文摘
本研究旨在探讨的影响长期电针刺激Baihui (DU20)和Zusanli (ST36)脑微血管和在自发性高血压大鼠海马CA1区神经元(月)。总共45雄性Wistar鼠和45个月被随机分组,有或没有电针刺激(EA) DU20 ST36,每隔一天一次一段8周。平均动脉压(MAP)每2周测量一次。脑血流量(CBF)和微血管开放的数量由激光多普勒和免疫组织化学方法观察海马CA1区,分别。尼氏小染色和免疫印迹进行分别确定海马形态学和蛋白质参与的信号通路。结果表明,在月增加线性映射后的观察期,显著降低电针刺激与虚假的控制月大鼠,观察而没有区别在Wistar鼠EA和虚假的控制。CBF、学习和记忆能力,和毛细管萎缩的稀疏的upregulation提高了EA。血管紧张素ⅱ1型受体(AT1R)、内皮素受体(ETAR)和endothelin-1 (ET-1)月老鼠被电针刺激减弱,这表明AT1R的含义,ETAR, ET-1通路在EA的效果。
1。介绍
高血压的发病率是世界上约30% (1]。严重,长期高血压伴随着持续的血管收缩,影响血液供应,最终可以导致重要靶器官损害如心脏衰竭、脑疾病,肾功能衰竭,疾病相关已知microcirculatory改变(2]。
认知障碍是一种主要由高血压引发脑血管疾病。一些流行病学研究表明相关性血压水平和认知能力下降或血管性痴呆3- - - - - -5]。广泛接受,减少小动脉和毛细血管的数量每卷的组织(稀疏)血管阻力的海拔上起着重要的作用,因此,血压。另一方面,从稀疏而导致的脑灌注损伤导致大脑灌注不足,导致神经功能障碍和进步认知失败(6,7]。因此,除了血压降低,衰减的稀疏和合成低灌注在大脑组织理性作为重要目标后认知功能障碍的治疗高血压。
Baihui (DU20),一个人体穴位位于头顶的十字路口中间矢状线,连接两个耳朵弯角,广泛用于中药管理的心悸,健忘,痴呆和失眠等等8]。Zusanli (ST36)位于3厘米低于Dubi (ST35)和前一个finger-breadth胫骨前嵴,和被称为一个穴位的作用在降低血压9]。最近发表的一项研究表明,针灸在DU20可以调控脑衍生神经营养因子(BDNF)表达的支持和促进神经元脑源性神经营养因子,从而改善学习和记忆在早期痴呆大鼠(10]。在诊所,长期在穴位电针刺激刺激DU20 ST36具有明显效果降低血压和健忘的保护。然而,目前还不清楚是否在两个穴位电针刺激DU20 ST36可以逆转脑稀疏和进一步改善神经功能障碍,如果是,什么是底层机制。在这项研究中,使用自发性高血压大鼠(月),我们证明了复苏的影响长期电针刺激DU20和ST36脑血流量(CBF)皮层,和小动脉和毛细血管的密度在海马CA1区,以及学习和记忆能力,这可以归因于抑制血管紧张素ⅱ1型受体(AT1R) endothelin-1 (ET-1),并在脑组织内皮素受体(ETAR)。
2。材料和方法
2.1。动物
雄性Wistar鼠和月(8周)从动物中心获得北京大学健康科学中心(北京,没有证书。SCXK 2006 - 0008)。月是高血压的遗传模型中被广泛接受的医学研究,因为他们的特性与人类原发性高血压。这个模型是由Okamoto和青木在京都医学院,1963年,从远威京都男性标志海拔血压交配的雌性略高血压(11]。动物被关在笼子里°C和湿度%下12小时光/暗周期和接收标准饮食和水随意。实验过程是按照欧盟委员会指南(2010/63 /欧盟)。所有的动物都被处理根据北京大学动物研究委员会的指导方针。协议是由动物实验的伦理委员会批准的北京大学健康科学中心(LA2011-38)。
2.2。电针刺激治疗和动物分组
总共45 Wistar鼠和45月被随机分为6组:威集团(),纯种+假集团(nonacupoints Wistar鼠与刺激,),纯种+ EA组(Wistar鼠与刺激穴位,),月集团(),月+假集团(nonacupoints萎缩与刺激,),月+ EA组(月刺激穴位,)。纯种动物+ EA组和月+ EA组受到刺激通过电针刺激穴位DU20顶骨(位于在正中点)和ST36(5毫米以下的右腓骨在膝关节,和2毫米外侧前胫骨结节)。消毒一次性不锈钢针(0.3毫米×40毫米,全球品牌,苏州、中国)插入2毫米深在DU20斜率为30度。执行垂直针刺在ST36 5毫米的深度。两针都连接到韩寒的穴位神经刺激器(模型LH 202 h,华为有限公司、北京、中国)。在电刺激让动物保持安静,老鼠被固定在一个动物板,用于10分钟之前电针刺激刺激。电刺激进行20分钟每一次,每隔一天一次,一段8周,和刺激参数设定在disperse-dense一波又一波的2/100 Hz的强度1 mA 2赫兹[12]。在纯种+假组和月+假组,电针刺激的动物接受类似治疗组,但电针刺激网站1厘米、2厘米从根尾巴,分别取代DU20和ST3613]。纯种动物组和月集团做过一个类似的过程,但是没有电针刺激。
2.3。血压测量
血压测量所述[14),与修改。测量每2周进行一次上午8点在一个安静的房间。呆在一个盒子里°C 10分钟,平均动脉压测量的血压监测(bp - 98 a, U0130163、东京、日本),以连续三次测量的平均值为平均动脉压(MAP)。
2.4。CBF的评估
CBF使用激光多普勒测量灌注成像仪(PeriScan PIM3;PERIMED,斯德哥尔摩,瑞典)的观察。为此,通过头皮被开一个切口,暴露的皮肤收回头骨。骨膜结缔组织附着到头骨被用无菌棉拭子。计算机控制光学扫描仪直接暴露皮质低功率氦氖激光光束。扫描头定位在平行于大脑皮层的距离18.5厘米。测量的扫描过程花了4秒占地面积80像素。在每个测量站点,光束照亮了组织的深度0.5毫米。彩色图像来表示特定的相对灌注水平显示在视频监视器。
2.5。莫里斯水迷宫测试
认知功能由水迷宫测试结束时观察。莫里斯据莫里斯(水迷宫测试进行15]。水(°C)黑色的坦克(150厘米直径,60厘米深度)分为四个象限的任意区域。一个圆形平台(直径10厘米)由透明有机玻璃淹没1厘米低于水面的中心从周长37.5厘米,中间的一个象限(象限目标)。闭路电视摄像头是安装在天花板上方池来传达主题的中心游泳轨迹和参数来电子图像分析仪。
2.6。组织准备组织学
在每组动物()与戊巴比妥钠麻醉(0.1克/公斤体重)腹腔内灌注在16周和transcardially 0.9%盐水其次是4%多聚甲醛在0.1 M PBS (pH值7.4)40分钟(16]。大脑被切成块,嵌入在石蜡,分段在10μm。
三个部分的大脑海马收集每个动物。部分是deparaffinized和水化、顺序和尼氏小染色和免疫组织化学检查,详细如下。
2.7。尼氏小染色
部分沾甲酚紫,在光学显微镜下检查(BX512DP70、奥林巴斯、东京、日本),按照标准的程序(17]。五个字段海马的CA1部门每只动物被随机选中,和幸存的数量每2毫米的CA1区锥体细胞数。
2.8。免疫组织化学
部分是孵化与抗体CD31(美国沃尔瑟姆热科学,ma1 - 80069)与牛血清白蛋白后阻塞。样本然后孵化与生物素化的二次抗体avidin-biotin-peroxidase复杂紧随其后。作为一个连续控制,部分被同样除了主要抗体是省略了。阳性染色与diaminobenzidine可视化。捕捉到的图像数码相机连接到显微镜(BX512DP70,奥林巴斯、东京、日本)和分析Image-Pro + 5.0软件(IPP,媒体控制论,马里兰州贝塞斯达,美国)。五个领域的CA1区检查每一个动物。
2.9。ELISA
在16周,从每组动物()麻醉和大脑的海马切除和均质裂解缓冲包括蛋白酶抑制剂在冰上。离心机在20000 rcf 60分钟后,决心的上层清液收集endothelin-1 (ET-1)和ELISA在大脑组织的内容,根据生产指令(Abcam,剑桥,英国)。
2.10。免疫印迹分析
免疫印迹分析(如前所述(执行)18]。短暂,大脑被在第16周,和海马体是均质裂解缓冲包括蛋白酶抑制剂。与4×一百微克的上层清液混合样本缓冲区。蛋白质样品分离在Tris-glycineSDS-PAGE病情减轻。兔子主要抗体使用包括那些针对AT1R (Abcam 1: 300年,剑桥,英国),AT2R (Abcam 1: 500年,剑桥,英国),ETAR (Abcam 1: 500年,剑桥,英国),以挪士(BD 1: 1000年,富兰克林湖,美国),伊诺(Abcam 1: 200年,剑桥,英国),和GAPDH(1: 2000年,细胞信号技术,波士顿,MA,美国)。Tween-20与Tris-buffered盐水洗涤后含有0.05%,膜与辣根孵化peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit二级抗体(1:3000年,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,美国)在室温下60分钟。分析了膜使用增强化学发光系统,根据制造商的协议和暴露在一个黑暗的箱子。蛋白质信号被bio-image量化限制级电影的扫描微分析系统(Image-Proplus 5.0,媒体Cybermetrics,马里兰州贝塞斯达,美国)。从每个实验组的结果表示为相对整体强度相比,从虚假的组。
2.11。统计分析
所有参数表示为±SD方法。> 2的比较条件单向方差分析(方差分析)与土耳其事后测试或重复测量方差分析与Bonferroni事后测试使用。的概率小于0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。与电针刺激的长期刺激减少了地图在萎缩
图1显示的效果与电针刺激的长期刺激DU20和ST36地图观察期间。地图在纯种群体从8到16周几乎保持不变。相比之下,映射在月组随着时间的增加,从130毫米汞柱8周后到170毫米汞柱在第16周。地图在月+假组改变随着时间的推移,同样,在月组,观察无显著差异,两组之间的任何时间点。注意,地图在月+ EA组显著减毒在第16周,相比月组和月+假组。
3.2。与电针刺激的长期刺激增加CBF的萎缩
老鼠CBF的代表彩色图像获得由激光多普勒在第16周灌注图像系统(PeriScan PIM3系统;PERIMED,斯德哥尔摩,瑞典)见图六组2(一个)在不同大小的CBF由不同的颜色表示,红色的a1(黑色箭头)代表最高的CBF和黑色代表最低的a4(白色箭头)。图2 (b)CBF的统计结果不同组,表明比纯种群体,CBF月组显著降低。在穴位电针刺激治疗明显松了一口气的CBF萎缩。相比之下,电针刺激治疗nonacupoints对CBF没有显著影响,尽管一些趋势增加发生。没有观察到显著差异月+骗局和月+ EA组之间,可能由于大的标准偏差。
(一)
(b)
3.3。与电针刺激的长期刺激减弱空间学习和记忆障碍在萎缩
图3说明了延迟和游泳距离评估莫里斯水迷宫的老鼠在不同实验小组。威集团中观察到没有显著差异,纯种+ EA组,纯种+假组在学习和记忆的潜力。时间延迟和游泳的距离观察月组比纯种组。月大鼠接受电针刺激治疗显示显著改善空间学习和记忆障碍与月的老鼠相比,表现出较小的平均延迟和更短的平均距离游泳。月+假组相比,然而,老鼠在月+ EA显示改善意味着延迟但不意味着游泳距离。空间学习和记忆的障碍并不是通过在非穴位电针刺激减轻。
(一)
(b)
3.4。与电针刺激的长期刺激保护海马CA1区神经元的萎缩
的数量和形态在海马CA1区神经元(箭头所指)被评估在不同的组在第16周尼氏小染色,结果呈现在图4。威集团,锥体细胞存在于大约三到四层,用尼氏小体经常被黑暗彩色(a1, b1)。相比之下,CA1区萎缩的特点老鼠在第16周是大大不同的,细胞的特点是薄层,收缩和解体神经元(a4, b4)。这些形态变化被电针刺激DU20和减毒ST36 (a6, b6),但不是在nonacupoints (a5和b5)。图4 (b)显示了一个定量评价细胞的数量在CA1区不同组。Wistar鼠相比,在CA1区神经元数量显著降低月和月+假组,电针刺激DU20和ST36保护。
(一)
(b)
3.5。与电针刺激的长期刺激增加微血管开放在海马萎缩的数量
评估微血管的数量和形态,一个CD31免疫化学染色进行描绘血管(箭头)。图5(一个)代表图像显示海马CA1区immunohistochemisty为CD31染色的六组。调查在纯种的低功率显示微血管开放组,以及威威斯塔+ + EA组和虚假的集团,是人口和均匀分布在一个地区之间CA1和齿状回(a1, b1;a2、b2和a3, b3)。令人印象深刻的是,在月和月+虚假的团体,开放微血管的密度减少(a4和a5),和他们成为异构分布明显收缩血管和血管壁增厚(b4和b5)。月和月+虚假的老鼠相比,电针刺激在DU20 ST36减毒微血管的改变(a6和b6),而电针刺激nonacupoints没有影响(a5, b5)。定量评价微血管开放的数量确认调查结果(图5 (b))。
(一)
(b)
3.6。与电针刺激的长期刺激减少了ET-1但不是没有内容的脑组织萎缩
大脑ET-1内容不,对面的两个介质对血压的作用,是评估ELISA在第16周不同群体探讨电针刺激效应的机制。如图6(一),没有区别的内容ET-1脑匀浆纯种群,纯种+ EA组,纯种+假组。相比之下,ET-1内容在月和月+假组显著增加,与威集团由electroacupouncture减毒DU20 ST36,但不是在nonacupoints。另一方面,没有的内容所有的组没有统计学差异(图进行了研究6 (b)),表明没有不扮演一个角色在月增加血压,并不是电针刺激效应的机制。
(一)
(b)
3.7。与电针刺激的长期刺激减弱AT1R和ETAR但不是AT2R,表达式的脑组织萎缩
阐明高血压的发病机制的萎缩和电针刺激效果观察的目标在当前情况下,AT1R的表达,AT2R,和ETAR脑组织是由免疫印迹在第16周不同的条件,和结果呈现在图7。AT1R和ETAR表达纯种组之间没有明显差异,纯种+ EA组,和纯种+虚假的集团,但在月组显著增加,比纯种群体。在穴位电针刺激刺激DU20和ST36显著抑制AT1R和ETAR表达的增加月老鼠,但nonacupoints(数据没有影响7(一)和7 (c))。AT1R和ETAR相比,没有明显的差异AT2R六个实验中蛋白质水平组(图7 (b))。
(一)
(b)
(c)
3.8。长期刺激与电针刺激对以挪士没有影响和伊诺表达式的脑组织萎缩
AT2R相似,以挪士和进气阀打开蛋白质的表达在脑组织中没有明显变化六个实验组,如图8(一个)和8 (b)。
(一)
(b)
4所示。讨论
目前的研究显示,月收益长期电针刺激刺激DU20 ST36显著,包括缓解高血压,增加微血管开放和脑血流量衰减的神经元损伤,恢复认知障碍。
我们的初步实验表明,相比于其他穴位,如Yanglingquan (GB34)、风(合谷),Quchi (LI11)和Neiguan (PC6),电针刺激刺激在DU20 ST36施加一个更明显的降压效果。刺激还报导独自ST36减弱高血压;然而,这项研究对其改善效果在高血压大鼠认知障碍是有限的(19]。另一方面,针灸刺激在DU20发现更有效的改善认知障碍在诊所20.]。在目前的研究中,电针刺激刺激在月DU20结合ST36缓解高血压以及恢复认知障碍。
系统性微脉管系统的形态学变化的最终结果是建立高血压。这个变更可能归因于稀疏在毛细管的层次上,扮演了一个重要的角色在减少高血压引起的CBF [21,22]。之前它已经被证明长期脑小动脉的收缩导致微血管开放的数量减少和减少CBF萎缩(23,24]。钙通道阻滞剂的临床应用,利尿剂,β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂和AT1R拮抗剂可以缓解血管痉挛、降低血压(25]。然而,这些药物对CBF影响甚微。目前的研究表明,CBF减少可以通过长期显著恢复两个穴位电针刺激刺激疗法DU20 ST36。此外,使用免疫组织化学方法,我们发现长期电针刺激可以减弱的数量减少毛细血管的海马萎缩。在海马CA1区神经元容易缺血和缺氧。缺血、缺氧引起的膨胀在高血压的主要原因负责CA1海马区神经元的损伤和认知缺陷在月26,27]。因此,改善脑血管痉挛预计将减少CA1区神经元损伤和减轻认知功能障碍。先前的研究显示,地图从6周(28,29日),12周的学习和记忆功能障碍发生萎缩(30.]。由于尼氏小染色和莫里斯水迷宫检测,我们的工作进一步表明,电针刺激在DU20 ST36大大抵消海马CA1神经元在萎缩,失去了和学习和记忆障碍的结果归因于毛细管稀疏的救济。
存在AT1R-ET-1-ETAR通路在高血压发病机制很容易被识别;,增加互动的AngII AT1R刺激释放ET-1绑定的内皮细胞,增强ET-1 ETAR,导致血管收缩(31日]。改进AT1R和ETAR表达式是因此关键衰减血管收缩和高血压。我们的研究建议AT1R-ET-1-ETAR通路的影响减轻地图和CBF通过电针刺激DU20 ST36,抑制AT1R的表达和ETAR和减少ET-1在萎缩的内容。另一方面,与Wistar鼠相比,没有变化是观察到的表达AT2R和没有。没有是一个重要的分子,在各种生理功能中发挥作用,没有合酶(NOS)合成的32]。先前的研究已经报道,针灸在高血压的治疗效果与激活号(9]。相反,我们的结果杜绝AT2R-eNOS / iNOS-NO途径的参与在目前情况下,这可能是由于不同的器官和针灸研究的网站。
本研究有一定的局限性。首先,本研究的发现是来源于观察的影响同时应用EA DU20 ST36。在初步研究中,我们评估的影响EA在地图上在16周通过刺激DU20和ST36穴位或者只有一两个。EA的结果显示出更明显的效果比在任何一个应用于这两个穴位。由于本研究的目的是探索高血压的机制,EA变弱,因此我们选择了一个最有效的应用方式,也就是说,在这两个穴位刺激。介导的信号通路的影响AE DU20或ST36单独是目前未知,并等待进一步的研究。其次,EA是一个策略,结合针灸电刺激。研究人员报道,电子和手工针灸刺激影响葡萄糖稳态通过不同的机制33]。目前研究的结果是否可以外推到手动针灸还有待验证。最后,平均动脉压在月+ EA组下降明显在第16周相比,在14周。什么是发生在平均动脉压之间的两个星期期间还不清楚。本地化时间点什么时候EA开始显示的效果,可能是一个或两个星期14和16之间更多的时间点都需要进行检查。
总之,长期在穴位电针刺激DU20 ST36缓解增加地图和大脑在结构和功能异常在萎缩,这有益的行动最有可能通过抑制AT1R-ETAR-ET-1通路介导的。然而,在未来两个问题仍有待解决。第一是确认地图减少病因的治疗效果而不是附带现象的针灸穴位图DU20和ST36脑保护,第二是确定这些发现与其他重要途径的关系,如内分泌系统和经络系统。
承认
这项研究是由天津助教集团财务支持(批准号20050230),中国天津。