文摘

卡哈尔间质细胞的损伤(ICC)在糖尿病大鼠肠道蠕动障碍有关。我们展示了一个加速度电针刺激结肠收缩性的刺激(EAS)。然而,对东亚峰会在结肠运输和ICC的潜在作用。在这项研究中,我们评估的影响东亚峰会在结肠运输和研究细胞凋亡/增殖刑事法庭是否参与调节东亚峰会对结肠转运的影响。老鼠被随机分配到正常,糖尿病,diabetic-plus-sham刺激,diabetic-plus-low-frequency刺激,和diabetic-plus-high-frequency刺激组。珠驱逐测试用于测量远端结肠运输。这个工具包(ICC)标志被免疫印迹检测。凋亡刑事法庭被终端检测到dUTP核苷酸结束标签。增殖刑事法庭被装备/ Ki67双immunofluorescent染色整个山的准备。使用电子显微镜ICC的超微结构变化进行了研究。 Results showed that high-frequency stimulation significantly promoted colonic transit. Low- and high-frequency stimulation markedly rescued intramuscular ICC from apoptosis. Abundant proliferating intramuscular ICC was found in low- and high-frequency stimulation groups. Our results indicate that high-frequency EAS has stimulatory effect on the distal colonic transit, which may be mediated by downregulation of the apoptosis and upregulation of the proliferation of intramuscular ICC.

1。介绍

糖尿病引起的便秘是最常见的胃肠道(GI)并发症的糖尿病(DM)。一项研究发现,多达60%的DM患者便秘的症状或延迟报道结肠运输(1]。治疗糖尿病引起的便秘主要是经验和指导对减轻症状,包括良好的水合作用,有规律的身体活动,增加纤维摄入量。然而,治疗效果往往不能令人满意。

许多研究已经进行调查的影响针灸、电针刺激胃肠道蠕动和功能性胃肠疾病(2]。刺激穴位的针灸电针刺激是一个修改电流代替手动操作(2,3]。发现电针刺激的影响刺激胃肠道蠕动(EAS)是相当一致的,这些研究中使用的主要穴位Zusanli(足三里)。胃蠕动主要研究,只有一个小的信息可以在东亚峰会在结肠运动的影响。东亚峰会在足三里记录加速结肠能动性和运输在有意识的老鼠4]。我们先前的研究报告,东亚峰会在足三里可以促进远端结肠收缩性通过胆碱能通路在有意识的老鼠3]。Rangwala等人表明,东亚峰会是一种安全有效的治疗便秘的方法没有任何不利影响(5]。最近,我们的研究表明,东亚峰会在穴位足三里可以增加卡哈尔间质细胞的密度(ICC)和移植结肠ICC的表达6]。然而,东亚峰会的潜在角色在糖尿病便秘大鼠结肠能动性和刑事法庭还没有被调查。

ICC在胃肠道生理的重要作用已经阐明在过去的10 - 20年。为正常的肠蠕动(ICC是必要的7]。肌内卡哈尔间质细胞(ICC-IM)主要是影响DM,伴随着延迟结肠运输(8,9]。进一步的研究(10,11发现网络刑事法庭不是静态的,它甚至在正常生理条件下经过定期更改。细胞凋亡和分化转移会导致刑事法庭删除;刑事法院可以恢复增殖,从干细胞补给,和增加生存;细胞凋亡/增殖刑事法庭是否参与东亚峰会对结肠运输的影响尚不清楚。

本文希望为东亚峰会提供更多的数据在糖尿病大鼠胃肠道和底层机制。我们研究的目的是评估的影响东亚峰会在糖尿病便秘大鼠足三里在结肠运输和探讨细胞凋亡/增殖刑事法庭是否参与调节东亚峰会对结肠转运的影响。

2。材料和方法

2.1。动物

五十岁男性Sprague-Dawley老鼠,体重250 - 300克被用于本研究。老鼠从同济医学院和购买安置在普通实验室条件下(在18到22岁的°C, h光暗周期12/12)与免费的食物和水随意。本研究开始后,老鼠适应环境,通常一个星期后。老鼠在我们的研究中得到人道关怀和治疗严格按照指南中建议的护理和使用实验动物国家卫生研究院和实验工作都是批准的伦理指导方针从动物保健和同济医学院伦理委员会,华中科技大学(00008371)。

2.2。诱导的糖尿病

糖尿病与一腹腔内注射链脲霉素诱导(Alexis生化药剂、圣地亚哥、钙、美国)60毫克公斤⁻¹刚20更易溶解在L⁻¹柠檬酸缓冲溶液(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。年龄匹配控制注射柠檬酸同等体积的缓冲。血糖和体重测量注射前1周、4周、8周后注射。糖尿病是验证了随机血糖指数高于16.7更易与L⁻¹一周后注射链脲霉素(STZ),用血糖仪测量血液从尾静脉。

2.3。试验协议

动物被随机分为5组(十大鼠/组),包括对照组,DM组DM-plus-sham刺激组(海,只有针灸,但没有电流,30分钟),DM-plus-low-frequency刺激组(LEA 10 Hz, 1 - 3 mA, 30分钟),和DM-plus-high-frequency刺激组(1 - 3 mA头脑,100 Hz, 30分钟)。东亚峰会是在足三里每天8周(3]。远端结肠运输记录注射前1周、4周、8周后注射。之后,老鼠随后被牺牲,标本的从每个便秘大鼠远端结肠得到。每个标本收集的老鼠被划分为三块相同的大小,然后要么立即从黏膜和黏膜下层,并存储在免疫印迹分析−80°C或放入4%多聚甲醛对免疫荧光,为电子显微镜或2.5%戊二醛。

2.4。电针刺激

足三里是位于5毫米横向伪劣前胫骨结节的老鼠(3]。针的直径0.3毫米(苏州医疗器械厂、江苏、中国)插入到穴位,刺激的电针刺激参数10赫兹和100赫兹和1 - 3 mA使用电刺激器(G6805-2A;上海华谊医疗器械厂、上海、中国)。这些参数选择的基础上,初步实验暗示刺激活性的影响(4,12]。为了排除约束条件的影响,自己的笼子里的动物被允许自由行动在EA过程和运动性录音。

2.5。结肠蠕动的测量和分析

修改之前使用的技术(13,14)是用于本研究评估远端结肠的能动性。动物禁食12小时前测量。简单地说,一个3毫米彩色塑料珠被插入到远端结肠(3厘米近肛门)和塑料杆,而每只动物在短暂的异氟烷麻醉。珠插入完成用玻璃棒fire-polished结束避免组织损伤。单独珠插入后,有意识的老鼠被放置在一个笼子里白色的纸巾覆盖的地板使检测更容易珠。远端结肠运输确定之间的时间珠珠的位置和驱逐(珠延迟)。延迟的驱逐珠被记录。这是重复三次。老鼠珠驱逐时间超过+ 2 sem被认为是便秘。对照组大鼠的数量是10,和糖尿病便秘大鼠的数量在每个另一组列如下:(i)六大鼠在DM组,(2)七大鼠海集团(iii)七LEA组大鼠,七他组大鼠(iv)。

2.6。免疫印迹

蛋白质浓度分析由BCA试剂(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。一百毫克的蛋白质分离10%钠dodecylsulfate-polyacrylamide凝胶电泳和转移到PVDF膜(微孔,贝德福德,妈,美国)。使用初级抗体免疫印迹工具包(sc - 168 g, 1: 200年,圣克鲁斯生物技术,Inc .)完成;兔子anti-rat肌动蛋白(1:400年,圣克鲁斯生物技术有限公司)是用作内部控制,其次是与增强化学发光检测(Amersham法玛西亚生物技术,皮斯卡塔韦,新泽西,美国),微量化。

2.7。免疫荧光

远端结肠被温柔和肠内容被冲走了PBS (37°C)后腹部被打开了。用于包埋的准备工作、结肠与固定液膨胀,黏膜和黏膜下层被移除,和环形平滑肌层包含ICC-IM被曝光的援助解剖显微镜。包埋的准备工作在正常孵化牛血清(5%在PBS含有0.3% Triton x - 100)在室温下1 h,然后孵化首先与初级抗体工具包(山羊anti-rat, 1: 150;圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,CA,美国)一夜之间在4°C,然后与二次抗体(抗体,1:100;亚历克斯萤石)。染色结果被共焦激光扫描显微镜(尼康、日本)的激发波长适合FITC (488 nm,扩散)和Cy3 (552 nm,细胞凋亡)。Z的共焦图像叠加3μ米到5μ米间隔包含所有积极染色细胞的水平和过程。

2.8。检测细胞凋亡刑事法庭

识别细胞凋亡的刑事法庭、终端原位dUTP缺口末端标记(TUNEL)法是使用一个细胞凋亡检测设备(罗氏公司、德国)15]。包埋准备孵化了初级抗体工具包(山羊anti-rat, 1: 150;圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,美国CA)一夜之间在4°C和二级抗体(抗体,1:100;Cy3;亚历克斯萤石)37°C为30分钟,洗两次与PBS为30分钟,然后用TUNEL孵化反应包含45缓冲μ和5 L标签解决方案μL酶解决方案(标签解决方案:酶解= 9:1)在37°C 1小时在黑暗中在湿润的气氛中。用PBS的三倍(每15分钟)非法人fluorescein-dUTP移除。与荧光显微镜观察标本的激发波长450 - 500纳米的范围内。

2.9。检测ICC扩散

检测ICC的扩散,anti-Ki67抗体被用来检测增殖刑事法庭的存在。Ki67是核蛋白质表达的增殖细胞和维持细胞增殖可能需要。是彩色的包埋准备工具如上所述,然后贴上Ki67如下:包埋准备孵化了一只兔子单克隆抗体Ki67(兔子anti-rat, 1: 200;Abcam,英国剑桥)一夜之间在4°C,然后cy3-conjugated二级抗体(anti-rabbit, 1: 100;亚历克斯萤石)。与荧光显微镜观察标本的激发波长适合Cy3(552海里)。

2.10。电子显微镜

远端结肠灌注了PBS固定剂溶液(2.5%戊二醛)紧随其后。然后,他们沉浸在4°C 2 h 2.5%戊二醛。组织样本的碎片约1毫米×5毫米被削减从远端结肠的身体和OsO固定为1%₄30 - 120分钟。他们用0.1磷酸盐缓冲剂和脱水的一系列分级乙醇。沉浸在丙烯氧化后,样本沉浸在混合物(1:1)环氧丙烷和环氧树脂树脂2 h,并嵌入在环氧树脂根据指令表。区域研究识别和使用超微切片机切片到超薄(70海里)串行部分。我们可视化部分使用透射电子显微镜操作(Tecnai G212,范,荷兰)。

2.11。测量和统计分析

immunofluorescent染色评估后,显微照片的工具/ TUNEL和装备/ Ki67 double-labeled细胞被10个随机领域(200×放大,0.2607毫米²每包埋制备与数码相机(现货,诊断仪器)BX51荧光显微镜(日本奥林巴斯)。装备/ TUNEL或装备的数量/ Ki67阳性细胞数由两个独立观察员Image-Pro + 5.0(媒体控制论)。所有数据被当作平均值±SEM。单向方差分析(方差分析)是用于多个组比较,和作为一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。血糖和体重

如图1(一),没有每组基线血糖的差异。4月底和8周,治疗糖尿病大鼠的血糖水平明显高于对照组(和、职责)。在海里,LEA和头脑,血糖水平没有任何明显的变化与DM组4周(> 0.05 > 0.05,分别地。)和8周(> 0.05 > 0.05,职责)。

否则,每组没有基线体重的差异(图1 (b))。4月底和8周,DM组大鼠的体重没有增加,而头脑组体重增加(和、职责)。在海里和LEA组,体重没有明显改变与DM组4周(> 0.05,职责。)和8周(> 0.05,职责)。

3.2。东亚峰会对远端结肠转运的影响

如图2没有差异,指出,在基线在五组结肠转运时间。4月底和8周,DM组的远端结肠运输延迟明显(最小值和分钟,;最小值和分钟,)。在海里和LEA集团远端结肠运动与DM组相比没有明显改变为4周(最小值和分钟,;最小值和分钟,)和8周(最小值和分钟,;最小值和分钟,),分别。然而,他的足三里大大促进了远端结肠运动4和8周,分别为(最小值和分钟,;最小值和分钟,)。

3.3。免疫印迹分析工具在结肠组织的黏膜和黏膜下层被移除

与对照组相比,装备在DM组的表达明显减少()。同样,没有发现意义之间的海洋和DM组()。LEA组包的表达有显著提高(他的集团),而一个增强发现DM组的近四倍。装备水平的增加表达他组略高于LEA组,差异具有统计学意义()(图3)。

3.4。ICC-IM密度的变化

ICC-IM发现结肠平滑肌层内;在共焦包埋细胞通过免疫组织化学方法显示工具包准备,清楚地显示,对照组ICC-IM形成蜂窝网络。DM组,装备的密度积极ICC-IM显著降低了~ 78%控制(与毫米⁻²,)。然而,工具⁺细胞数量在一定程度上恢复了LEA和头脑集团,几乎都可以看到完整的蜂窝网络。工具包LEA组阳性细胞密度仍显著低于头脑集团(与毫米⁻²,)。没有区别,DM组(与毫米⁻²,)。

3.5。细胞凋亡的ICC-IM

为了确定细胞凋亡参与了糖尿病ICC-IM损失的过程中,TUNEL法检测细胞凋亡的ICC(图4)。在对照组,几乎没有发现细胞TUNEL标记法在远端结肠墙埋准备,和工具包⁺ICC-IM网络是完美的。DM组,工具包⁺蜂窝网络被严重破坏,大量的装备⁺/ TUNEL⁺细胞被观察到位于ICC-IM(表1)。类似的变化是在海集团和凋亡工具包⁺国际刑事法庭的观察()。然而,LEA和头脑,ICC恢复的网络;一个更完整的网络的头脑,和罕见的凋亡刑事法庭可以看到。

3.6。ICC-IM扩散

鉴于ICC-IM细胞数量显著增加的LEA和头脑,我们确定扩散是参与细胞数量的大幅增加。因此,双immunofluorescent染色anti-Kit / Ki67被用来揭示刑事法庭的存在扩散。Ki67的核内蛋白表达在增殖细胞中,也许对于维持细胞增殖(16]。少量的增生性ICC出现在对照组和显示一个完美的网络。装备/ Ki67 ICC-IM细胞标记是在海里看到DM组和组。然而,网络ICC-IM部分恢复和双标记细胞分布在ICC-IM LEA组(毫米⁻²)。这些细胞在高密度的头脑集团(毫米⁻²、表1),伴随着一个更完整的刑事法庭(图网络5)。

3.7。电子显微镜:ICC-IM的超微结构

在对照组,ICC-IM电子密度较高细胞质与平滑肌细胞相比,富含细胞的细胞器,如线粒体、内质网和基板(图6(一))。他们也显示与肠神经和平滑肌细胞紧密联系。然而,ICC-IM DM组明显(图的影响6 (b)):与中断嵴线粒体肿胀,片状体,部分胞质损耗经常ICC-IM细胞体或进程内。他们中的大多数与肠神经失去了连接。在海里ICC-IM组显示相同的超微结构异常的DM组(图6 (c))。相比之下,大多数ICC-IM LEA(图6 (d)(图)和他组6 (e)恢复在很大程度上,偶尔可以看到轻伤。

4所示。讨论

目前的研究表明,(我)他足三里刺激影响糖尿病便秘大鼠远端结肠运输;(2)LEA和头脑都可以表达下调细胞凋亡和移植ICC-IM扩散。

针灸已被用来治疗各种胃肠道问题在中国几千年了。电针刺激已更频繁地应用于临床和研究环境因为它的再现性。电针刺激的优点是,它是一个具有成本效益和微创手术的副作用发生率很低。尽管它对胃运动的影响,更少的信息可以在东亚峰会在结肠运动的影响。Iwa等人证明了东亚峰会(10 Hz)在有意识的大鼠足三里加速结肠能动性和运输(4]。我们先前的研究显示结肠收缩性的加速东亚峰会(10 Hz)在有意识的大鼠足三里(3,高频东亚峰会(100赫兹)可以显著提高结肠运输显然在中国出版的数据。其他的研究也表明,电针刺激,尤其是高频EA,通常被用作替代治疗帕金森病(PD),有效减轻运动症状的病人和PD模型(12]。所以,我们选择的参数(10赫兹和100赫兹)的基础上,初步实验表明刺激活性的影响。在目前的研究中,我们表明,东亚峰会和高频刺激足三里糖尿病便秘大鼠远端结肠蠕动。低频组的变化,而没有意义的可能的解释不同变化的结肠运动响应低频东亚峰会在不同的研究可能是老鼠的疾病反应不同的东亚峰会,而结肠运动的可能的原因不同应对低,高频东亚峰会在我们的研究可能是低频EAS的能量不足以引起运动的变化。

除了调查东亚峰会在远端结肠运动的影响,实验也是为了研究可能的机制。大部分的工作在这一领域的关注外周围交感神经系统,这表明刺激效应可以通过胆碱能通路介导的(3,4),但只有很少的研究报道的影响东亚峰会在ENS.然而,人们普遍认为网络刑事法庭中起着非常重要的作用在调节胃肠道的能动性。ICC-IM,形式与平滑肌细胞缝隙连接和亲密伙伴关系神经静脉曲张,调节肠运动神经传递。王等人报道,ICC-IM主要是影响糖尿病(9]。弗勒斯等人发现,在结肠,ICC-IM以及ICC-SMP受到影响最严重8]。此外,我们最近的研究表明,东亚峰会可以增加刑事法庭的密度和修复神经装置(6,17),因此我们选择观察ICC-IM基于变更的初步实验。在目前的研究中,我们还显示,ICC-IM的密度和超微结构是在东亚峰会组显著升高,尤其是他集团可能是负责调节结肠运动的功效。

细胞凋亡和分化转移的两种机制是国际刑事法庭的损失,这是与运动性障碍(10]。STZ糖尿病模型,增加了细胞凋亡的神经元在结肠组织中已经证明(18]。人类结肠组织的数据显示,ICC数量减少可能发生损伤,至少在某种程度上,通过细胞凋亡19]。我们有显示细胞死亡,采用TUNEL法,发现大量的凋亡工具包阳性细胞发生在DM组,表明减少刑事法庭可能是由于细胞凋亡,至少在部分。王等人。20.)报道称,东亚峰会预处理可以抗凋亡预防缺血性损伤的大鼠局灶性脑缺血。在我们的研究中,有意思的是观察到凋亡的数量在东亚峰会ICC-IM团体,尤其是他组,主要是减少了。结果表明,高频电针刺激更有效地减少ICC-IM的细胞凋亡,减少细胞凋亡的ICC-IM可能参与头脑对结肠运动的机理。

扩大刑事法院可以通过增加刑事法庭的扩散,从干细胞发展和增加生存的ICC (10]。虽然以下两个机制不能丢弃的,其他的研究表明,东亚峰会能增强细胞增殖在年轻的老鼠大脑21]。核扩散是参与国际刑事法庭的扩张缺血和再灌注损伤中细胞数量在成年豚鼠(15),所以我们主要研究第一个机制。通过使用Ki67合并,我们表明,有一个复苏ICC-IM ICC-IM细胞数量和扩散的东亚峰会组织,尤其是他。结果表明,高频电针刺激更有效地增加ICC-IM的扩散,并增加ICC-IM扩散的机制可能参与头脑结肠蠕动。

高血糖和体重的两个主要参数特征的糖尿病大鼠(14]。文献[22)报道称,东亚峰会可能会增加食欲,睡眠和体重。在我们的研究中,糖尿病大鼠处理高频刺激表现出增加体重,但在治疗后血糖水平与不同形式的EAS大多是不变的,和他们仍然高血糖的。Peplow和巴克斯特23马)发现,东亚峰会15赫兹10 30分钟和60分钟在禁食2型糖尿病大鼠血糖过低的效果。然而,血糖与参数没有改变东亚峰会后15赫兹1 - 3 mA在2型糖尿病大鼠和20赫兹在1型糖尿病大鼠23,24]。同样,尽管不同的频率东亚峰会(10/100 Hz, 1 - 3 mA)尝试,在STZ-induced糖尿病大鼠血糖并没有显著改变在当下研究。的可能的解释不同血糖的变化应对东亚峰会在不同的研究可能是东亚峰会和动物模型的频率是不同的。我们的结果表明,他可以提高糖尿病大鼠的体重,但在STZ-induced糖尿病大鼠的血糖没有影响,1型糖尿病的典范。

这个研究的数据表明,东亚峰会的影响在穴位足三里远端结肠运动刺激,和刺激效果的差别可能是由对这些细胞凋亡和upregulation ICC-IM扩散。根据研究的结果,东亚峰会可以应用治疗结肠运动障碍。在当前的研究中,低收入和高频东亚峰会能够改善结构参数,但功能改善后只看到高频东亚峰会,这表明高频EAS治疗结肠蠕动障碍可能会更好。有研究表明针灸治疗功能性便秘的治疗潜力(25]。一项临床研究显示,针灸能显著增加肠蠕动的频率在便秘的孩子26]。进一步扩大研究样本和不同的频率东亚峰会是必要的证明其临床潜力。

5。结论

总之,他在足三里可以促进远端结肠蠕动,和头脑的刺激影响足三里远端结肠蠕动,部分介导的细胞凋亡和upregulation差别,对这些ICC-IM扩散。还需要进一步的研究来探讨临床治疗功能性胃肠疾病的潜力。

利益冲突

作者没有利益冲突。

确认

作者要感谢冯美专家对他的帮助在本文的准备,和欣赏杨关优秀的技术援助的电子显微镜。作者也感谢张阴平不变Lu和仪陇在共焦激光扫描显微镜的帮助。这部分工作是支持由中国国家自然科学基金(项目没有。30670775也没有。81270458)。