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蜂花粉作为蜂疗剂已有几个世纪来治疗烧伤,伤口,胃肠道功能紊乱,以及各种其他疾病。我们的研究的目的是探讨王亚南栗色的影响对四氯化碳(CCI蜂花粉₄全身的)肝损伤。总酚含量、类黄酮、铁减少/抗氧化能力和DPPH自由基活动测量被用作花粉的抗氧化能力决定因素。这项研究是在老鼠身上进行的七组。两种不同浓度的栗蜂花粉(200和400毫克/公斤/天)口服,一组是管理silibinin(50毫克/公斤/天,i.p)七天CCI后的老鼠₄治疗。蜂花粉的保护作用是监控由天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(AST)活动,组织病理学成像,和从血液和肝脏抗氧化参数样本的老鼠。结果相比silibinin-treated和未经处理的组织。我们发现,CCI₄治疗诱导肝损伤和蜂花粉和silibinin-treated组逆转的损害;然而,silibinin引起显著的减肥和死亡率,严重腹泻的老鼠。板栗花粉已经显示28.87毫克GAE / g总酚类物质的DW, 8.07毫克/ g总类黄酮的DW, Cyn-3-glu 92.71毫克/公斤总花青素的DW,和9毫克β总类胡萝卜素的胡萝卜素/ 100 g DW和大量的抗氧化能力根据收紧和DPPH活动。结果表明,板栗蜂花粉保护肝细胞氧化应激和促进愈合的CCI引起的肝损伤₄毒性。我们的研究表明,板栗蜂花粉可以作为一种安全的选择silibinin治疗肝脏损伤。

1。介绍

蜂疗以来一直用于民间医药的早期人类,近年来,其应用在治疗烧伤,伤口,胃肠道功能紊乱,溃疡,致癌作用增加。蜂花粉是最富有的之一,纯粹天然食品,发现;花粉的营养和药用价值已经使用了几个世纪。蜂花粉是一种完美的平衡食物和富含氨基酸、蛋白质、激素、酶、碳水化合物、矿物质、脂肪、大量的维生素,酚类物质,植物化学物质,大量的抗氧化剂代理(1- - - - - -3]。蜂花粉的化学成分取决于其植物和地理属性。花粉含有大约1 - 5%的总酚类物质,包括不同的亚型如类黄酮、酚酸、花青素和单宁。他们表现出广泛的生物活性,包括抗氧化,抗菌,抗炎,antiatherogenic、抗癌和抗血栓形成的活动1- - - - - -4]。酚类化合物被认为是对人体健康有益,因为他们减少氧化应激引起的退化性疾病的风险。许多研究人员已经证明,花粉中的酚类化合物抑制许多退行性疾病的发生和发展2]。

四氯化碳(CCI₄)是一种肝毒素的代理,提高自由基的形成,导致脂质过氧化作用的细胞和细胞器膜(5之一),因此使用最广泛的有毒药剂诱导肝脏疾病在动物模型。CCI₄由细胞色素p450系统代谢高活性三氯甲基自由基和活性氧,引发脂质过氧化和坏死。此外,发起的毒剂会导致炎症反应激活肝巨噬细胞,主要是枯氏细胞(6]。许多研究人员指出,CCI₄接触可能会导致严重的生化紊乱如脂肪肝、肝炎和肝硬化在实验动物7,8]。

是认识到肝细胞损伤是一种严重的病理性疾病对人类。测定天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)活动的血清或血浆中是最简单的方法来诊断肝细胞损伤3,9- - - - - -11]。氧化应激是显示为肝损伤的主要原因之一(11]。Silibinin或silybin水飞蓟素的活性成分和常用治疗各种肝脏损害。水飞蓟素是通过提取水飞蓟的种子(Silybum marianum),富含黄酮类化合物,用作王亚南药物几十年。显示,蜂花粉,其中包含许多酚类物质,也有类似的效果silibinin hepatoprotection[而言1,2,12]。为此,许多天然提取物和蜜蜂产品,如蜂蜜和花粉,在实验室的动物被用于治疗肝脏疾病(3,4,9,10]。

在这项研究中,我们确定的治疗影响板栗CCI蜂花粉₄全身的肝损伤大鼠模型。我们分析了化学和板栗花粉的抗氧化性能,确定花粉补充恢复体重,AST和ALT水平的酶,丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平以及减少组织学CCI后的肝细胞损伤和凋亡₄治疗。我们发现,蜂花粉,CCI silibinin-treated组逆转₄全身的肝损害;然而,silibinin引起显著的减肥和死亡率由于严重腹泻的老鼠。我们的研究结果表明,板栗花粉可以作为一个安全的替代治疗肝脏损害的疾病。

2。材料和方法

2.1。试剂

CCI₄silibinin、没食子酸、槲皮素,乙醇,甲醇,Trolox (6-hydroxy-2 5 7 8-tetramethylchroman-2-carboxylic酸),2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ) Folin-Ciocalteu酚试剂,2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) cyanidin-3-O-glucoside,稍后通知,1,1,3,3-tetramethoxypropane,β胡萝卜素,氮蓝四唑、黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶买来西格玛化工有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。AST和ALT诊断工具也从σ购买。橄榄油是来自KOMİLİSızma公司(İzmir、土耳其)。

2.2。蜂花粉样本

从专家获得花粉样本Zonguldak养蜂人,土耳其(2008年西方黑海地区)开花的季节。样本干40°C烤箱和孢粉学的识别是由博士与扶桑Silici Erciyes大学的土耳其。九个家庭的花粉颗粒被发现在示例:豆科(Medicagospp。三叶草spp。)、壳斗科(齿栗叶的可能l .)、菊科(Asterspp。Cirsiumspp。Carduusspp。)、伞形科(芹菜spp),石竹科(石竹类植物spp。)、禾本科(玉蜀黍属可能),蔷薇科(马吕斯spp。)、桃金娘科(Myrtus普通的),鼠李科(鼠李cathartica)。栗漂白亚麻纤维卷是占主导地位的混合花粉(> 45%)。

花粉的抗氧化潜力的分析,样本由混合1 g的干粉末的花粉样品10毫升甲醇瓶连接冷凝器,然后用超声发生器装置(埃尔玛超音速的数字化,德国)。3 h后声波降解法,提取用于抗氧化测试。虽然我们解散了花粉在无菌H₂O填喂法给动物喂食,它已经表明,花粉的抗氧化潜力与更好的百分比显示提取时使用甲醇(13,14]。

蜂花粉的化学分析执行根据描述的方法在采用AOAC公认的15),和值计算每花粉干重量(DW)。此外,以下潜在的抗氧化性能测定根据提到的引用:总酚含量(16)、总类黄酮(17),和总花青素(18),总类胡萝卜素(17根据铁)、总抗氧化活性降低抗氧化能力(收紧)[19)和自由基清除活性的2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) [20.]。收紧值表示为Trolox等效抗氧化能力,和DPPH自由基清除活性和SC表示₅₀代表提取物的浓度(毫克/毫升)需要抑制自由基清除活性的50%。较低的SC₅₀值表示抗氧化活性越高。

2.3。动物和实验过程

49 Sprague-Dawley老鼠进行了研究,12周大的近似重量250 - 300克。与标准鼠饲料和动物是美联储允许喝水。动物被保存在温度控制(20 - 25°C)笼子12 h黑暗和12 h光周期。食物在实验开始之前被撤回了12 h。

动物被分成七个组(见补充表1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2013/461478)。第一组(G1-G3)是用作控制和其他实验群体。对照组收到0.8毫升的生理盐水(0.9% v / v)在水21)、橄榄油(0.8% v / v)和乙醇(0.2% v / v)每天一次整个段(7天)ip注入,分别。老鼠在G4 G7和CCI管理ip₄溶解在橄榄油的剂量0.85毫升/公斤体重/天。G5再辅以silibinin溶解在乙醇的剂量50毫克/公斤/天。G6和七国集团(G7)与花粉喂养200毫克/公斤和400毫克/公斤每天一次填喂法,分别。在这项研究中,干花粉样品溶解在去离子水。本研究动物保健和使用委员会批准从医学院Karadeniz技术大学(KTU)作。

2.4。测定肝脏酶活性和蛋白质

等离子体是获得治疗大鼠的全血样品通过离心2000 g×10分钟,储存在−20°C到分析。AST和ALT活动被罗氏诊断模块化测量分析仪使用制造商的商业工具根据指令(罗氏诊断GmbH, d - 68298,曼海姆,德国)。

减少氮蓝四唑xanthine-xanthine氧化酶系统被用来测量红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性hemolysate鼠血液样本。甲瓒形成使用分光光度计检查在560海里(beckman coulter DU 530)。导致50%的酶活性抑制被视为一个单位使用牛红细胞SOD作为标准,结果是读U / g Hb (22]。

MDA含量测定与硫代巴比土酸比色测试(稍后通知)用于评估内源性脂质(23]。新鲜的组织样本获得的治疗老鼠保持在−80°C到分析。肝脏组织在冰冷的称重和均质1.15%氯化钾。匀浆离心机在2000 g×10分钟。的分解产物1,1,3,3-tetramethoxypropane作为标准,计算和组织MDA水平nmol /毫升血浆或g组织。分析了肝脏的总蛋白提取使用洛瑞et al。24方法以牛血清白蛋白为标准。的值是通过插值校准标准曲线在650海里。

2.5。组织学制备和分析

组织学分析,肝脏组织样本在缓冲甲醛10%,立即修复与乙醇脱水系列、清洁与二甲苯,嵌入在石蜡和分段5μm。组织部分被苏木精和伊红染色()),那么光显微镜下检查(奥林巴斯BX-51;奥林巴斯光学有限公司,日本东京)。所有肝组织幻灯片高倍镜下检查和图像记录由一个独立的组织学家。五大功率领域被随机抽样和下面的标准选择随访semiquantification肝脏损伤:肝细胞变性,血管堵塞,正弦膨胀,拥挤在扩大的正弦曲线,脂肪变性。每个标本标志使用规模的0到3(0 =没有,1:温和,2:温和,和3:严重)。为每个组组织学得分均值计算。

2.6。TUNEL分析

凋亡细胞的检测在我们组(G1-G7) 4μ米厚的串行部分肝脏样本准备从石蜡包埋。TUNEL分析,原位细胞死亡检测设备(罗氏,曼海姆,德国)是按照制造商的指示用于检测与细胞凋亡相关的DNA片段和清晰可见的核碎片或锋利的和浓缩的彩色质量或新月的细胞核。光学显微镜下的彩色部分进行评估(奥林巴斯BX51显微镜、东京、日本)×400放大。一百细胞数/肝在五个微观领域的幻灯片。TUNEL-positive凋亡细胞的比例计算,这代表了凋亡指数(AI)。一个独立组织学家检查染色标本蒙蔽的方式(11]。

2.7。统计分析

结果的平均值和标准偏差。数据和回归分析通过Microsoft Office Excel 2003(微软公司,微软,佤邦)。测试数据使用SPSS(9.0版本Windows 98, SPSS Inc .)。统计分析的结果是基于克鲁斯卡尔-沃利斯检验和皮尔逊相关分析,这是一个非参数检验。的重要性的差异在统计学上考虑的。

3所示。结果与讨论

本研究调查了王亚南的潜在水生提取板栗CCI蜂花粉₄在老鼠身上全身的肝损害。在治疗之前,一些化学和花粉的抗氧化特性的研究,总结在表1。花粉的主要成分是蛋白质、淀粉、脂肪、矿物质和水。板栗花粉GAE大约28.87毫克/克总酚类化合物(TPC), 8.07毫克/ g的总类黄酮,总花青素Cyn-3-glu 92.71毫克/公斤,29个毫克β总类胡萝卜素的胡萝卜素/ 100 g。这些化合物都建立了他们的责任自然蜜蜂产品的抗氧化活动(1,25]。板栗花粉也展示了大量的抗氧化活性,通过铁降低抗氧化能力测定(收紧)和DPPH自由基清除活性(表1)。虽然有其他蜜蜂产品具有更高的生物活性,如蜂王浆和蜂胶,板栗花粉被用于这项研究由于其水溶性和相对较高的抗氧化能力。程等。26最近研究了抗氧化剂和王亚南的影响五味子属对花粉提取CCl(组织)₄全身急性肝损伤小鼠,发现组织有很强的抗氧化活动和重要对CCl所致急性肝毒性的保护作用₄支持的,也是评价小鼠肝组织病理学。此外,在最近的另一个研究中,托哈密et al。27]研究埃及的水提取物的抗氧化能力蜂花粉(WEBP)顺铂(CDDP)在多个器官和全身损害发现WEBP更强有力的恢复肝脏和睾丸的损害。

花粉的酚类化合物,取决于该地区的地理特点和植物(1]。最近,Ulusoy和Kolayli [13]研究了澳新银行花粉黑海地区的土耳其和发现TPC的澳新银行花粉GAE范围从44.07到124.10毫克/克,这是高于板栗花粉。蜂花粉的TPC也研究了Mărghitaşet al。28)使用12种花粉来自罗马尼亚。在这项研究中,GAE TPC的范围从6.40到16.4毫克/克干物质的花粉,花粉和柳树类型显示最高的总酚含量和抗氧化活性。在另一项研究中,酚类内容(多酚、黄酮醇、黄酮和二氢黄酮)和六个品种的蜂花粉的抗氧化活性研究索诺兰沙漠(14]。他们发现酚类含量介于15.91和34.85毫克之间GAE / g花粉、观察和一个伟大的变化在花粉样本。没有以前的研究发现对板栗花粉的酚含量和抗氧化活性进行比较我们的结果;然而,有一些研究板栗蜂蜜含有重要的酚类物质相关的生物活性,如抗氧化,抗菌,抗炎特性(29日,30.]。

我们测量的初始体重49的老鼠,我们研究了7组(G1-G7)和比较他们的权重(表7月底的一天2;补充表1)。在前两对照组大鼠生理盐水(G2)和橄榄油(G3)增加体重(0.7%)、乙醇(G3)组体重下降(5.5%)。与此同时,减肥中检测出所有的创新领导力₄又组织(G4-G7);CCl的未经处理的₄对照组(G4)和silibinin-treated集团(G5)显示最高的减肥和−−9.5%和8.2%,分别为(表2)。此外,显著减肥silibinin集团是由于严重腹泻,造成死亡1只老鼠(7)集团内部(G5)。与此同时,减肥是最少pollen-treated组(G6-G7)。美联储的花粉量越多,越少的老鼠的体重。这表明蜂花粉作为一种有效的创新领导力的营养补充₄暴露大鼠,没有任何实质性的副作用和死亡率。

等离子体的活动AST和ALT酶明显升高大鼠CCI对待₄由于毒性作用(表3)。虽然在对照组酶活性没有改变(G1-G3), CCI显著增加₄观察治疗组(G4-G7)。AST和ALT CCI酶活性明显增加₄管理组织,特别是在四国集团(CCI增加4 - 5倍₄只有集团)比对照组(G1-G3)。以防silibinin和蜂花粉的摄入量降低酶活性。ALT和AST酶是特定于肝损伤;他们经常用于测定肝脏损伤(31日]。蜂花粉时在更高的剂量400毫克/公斤/天,AST和ALT水平明显下降。在目前的研究中,silibinin-treated(50毫克/公斤/天)大鼠(G5)显示改善比低剂量pollen-treated(200毫克/公斤/天)组(G6);然而,作为一个重要的副作用,严重腹泻和减肥silibinin-treated检测组。此外,AST和ALT水平的提高在pollen-treated组(G6和七国集团(G7))的浓度与花粉的老鼠。

中蜂疗研究相关的预防和保护肝损伤和中毒,Turkez et al。10)表明,蜂胶提取物抑制间变性大细胞淋巴瘤引起的肝损伤引起的₃小鼠模型的治疗。同样,刘et al。(2012) (9)报道,槲皮素,一种抗氧化剂物质中发现蜜蜂产品,防止肝损伤lead-induced氧化。Kolankaya et al。32)表明,蜂胶齿栗叶的可能显示对饮酒导致的肝损伤的保护作用。El-Denshary et al。33)表明,食用蜂蜜消费减少对CCI的肝毒性₄全身的肝损伤。最近,有一些动物模型的研究表明,许多蜜蜂产品发挥治疗的潜力保护肝细胞的氧化损害(3,10,31日,32]。

脂质过氧化产物丙二醛(MDA),测定血浆,红细胞和肝组织的对待动物,分析通过CCI氧化应激诱导造成的损害₄治疗。肝组织中MDA的含量作为指标的脂质过氧化反应,这是一个众所周知的肝损伤的发生由于生成的活性物种34]。肝组织内没有检测到显著改变的MDA水平对照组(G1-G3),而病人组MDA水平显著增加(G4) G1-G3的近5倍。观察大量减少MDA水平的老鼠,它被暴露于silibinin和花粉组(G5-G7) ()。由于CCI₄治疗后,血浆MDA含量增加,红细胞,和肝脏,证明CCI₄脂质过氧化造成的。肝脏代谢中起着重要作用的异型生物质;因此,它很容易受到许多化合物,这是有毒的自己或产生代谢物,可以引起肝损伤(9,34]。silibinin效率与氧化应激在肝脏被报道在以前的研究12]。我们的研究结果清楚地表明,silibinin和蜂花粉是有效的防止脂质过氧化作用,诱导的氧化损伤,CCI₄。然而silibinin造成死亡率由于严重腹泻大鼠模型。

超氧化物歧化酶(SOD)是一种重要的抗氧化酶,保护生物体免受超氧化物自由基的有害影响形成的氧化应激(4]。在我们的研究中,没有发现显著差异在血浆SOD活动中,肝脏,和红细胞对照组(G1-G3),而在CCI SOD活性降低₄暴露组。SOD活性最低的是发现在大鼠暴露于CCI₄(G4)和组织的活动略有增加silibinin——和pollen-administered团体(G5-G7)。SOD是肝细胞生理合成类似于其他抗氧化酶;因此,蛋白质合成是负面影响CCI引起的肝细胞损伤的结果₄。然而,SOD活性增加花粉silibinin-treated组,可能由于肝细胞损伤的愈合。类似于我们的结果,它已经表明,SOD活性明显降低小鼠敌百虫处理,这是一个organopesticide,但显著增加团体中有松蜂蜜(3]。我们目前研究的结果与先前的研究一致的改变反应的氧化应激标志物的蜂疗(3,31日]。

显微镜检查显示肝实质和正弦曲线的肝细胞是健康对照组(G1-G3)(图1(一))。与此同时,明显损害CCI的肝脏中观察到的部分₄暴露组。常见的退化和明显的脂肪空泡形成观察病人的肝细胞组(G4)。血管堵塞在正弦曲线(图1 (b))。轻微程度的空泡的变性和肝细胞的脂肪空泡形成观察G5 (silibinin), G6,七国集团(pollen-administered组);然而,这些团体的空泡的变性程度低于G4。而且,组织学改善G7(400毫克/公斤/天)花粉是优于G6花粉(200毫克/公斤/天)(数据1 (c)和1 (d))。改善显著相关的蜂花粉数量的动物。组织学损伤计分和统计评价组表所示3。

肝细胞凋亡进行了分析使用终端原位脱氧尿苷三磷酸尼克末端标记(TUNEL)测定。凋亡细胞核的数量要高得多病组(G4)比对照组(数字2(一个)和2 (b));然而,凋亡细胞核的数量G5-G7 (silibinin -和pollen-administered组)相比,减少了病人得多组(G4)(数据2 (c)和2 (d))。在肝脏细胞凋亡值和统计分析的结果如表所示3。组织病理学损伤评分和TUNEL分析表明在肝脏组织损伤是更高的组织暴露于CCI₄,发现组织损伤是治疗组显著降低与花粉CCI₄曝光。细胞凋亡指数(AI)是组显著增加,暴露于CCI₄没有任何治疗(G4)相比,治疗组(G5-G7)(表3)。但是,这些治疗的AIs组比对照组至少5倍,CCl不暴露₄(G1-G3)。这表明的初始接触细胞CCI₄大大增加了肝细胞的凋亡;因此,治疗的老鼠silibinin或花粉不能完全颠覆CCI的毁灭性的影响_4所示。

实验性肝损伤模型主要是通过CCI暴露大鼠₄。它已经表明,脂质过氧化增加,氧自由基释放的大鼠暴露于CCI₄(7,8]。氧自由基的中介组织损伤。活性氧自由基引起的氧化损伤等细胞大分子核酸,蛋白质,脂类,最终导致细胞凋亡。氧自由基引起的脂质过氧化反应,一些代谢紊乱,并通过诱导膜功能异常和DNA损害(35]。脂质过氧化作用被认为是一个重要的原因破坏和损伤细胞膜,导致膜流动性和渗透性的变化。此外,脂质过氧化作用也增强了蛋白质降解率,提升者的最终裂解细胞(11]。我们的研究结果表明,水提取物抑制花粉CCI₄全身的凋亡细胞死亡和肝毒性。据报道,氧自由基在CCI扮演重要的角色₄全身的细胞损伤(7]。当细胞内氧自由基的数量正在增加,他们压倒了防御系统,导致氧化应激或细胞损伤,导致各种疾病的发展。因此,CCI₄全身的细胞凋亡与细胞内氧化应激和细胞内抗氧化剂可以保护肝细胞免受细胞CCI诱导细胞凋亡₄(9]。

4所示。结论

CCI₄肝毒素的代理,提高自由基的形成,导致脂质过氧化作用的细胞和器官损害。栗蜂花粉含有大量营养和拥有许多酚类化合物,高的抗氧化性能的因素。我们的研究清楚地表明,板栗蜂花粉产生高度有益的生物活性的保护肝细胞免受氧化应激和CCI引起的毒性₄曝光。因此,我们得出这样的结论:栗蜂花粉可以安全地包含在日常人类饮食作为一种食品添加剂,这将增强氧化应激的抑制作用。栗蜂花粉可以作为一个合适的替代silibinin治疗肝细胞病态。

确认

本研究支持Karadeniz技术大学研究基金会(项目没有。2009.111.002.5)。两个作者,Oktay Yildiz Huseyin领域,是由TUBITAK-BIDEB研究生学习。

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