文摘

介绍。本研究旨在探讨影响的低水平激光疗法(低)在实验性变应性鼻炎(AR)模型诱导卵清蛋白。材料和方法。基于“增大化现实”技术在小鼠诱导1%卵清蛋白。24小鼠被分为4组:正常,控制,低,高剂量辐照。低和高剂量低强度辐射为7天每天一次。总IgE,细胞因子(il - 4和干扰素-浓度γ),胸腺和激活规范趋化因子(TARC)测量。组织学的变化由激光辐照检查鼻粘膜组织。结果。低强度显著地抑制总IgE, il - 4, TARC表达在低剂量辐照ovalbumin-induced老鼠。蛋白表达水平的il - 4在脾脏明显被抑制在低剂量辐照。EL-4细胞中il - 4的表达抑制以剂量依赖的方式。组织学损害上皮的鼻中隔与显著改善提高了激光辐照低剂量照射。结论。这些结果表明,低强度可能作为一种新的治疗工具治疗AR与更多的有效性在低剂量照射。确定最佳剂量的激光照射激光疗法,和行动机制需要进一步的研究。

1。介绍

变应性鼻炎(AR)是一种具有一个或多个下列鼻症状:拥堵、鼻液溢(前部和后部)、打喷嚏、和瘙痒1),据估计,在世界范围影响多达40%的人口(2]。目前,一些药理疗法如抗组胺药、糖皮质激素、减充血剂,肥大细胞稳定剂可用于AR患者(3];然而,基于“增大化现实”技术的症状并不总是令人满意地控制药物,和一些患者无法应对常规治疗(4]。

针灸是一种最受欢迎的补充和替代医学治疗和分类根据刺激材料或方法如金属针、激光刺激,或草药提取物(pharmacopuncture) [5]。AR,针灸治疗已通过临床试验显示了有益的影响。此外,EX-HN9 (內迎香)是作为一个主要的穴位的治疗(6]。然而,也有一些关于针灸治疗的有效性的争论在AR和一些限制应用针灸临床领域(例如,由于针疼痛疼痛或不适)。因此,另一种形态的针灸改善基于“增大化现实”技术的有效性和遵守治疗是必要的调查。

低水平激光疗法(低)一直是临床上用于帮助伤口愈合(7),减轻疼痛在肌肉骨骼疾病8,9),刺激穴位(10),其抗炎和免疫抑制效应已经在实验室检查(11- - - - - -13]。然而,很少有研究调查了在基于“增大化现实”技术的低强度的影响。

在目前的研究中,探讨激光针灸的基于“增大化现实”技术的影响,对卵清蛋白(OVA)诱发过敏性鼻炎模型使用。特别是,我们低水平激光照射到鼠标的鼻内腔重建激光针灸EX-HN9根据辐照的剂量。过敏性炎症的血清学参数包括IgE和细胞因子(il - 4和干扰素-γ),胸腺和激活规范趋化因子(TARC)的检查在体外Th2细胞中il - 4表达的检测。组织学检查也进行测量鼻内的变化对炎性细胞浸润上皮由低强度。

2。材料和方法

2.1。激光

激光设备由光州科学与技术研究院(韩国光州)有以下特点:低功率激光红外波长658 nm,铝镓磷化铟半导体(InGaAlP),纤维直径材料(核心/包层)的50/125μ米,30兆瓦的输出。麻醉和最大接触激光鼠标鼻孔,老鼠进行的低强度辐射总体包括EX-HN9鼻腔粘膜表面。激光辐照10毫米除了每个鼻孔鼠标垂直设置的激光设备。激光照射在当下研究的参数见表1。

表1
激光辐照参数参与这项研究。

2.2。Th2细胞培养和细胞生存能力

小鼠胸腺细胞淋巴瘤(EL-4)从KoreaCell行购买银行,首尔,韩国。EL-4细胞系培养rpmi - 1640中有额外的谷酰胺(4毫米),丙酮酸钠(1.0毫米),4.5 g L−1葡萄糖,青霉素(100 U /毫升),链霉素(100 U /毫升),10%胎牛血清v / v。EL-4细胞的分化,phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)和4-tert-Octylphenol (OP)(美国密苏里州Sigma-Aldrich)治疗的密度 细胞/。控制细胞孵化没有MPA或相机会轻轻刮收集的细胞(细胞刮刀)的培养基和离心机在300克,8分钟,上层的移除。细胞颗粒在冰冷的PBS洗两次,直接分析或储存在−80°C为rt - pcr进行进一步分析。最优PMA和OP浓度选择通过确定分化细胞的比例和他们的生存能力。激光辐照交付给培养板通过光纤从上面。激光束是剪板覆盖整个区域的使用上限。激光密度100 mJ (30 mW, 32 s), 500年乔丹(30 mW, 160年代),1000年乔丹(30 mW, 320年代),和2000年乔丹(30 mW, 640年代)。

2.3。动物和分组

所有实验进行了按照庆熙大学动物保健的指导方针。岁的雄性Balb / c小鼠,6周,体重18 - 20 g,被随机分为4组:正常组(卵子未经处理的,没有辐射, )、控制(只治疗卵巢, )、低剂量辐照(1000 mJ辐照, ),高剂量辐照(2000 mJ辐照, )。

2.4。ELISA试验

血清的卵子鼠标与全血分离收集的心脏穿刺和存储在血清IgE的冷藏器试验。最终的激光辐照后,脾脏组织被保存在coldlysis缓冲区(美国细胞信号,卡尔斯巴德,CA) il - 4,正-γ,TARCELISA化验。IgE, il - 4,正γ和TARCELISA工具包(研发系统,Inc .,明尼阿波利斯,美国)和细胞因子浓度使用评估根据制造商的细胞因子ELISA协议。

2.5。卵子敏感和具有挑战性

通过使用慢性接触过敏原接触协议,老鼠是敏化和挑战,如图1。短暂的6周前老鼠系统敏感,卵巢(10μ0.1 g / mL鸡蛋清蛋白、卵清蛋白V级,98%纯,σ,圣路易斯,密苏里州,美国)腹腔注射(i.p) 7天、14和21。暴露雾化卵子(10毫升10毫克卵子/毫升1%生理盐水)开始在第一个i.p。(图后28天1)。1000年这个AR模型,乔丹(30 mW, 320年代)和2000年乔丹(30 mW, 640年代)激光辐照对7天每天一次。

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(b)
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图1
(一)协议卵白蛋白致敏的(卵子)。敏化是由腹腔内注射的卵子天0,7、14、21。后1周后,小鼠卵子挑战气溶胶每天1周诱导当地敏感。第二天,激光辐照每日1周。正常组小鼠注射和挑战PBS代替卵子。(b)激光仪器用于鼻内照射。
2.6。免疫印迹

所有脾脏样本细胞溶解在冰冷的裂解缓冲包含Tris-HCl (pH值7.4)(20 mM), 1% Triton x - 100, 0.1% SDS、EDTA(2毫米),和phenylmethyl磺酰氟(PMSF)(1毫米)。蛋白质的数量在每个样本使用布拉德福德试验确定。样品受到10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)。蛋白质斑点electrotransferred polyvinylidenedifluoride (PVDF)膜。膜是孵化块缓冲区(PBS Tween-20包含0.05%和5% w / v脱脂奶粉)1 h,用PBS含有0.05% Tween-20 (PBST)三次,然后对il - 4抗体(1:1000稀释,细胞信号技术,美国)一夜之间在4°C。此外,墨迹探测的强度与1:1000稀释溶液的抗体β肌动蛋白(细胞信号技术,美国)是用作控制以确保固定数量的蛋白质被加载到每个车道的凝胶。膜被PBST 5分钟(3次),动摇的解决方案HRP-linked anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体(1:2000稀释)为2 h RT,又洗PBST 5分钟(3次)。增强化学发光蛋白质的表达进行检测(ECL)试剂(美国微孔,Billerica的)。

2.7。rt - pcr

第一链cDNA合成5μ克总RNA进行使用MMLV逆转录酶和oligodT底漆1 h 42°C。随后,pcr扩增最初是由一个修改方法描述Saiki et al。14]。首先,5μL (cDNA添加至2.5μL 10 x PCR缓冲,1μL (MgCl 25毫米2,1μL(2.5毫米核苷酸,0.5μL(聚合酶(1 U), 1μ每个引物(4 pmol) L, DEPC-H2O给最后一个25的体积μl . il - 4引物的序列如下:5′-TAGTTGTCATCCTGCTCTT-3′,底漆和5′-CTACGAGTAATCTTGC-3′反向引物。pcr产物1.5%琼脂糖凝胶上分离,用溴化乙锭数最大使用凝胶图像分析系统(CoreBioSystem,首尔,韩国),并分析了使用Alpha容易FC软件(AlphaInnotech公司,圣莱安德罗、钙、美国)。至少三个独立的实验结果用于统计分析。

2.8。苏木精和伊红染色(他)

组织学研究石蜡包埋组织部分(5μ米厚,日冕部分)被他染色法染色。二甲苯的部分是deparaffinized和水化,100年,95年,80年,70%的乙醇。的部分与苏木精overstained,通常3 - 5分钟,在去离子水冲洗掉多余的染色。然后他们在酸性酒精使退色几秒钟,直到部分呈红色,通常4 - 5下降,在去离子水冲洗短暂消除酸。苏木精染色幻灯片最后一个自来水冲洗,放置在70%乙醇为3分钟。幻灯片被安置在曙红2分钟和95年通过幻灯片和100%乙醇和二甲苯。染色后,幻灯片和加拿大香脂安装。

2.9。统计分析

所有定量数据来自本研究进行了分析统计。结果表示为均值±SEM。组之间的差异是由单向方差分析评估使用SPSS 12.0版软件包为Windows(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。统计学意义的 得到各自的符号数据。

3所示。结果

3.1。EL-4细胞分化和细胞生存条件

之前调查的影响低AR小鼠,细胞生存能力评估在不同剂量的照射(100、500、1000和2000年乔丹)来确定激光的辐射剂量。因此,激光治疗1000 mJ没有引起任何变化的细胞的细胞毒性。2000 mJ的激光辐照后,比未经处理的细胞的细胞生存能力下降;然而,没有意义(数据未显示)。在此基础上,动物实验剂量被选为1000年乔丹一样低剂量辐照和2000年乔丹高剂量照射,分别。根据该计划,如图13组动物被感染了,当作表示。

3.2。低强度的影响在OVA-Induced AR小鼠血清总IgE水平

进一步分析了过敏反应,我们测量了血清的总IgE水平。的浓度总IgE水平在对照组显著增加(74.54±1.05%)比正常组(22.17±1.21%,图2)。低剂量照射组的总IgE水平(42.64±1.05%)和高剂量照射组(59.93±1.10%)比对照组明显减少,分别为(图2)。


图2
测量血清总IgE水平。总IgE水平表示为光密度(OD)在450海里。N:正常组(无刺激),C:对照组(卵白蛋白刺激没有照射),李:低剂量照射对照组(30 mW / 320年代)和H:高剂量照射对照组(30 mW / 640年代)。# 与正常组。* 与对照组。* * 与对照组。
3.3。低强度降低细胞因子il - 4和TARC生产

进一步研究基于“增大化现实”技术的低强度的影响,细胞因子的生产是通过ELISA试验评估。血清il - 4含量、TARC和干扰素-γ确定,如图3。对照组(il - 4水平的 )升高il - 4的生产相比,在正常组( ),而低剂量照射组( )和高剂量照射组( )比对照组明显降低(图3(一个))。此外,TARC生产血清显示il - 4生产中观察到类似的结果。对照组(TARC水平 比正常组()是增加 ),而低剂量照射组( )和高剂量照射组( )比对照组明显降低(图3 (c))。干扰素-的水平γ在正常生产、控制、低剂量辐照和高剂量照射组 , , , ,分别。有轻微区别组织;然而,没有统计学意义(图3 (b))。

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图3
测量血清细胞因子的生产。血清细胞因子水平的il - 4 (a), TARC (b)和干扰素-γ(c)。TARC水平的il - 4,干扰素-γ被表示为光密度(OD)在450海里。N:正常组(无刺激),C:对照组(卵白蛋白刺激没有照射),李:低剂量照射对照组(30 mW / 320年代)和H:高剂量照射对照组(30 mW / 640年代)。# 与正常组。* 与对照组。
3.4。低强度降低小鼠的脾脏和EL-4细胞表达il - 4水平

免疫印迹进行确定激光辐照对蛋白表达的影响脾的基于“增大化现实”技术的老鼠。β微管蛋白作为内部控制。结果显示在图4(一)对照组(il - 4蛋白水平 ),与正常组相比增加( ),而il - 4蛋白水平的低剂量照射组( )和高剂量照射组( )比对照组明显降低(图4(一))。证实低强度的影响il - 4的表达,我们调查了EL-4细胞il - 4 mRNA水平。il - 4的表达对照组( 对PMA)是增加治疗相比,正常组( ),而激光照射组(100、500、1000和2000 mJ)比对照组降低( , , , ,分别地。,Figure4 (b))。

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图4
小鼠脾脏和EL-4细胞的il - 4的表达。(一)蛋白表达的il - 4水平老鼠脾脏。il - 4的代表乐队从电泳凝胶。N:正常组(无刺激),C:对照组(卵白蛋白刺激没有照射),李:低剂量照射对照组(30 mW / 320年代)和H:高剂量照射对照组(30 mW / 640年代)。# 与正常组。# # 与正常组。* 与对照组。(b) mRNA的il - 4水平EL-4细胞。il - 4的代表乐队从电泳凝胶后rt - pcr反应。正常:不刺激;控制:由PMA刺激。# 与正常组。* 与对照组。
3.5。激光辐照后组织学变化

他进行了染色观察鼻中隔的组织学变化。各自的数字在鼻中隔的上皮炎症细胞对照组(图5 (b))明显高于正常组(图中观察到5(一个))。低剂量照射组(图5 (c))和高剂量照射组(图5 (d))的渗透炎症细胞数量减少上皮细胞以及上皮结构恢复OVA-induced上皮损伤。特别是在低剂量照射组,激光辐照的影响是最有效而观察正常组(数字5(一个)和5 (c))。

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图5
鼻中隔的苏木精和伊红染色。小鼠致敏和挑战鼻内没有治疗(a),卵子治疗(b), 1000年乔丹激光辐照(c),和2000年乔丹激光辐照(d),获得的图像是客观放大×400。比例尺条= 100μm。气道腔(AL),上皮细胞(E),血管(BV),分别和鼻中隔软骨(SC)所示。

4所示。讨论

医学应用激光治疗分为两类:高水平的激光和低水平激光。高水平激光射程在3000和10000 mW和被用于外科手术的目的,而低水平激光已应用在韩国传统激光针灸医学的1000 mW以下输出(15]。激光针灸是一种无痛、无创的治疗模式和礼物没有感染的风险。根据文献综述,发现证据支持使用激光针灸治疗肌筋膜疼痛,术后恶心和呕吐和缓解慢性紧张性头痛(10]。据报道,低水平激光使用photoenergy刺激某些类型的细胞和组织,从而增加血液循环,胶原蛋白合成、细胞生长和骨再生,缓解炎症、疼痛、水肿(16- - - - - -22]。

在这项研究中,研究基于“增大化现实”技术的低强度对动物模型的影响,我们首先确定激光辐照的剂量,因为针对鼻腔的穴位治疗的目的尚未尝试过激光治疗。为此,EL-4细胞受到可行性分析通过暴露增加剂量的激光照射2000 mJ。结果表明,激光辐照没有引起任何显著的EL-4细胞的细胞死亡。因为EL-4癌变细胞,我们不能排除这种可能性,这些细胞的异常可能会影响到更高的细胞质的代谢情况。然而,没有形态变化EL-4细胞中观察到的坏死和细胞毒性的环境。因此,我们应用两种不同剂量的激光照射(1000年和2000年乔丹)鼠标AR模型和检查血清的IgE水平,细胞因子(il - 4和正-γ),TARC。低剂量照射组显著抑制IgE, il - 4, TARC表示。此外,il - 4的表达显著抑制低剂量照射组和EL-4的剂量依赖性抑制细胞检测。特别是,炎性细胞浸润的鼻中隔减少了激光辐照的组织学检查与低剂量照射组明显减少。

I型超敏反应的基于“增大化现实”技术是由IgE介导的免疫反应对外国过敏原并导致急性炎症的发展通过IgE敏感的肥大细胞和其他免疫调节剂(23]。鼻粘膜暴露于过敏原时,许多免疫细胞如肥大细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞被激活并导致渗透细胞的血管损伤和组织学的变化紧随其后鼻组织(23]。

IgE引发过敏症状通过激活的分泌颗粒从肥大细胞和嗜碱细胞通过绑定到其表面受体(24]。增加IgE水平血清能诱导急性过敏,随后引起花粉症症状,哮喘和过敏反应。在我们的实验中,OVA-induced鼠标显示,血清IgE增产,这是减少低水平激光辐照,表明低强度对IgE抑制性影响生产的基于“增大化现实”技术的小鼠模型。

我们已经了解到,il - 4中扮演一个重要的角色在早期炎症的基于“增大化现实”技术的发展,和它维持炎症过程通过感应Th2细胞分化和功能(25,26]。另一方面,干扰素-γ从Th1细胞分泌刺激B细胞产生抗体和诱发免疫球蛋白介导免疫反应(27]。它也被报道,干扰素,提高水平γ可以减少过敏反应的早期和晚期阶段和缓解症状28,29日]。因此,它有一个对il - 4 antagonic行动和IgE生产函数。TARC (CCL17)是一种受体表达Th2细胞和亚兰与高亲和力结合30.]。大家都知道参与白细胞迁移和被视为关键炎症因素之一的IgE过敏性免疫反应(24]。探讨低强度对细胞因子的影响生产OVA-induced AR老鼠,我们进行ELISA检测。结果表明,低水平激光辐照显著降低血清il - 4和TARC水平,而正-γ没有受到任何剂量的低水平。在目前的研究中,低强度的抑制作用对il - 4生产rt - pcr和免疫印迹分析证实了使用小鼠脾脏和EL-4 Th2细胞,分别。这些结果强烈表明,AR老鼠低强度的影响是来自Th2免疫反应通过调节IgE介导的il - 4生产而不是那些Th1相关的免疫反应。此外,参与合成和分泌il - 4是IgE的B细胞。因此,抑制il - 4的表达可能与血清的IgE水平。然而,分子机制的低强度减少了IgE和il - 4生产仍有待研究。

鼻黏膜的组织学变化是一个重要的象征因素基于“增大化现实”技术的发展。因此,我们研究了低强度的影响是否伴有鼻中隔的组织学改善上皮。OVA-induced AR老鼠明显损害鼻腔上皮所观察到的细胞在血管浸润,这免去低强度不仅在渗透细胞的数量也在鼻中隔的整体组织学损害。结合低强度调节细胞因子表达的影响,抗炎作用低的报告。在动物模型的急性肠缺血/再灌注引起的肺部炎症或有限合伙人,低强度减轻气道炎症通过感应TNF和il - 10和减少巨噬细胞炎性protein-2 (MIP-2)表达式31日,32]。考虑到最大的影响在低剂量辐照在目前的研究中,低强度的有效辐照剂量应该确定当它受到治疗的应用在人类使用。

5。结论

低可能是另一种治疗方法治疗AR或其症状,和低剂量辐射(1000 mJ)可能是更有效的比高剂量辐照(2000 mJ)。这可以解释为低水平激光辐照的功能,抑制基于“增大化现实”技术的发展通过Th2细胞激活的规定,分化,如细胞因子和炎性分子IgE的表情。解释的临床效果,最佳剂量的激光照射,或详细的机制进一步的调查,包括临床应用需要对人类或分子研究。

作者的贡献

Binhye崔张Mun Seog也同样研究cofirst作者。

承认

作者要感谢博士Sungho宋光州科学和技术研究所的专业支持。