缺血性卒中后大鼠4周显著增加使用体外ADP或thrombin-induced血小板聚集和TMDZ治疗4周显著降低血小板聚集ischemia-induced增加。此外,TMDZ也显著降低血小板聚集与TMDZ正常老鼠管理后4周。
总之,目前的结果首先建立post-ischemic长期治疗TMDZ赋予神经结果的改进和受伤的半球在动物缺血性中风模型,及其机制可能与血液流变学的改善和抑制血小板聚集。这些结果是非常令人鼓舞的广泛应用TMDZ缺血性中风患者。是否post-ischemic长期治疗TMDZ产生本次治疗缺血性中风在不久的将来仍有待进一步调查。
作者的贡献
李志香港和萎萎顾了同样的工作。
确认
这项工作是支持由中国国家自然科学基金(30973510和30973510),科研基础归侨学者、国家教育部,资助的一个项目优先级的学术程序开发江苏高等教育机构(PAPD)。