文摘

本研究的目的是检查效果的精油Citrus bergamiaRisso(佛手柑,同天)在细胞内Ca^{2 +}在人类脐静脉内皮细胞。Fura-2荧光被用来研究细胞内钙的变化^{2 +}浓度。在细胞外钙的存在^{2 +},同天增加,这是部分由一个非选择性抑制Ca^{2 +}通道阻滞剂拉^{3 +}。在Ca^{2 +}无细胞外的解决方案,成为增加浓度的方式,表明成为细胞内钙动员^{2 +}。BEO-induced增加部分抑制了Ca^{2 +}全身的Ca^{2 +}磷脂酶C抑制剂U73122释放抑制剂丹曲林,和肌醇1,4,5-triphosphate (IP₃)封闭的Ca^{2 +}通道阻断剂,2-aminoethoxydiphenyl硼烷(2-APB)。同也增加了在羰基氰化物法的存在,抑制线粒体钙的人^{2 +}吸收。此外,门店Ca^{2 +}条目(SOC)被成为强。这些结果表明,成为动员Ca^{2 +}从初级胞内商店通过Ca^{2 +}全身和IP3-mediated Ca^{2 +}释放,影响推广的Ca^{2 +}涌入,可能通过一个SOC机制。

1。介绍

佛手柑精油(同是来自佛手柑(Citrus bergamiaRisso)约梨形柑橘类的水果。成为被广泛用于芳香疗法缓解压力的症状,轻微的情绪障碍,和癌症疼痛1和它有抗焦虑药2)、镇痛(1,3,4在啮齿动物)的影响。

bergamottin,除了这些影响成为非易失性的一部分成为隔绝,显著减少了典型心电图描记的冠状动脉痉挛的迹象,收缩的力量和心律失常的发生率加压素诱导的豚鼠(5]。鉴于潜在的角色bergamottine心血管功能,感兴趣的知道的角色成为在Ca^{2 +}在内皮细胞动员。Vasorelaxant效果成为可能涉及Ca^{2 +}动员从细胞内的商店和/或在内皮细胞从细胞外池。几项研究表明内皮细胞和平滑肌放松之间的关系已经被报道。我们之前的研究涉及,胞质钙的变化^{2 +}水平在刺激内皮细胞是一个基本机制,内皮细胞调节血管舒缩活动(6]。另一份报告间接支持这一观点,证明vasorelaxant效果的精油罗勒属gratissimum在一定程度上依赖于血管内皮的完整性(7]。

到目前为止,同天的影响在内皮细胞和机制成为调节细胞内Ca^{2 +}浓度()不显示。在目前的研究中,我们调查细胞内Ca^{2 +}调节特性成为在内皮细胞和现在的证据表明,同天增加通过细胞内钙释放^{2 +}商店和通过门店Ca^{2 +}条目(SOC)。

2。材料和方法

2.1。人的血管内皮细胞培养

人类endothelium-derived细胞系EA.hy926从美国购买类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)8]。EA细胞生长在杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)含20%胎牛血清(hypoxanthine-aminopterin-thymidine 50的边后卫)和10%(生命技术)的补充。细胞培养是维持在37°C充分湿润95%空气5%股份有限公司₂的气氛。媒体被拆除,代之以新的媒介三次一个星期。细胞被暴露在分离胰蛋白酶,受移植者在gelatin-coated盖玻片,在文化和维护2到4天前使用。测量进行subconfluent细胞。

2.2。细胞生存能力分析

溴化噻唑基蓝四唑(MTT)分析是用来确定成为细胞生存能力的影响。EA细胞培养使用DMEM和100% (v / v)的边后卫(Gibco表达载体),青霉素100单位/毫升,100年μg / mL链霉素(Gibco英杰公司)和MEM不必要的氨基酸(英杰公司)在96 -孔板(Nunclon、丹麦)48小时直到融合已经达到80 - 90%。同的影响,评价细胞与不同浓度为15分钟(0.001,0.005,0.01,0.05,或0.1% (v / v在DMSO))的同天,0.25% DMSO溶液。然后用新鲜细胞被洗PBS无血清培养系统,取而代之的是媒体。此外,细胞含有10μL MTT(5毫克/毫升)和孵化37°C 3 h。麻省理工的解决方案被删除,取而代之的是100年μL DMSO在黑暗的地方2 h。颜色的变化是使用板读者阅读540海里。

2.3。Ca^{2 +}测量

细胞被装满fura-2点,使用测微荧光计测量系统组成的一个倒置显微镜(IX71、奥林巴斯、日本)和PTI过滤器扫描电力照明系统(光子技术国际)。Fura-2点(2μ米)添加到浴和细胞孵化25分钟37°C。这些细胞被照亮或者通过直升机在380纳米波长的340和轮(频率= 50赫兹)。在510纳米荧光测定,自发荧光从信号减去。Ca^{2 +}无浓度计算的比例在每个激发波长发出的荧光信号。校准过程是与前面描述的相同9]。

2.4。解决方案和化学物质

外部解决方案包含以下(毫米):150氯化钠,氯化钾,1.5 CaCl₂1 MgCl₂,10玫瑰,10葡萄糖;与氢氧化钠pH值调整到7.4。Ca^{2 +}无解决方案包含5毫米EGTA Ca^{2 +}。这种解决方案的渗透性,衡量蒸汽压渗压计(美国菲斯克),是320±5 mOsm。ATP, 2-aminoethoxydiphenyl硼烷(2-APB), 2, 5-di-t-butyl-1, 4-benzohydroquinone (BHQ)、羰基氰化物法(CCCP),丹曲林,U73122,从σ和MTT购买;Fura-2我是从分子探针获得的。BHQ U73122,精油(0.001%,0.005%,0.01%,0.05%,0.1%,或0.2% v / v)从股票的解决方案被应用在二甲亚砜(DMSO)。最后DMSO溶液的浓度小于1%。从股票的解决方案在乙醇2-APB应用。最后DMSO溶液和乙醇的浓度低于0.05%。同天(生产批号。110824)从Aromarant有限公司购买,Rottingen,德国,来自在意大利当地栽培植物。

2.5。统计分析

汇集数据提出了意味着±sem和显著差异是决定使用配对t以及或方差分析其次是矫正的因果分析。的值被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。细胞生存能力

MTT分析是用来确定探索成为在EA细胞的浓度变化的影响。每个细胞治疗与媒体(控制),DMSO(车辆,0.25% (v / v)),或成为(0.001%、0.005%、0.01%、0.05%或0.1% (v / v在DMSO)) 15分钟(图1)。组之间的差异进行了分析使用方差分析其次是矫正的因果分析。没有显著的影响在所有可行的细胞的百分比浓度的同天在EA细胞(,)。

3.2。海拔同天在人类血管内皮细胞

同天增加在EA细胞浓度的方式(图2(一个))。动员的Ca的量效关系^{2 +}从细胞内商店成为总结在图2 (b)。成为非线性相关的浓度的增加揭示了拟合希尔方程类型剂量反应曲线。半极大增加(EC₅₀)获得了%。DMSO (0.25% v / v)本身并没有改变细胞内Ca^{2 +}的水平。细胞治疗成为后没有形态变化。然后我们调查了是否同天发生了变化在细胞外钙的存在^{2 +}在EA的细胞。应用同天增加来μ米,部分和可逆地抑制无选择性的Ca^{2 +}通道阻滞剂拉^{3 +}(1μ米)。减少到μM×拉^{3 +}(,,数据2 (c)和2 (d)),这表明成为诱发Ca^{2 +}从细胞外池和Ca涌入^{2 +}从细胞内释放商店。

3.3。Ca^{2 +}从内质网和线粒体释放Ca^{2 +}商店的同

我们接下来做了实验,确定这两个主要的动态细胞内Ca^{2 +}商店,即线粒体和内质网(ER),是影响成为在EA细胞。Ca^{2 +}释放ER取决于两种机制:Ca^{2 +}全身的Ca^{2 +}释放(CICR),涉及阿诺定受体,和IP₃全身的Ca^{2 +}释放(IICR),涉及肌醇1,4,5-triphosphate (IP₃)受体(10]。细胞内钙BEO-induced^{2 +}增加明显,可逆地抑制CICR抑制剂,丹曲洛林(,,图3(一个))。这些数据表明,成为提升通过Ca的释放^{2 +}从细胞内商店通过CICR机制。是否同天发布^{2 +}从细胞内钙^{2 +}通过IICR商店,我们测试的影响成为U73122面前,磷脂酶C (PLC)的特定抑制剂(11),抑制IP₃合成、2-APB membrane-permeable抑制剂的IP₃封闭的ER Ca^{2 +}渠道(12]。细胞内钙BEO-induced^{2 +}增加显著抑制U73122 (,,图3 (b))和2-APB (,,图3 (c))。这些数据表明,PLC-mediated合成的IP₃和IP₃绑定的IP₃封闭的Ca^{2 +}渠道的ER BEO-induced Ca^{2 +}从细胞内释放商店。

Ca的一部分^{2 +}从ER被直接线粒体释放,也会释放Ca^{2 +}从而调节。确定线粒体参与BEO-induced Ca的再摄取^{2 +}释放,我们检查同的影响在Ca^{2 +}无解的BHQ (SR / ER Ca^{2 +}腺苷三磷酸酶抑制剂)和挺(线粒体Ca^{2 +}吸收抑制剂)。在细胞治疗BHQ和/或挺,暂时性的慢慢增加,然后降低到稳定状态,表明SR / ER Ca^{2 +}腺苷三磷酸酶和线粒体钙^{2 +}吸收参与的规定在基础条件下(图4(一))。增加在EA细胞通过后续的应用成为BHQ和CCCP高于BHQ唯一的存在。在每个条件曲线下面积和分别任意单位。两个条件之间的差别任意单位,表明线粒体Ca^{2 +}商店的监管可能导致BEO-induced增加。

考虑到洛杉矶的抑制作用^{3 +}上面所提到的,建议Ca^{2 +}进口途径(s)(是)被成为激活。因此,我们下一个检查是否成为调制Ca^{2 +}输入通过一个SOC机制。暴露的EA细胞BHQ Ca^{2 +}感应瞬态增加无解决方案,然后慢慢减少稳态(图4(一))。再运用Ca的细胞外^{2 +}清空后细胞内Ca^{2 +}商店与BHQ增加引起的,表明SOC的激活机制。后成为应用SOC唤起时,SOC进一步增强,这表明同也激活Ca^{2 +}通过一个SOC通路(图涌入4 (b))。然而,使用这个协议仅在这个实验中并不排除其他途径可以激活成为钙条目。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们首先证明成为动员Ca^{2 +}在内皮细胞从细胞外和细胞内的来源。我们目前的结果还表明,成为细胞内钙增加^{2 +}通过细胞内钙动员水平^{2 +}商店、ER和线粒体和促进Ca^{2 +}流入,通过一个SOC机制。这些研究结果将提供洞察Ca的生理机制^{2 +}在内皮细胞暴露于成为监管。

有些精油含有光敏分子furocoumarins。例如,植物精油的Citrus bergamia含有补骨脂素结合DNA在紫外曝光生产mono -和biadducts细胞毒性和高诱变(13]。因此,本研究结果中观察到的可能结果的影响photoirritation同。然而,由于细胞内Ca^{2 +}水平迅速回到基线水平洗后成为和细胞生存能力是正常的剂量测试,我们认为光毒性的细胞内钙或细胞毒性效应小^{2 +}由同级别。此外,在体外研究表明,同天减少谷氨酸受体介导细胞死亡引起的n -甲基- d (14]。然而,进一步的研究是必要的评估成为在内皮细胞的光毒性的潜力。

同已报道降低血压在人类健康和扩张影响小鼠动脉(15,16]。在最近的研究中,柠檬烯,同天的主要组件之一(37.26%)、胞质钙增加^{2 +}直接激活腺苷浓度受体(17]。在内皮,腺苷受体在没有发布一个重要的角色。腺苷细胞内钙受体诱导一氧化氮血管舒张^{2 +}增加(18]。因此,我们建议的影响成为可能归因于柠檬烯的激活腺苷受体。

平滑肌的收缩和放松监管不仅胞质钙离子浓度的变化也被其他重要的信号传导机制,即独立的变化,被称为^{2 +}敏化(19]。虽然增加的通过激活启动平滑肌收缩肌球蛋白轻链激酶,Ca^{2 +}敏化介导平滑肌收缩,调节肌球蛋白轻链磷酸酶(20.]。的增加在内皮细胞在合成过程中发挥作用和释放血管活性的化合物如一氧化氮和前列腺素(21),从而改变Ca^{2 +}在平滑肌细胞致敏。据报道,乙酸芳樟酯,同天的主要组件之一,通过部分endothelium-dependent通路诱导的平滑肌松弛(22]。需要进一步的研究来揭示钙释放的机制成为行动的内皮细胞调节血管舒张作用。

总之,成为可以被认为是用于治疗之前vascular-related疾病,进一步的研究是必要的定义^{2 +}提升途径招募成为病理条件下。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

Purum Kang Ho Han, Seung和头脑Kyung月亮了同样的工作。

承认

这项工作是由韩国国家研究基金会(NRF)授予由韩国政府(最高明的)(2012 - 0004065,2012 - 007145)。