在体外黄连生物碱提取物中抗肝脂肪变性活性成分的筛选——高效液相色谱法肝细胞提取法和游离脂肪酸诱导肝脂肪变性HepG2细胞法

摘要

建立了一种高通量筛选黄连生物碱提取物抗肝脂肪变性活性成分的方法。该方法结合了前面描述的两种检测方法:HepG2细胞提取(HPLC分析)和游离脂肪酸诱导的肝脂肪变性HepG2细胞检测。通过HepG2细胞萃取和高效液相色谱分析，鉴定出CAE中的两种生物碱小檗碱和黄连碱是HepG2的高亲和成分。在ffa诱导的肝脂肪变性HepG2细胞实验中，这些生物碱也被确定为有效的化合物，能够降低甘油三酯(TG)的积累。这种显著的抑制TG积累的作用()，黄连素和黄连碱在0.2μ和5.0克/毫升μ分别g / mL。在这些浓度下，观察到的效果与CAE在100.0时的效果相似μ克/毫升。CAE中的另外5种生物碱，巴马汀、表小檗碱、麻豆碱、columbamine和木兰碱，被发现对HepG2细胞的细胞成分有较低的亲和力，对TG积累的抑制较低。在CAE中发现两种有效的活性化合物，表明我们所开发的筛选方法是一种可行、快速、有用的工具，可用于研究中药治疗肝脂肪变性。

1.介绍

肝脂肪变性是一种以肝细胞内过度脂肪堆积为特征的疾病，正成为全球健康的严重威胁。尽管如此，目前还没有有效的治疗方法[1，2］.中药是肝脂肪变性的极好的替代和/或补充治疗方法[3.］.中国以前研究中药提取物的工作发现它们作为抗肝脂肪变性剂有效[4- - - - - -9］.但由于这些提取物的活性成分及多种成分的可能作用尚不确定，临床应用受到限制[10]因此，确定这些临床应用提取物中的活性成分是一个重要的研究途径。

为了确定这些中药提取物中抗肝脂肪变性的有效成分，我们开发了一种高通量筛选方案。本协议中的一种方法涉及使用感兴趣的成分的细胞提取结合高效液相色谱分析，以确定从多组分物质中哪一种成分与细胞成分有亲和力[11］.这种方法是基于活性成分对活细胞的亲和力，其中活性成分对细胞的亲和力最高，因此可以在药物与细胞系孵育后提取。细胞萃取与高效液相色谱分析的一般程序如下:细胞培养,细胞的药物是孵化,执行一个洗脱来删除任何东西绑定特异性较低的绑定,完成和目标提取的高亲和性结合蜂窝组件的高效液相色谱分析鉴定紧随其后。该方法已成功应用于中药活性成分的筛选[12，13］.

另一种用于确定抗肝脂肪变性药物的筛选方法是使用在体外游离脂肪酸- (FFA-)诱导肝脂肪变性HepG2细胞模型。本实验采用油红O染色和细胞内甘油三酯(TG)含量来评估化合物降低细胞内脂质水平的活性。该方法以前曾用于验证中药中各成分的活性[14，15］.

本研究将高效液相色谱法提取HepG2细胞和ffa诱导HepG2细胞肝脂肪变性两种方法相结合，建立一种筛选黄连生物碱提取物(CAE)抗肝脂肪变性活性成分的新方法。采用高效液相色谱法提取HepG2细胞，筛选对肝细胞具有高亲和力的CAE组分。然后通过ffa诱导的肝脂肪变性HepG2细胞实验验证了所鉴定成分的抗脂肪变性活性。

最近使用高脂饲料诱导高脂血症动物模型的研究表明，CAE可降低总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平[16］.此外，CAE对CCl有肝保护作用₄诱发急性肝损伤[17，18］.这些研究表明，CAE具有显著的肝保护作用，可用于治疗肝脂肪变性。然而，CAE是由多个组件组成的[19，主要有几种生物碱:小檗碱、巴马汀、黄芩碱、表小檗碱、黄连碱、哥罗巴胺和木兰碱。目前，只有在CAE中含量最高的生物碱小檗碱受到了广泛的关注，而其他生物碱的研究还很少。因此，我们采用我们的筛选方法来探索CAE中可能的抗肝脂肪变性活性成分。

2.材料和试剂

小檗碱、巴马汀、黄连碱、黄芩碱和木兰花碱(图1)，纯度为98%，购自成都中草药有限公司(中国成都)作为标准品。表小檗碱和哥仑巴胺由重庆市中药研究院提供。油酸钠和棕榈酸钠购自西班牙马德里Sigma公司。hplc级乙腈购自霍尼韦尔国际公司(Burdick & Jackson, Muskegon, MI, USA)。去离子水使用PURELAB Ultra GE MK2水系统(ELGA, High Wycombe, UK)进行净化。DMEM培养基来自Gibco。甘油三酯酶检测试剂盒来自南京建城生物工程研究所(中国南京)。所用的其他试剂至少为分析级。黄连样品由广州志信中草药有限公司提供，经广东药科大学中药学院生药学家李淑媛教授鉴定。

3.方法

３．１．CAE的制备及色谱分析

为了制备CAE，采用了一种模拟中医方法[20.］.将干根茎切成块，加入100 g加入600 mL 70%乙醇，25℃浸泡30 min。该混合物在回流下加热120分钟。过滤后，对残渣重复提取两次，共三次。然后将三种提取液合并，在减压下蒸发至体积为75 mL。用1%的乙酸还原醇提物，用1.0 mmol/L的盐酸调pH至3.0，加入6%的NaCl进行盐腌。该步骤的沉淀物在DZF-6021真空干燥箱(杭州利辉环境试验设备有限公司，中国杭州)下在40°C下干燥。

对于色谱分析，Dionex UltiMate 3000 (Dionex，德国)使用的高效液相色谱系统配备了Chromeleon软件(Dionex)，由四元泵、在线真空脱气器、自动进样器、恒温柱室和DAD组成。所有分离都是在DIONEX Acclaim C上进行的₁₈纵队(, 5.0μm)，柱温保持在30℃。流动相为乙腈-磷酸二氢钾溶液(0.015 mol/L) (40/60, v/v) (1.7 g/L十二烷基硫酸钠，磷酸调节至pH 3.0)，泵送流速为1.0 mL/min。注射体积为10μL，检测波长为270 nm。

３．２．细胞培养

人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞在37℃湿化5% CO中培养₂在高葡萄糖Dulbecco 's modified Eagle 's medium (DMEM)中添加10%胎牛血清(FBS)和1%的抗生素混合青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 mg/mL)。培养基每2天更换一次，直到细胞达到70%汇合，通常在初始播种后5-7天。在每次实验之前，细胞在无胎牛血清的情况下培养24小时。

３．３．肝细胞提取

在使用生物碱处理之前，HepG2细胞在细胞培养瓶中至少培养24小时。当HepG2细胞融合到70%时，用不同生物碱或DMEM单独作为阴性对照，在37°C下处理24小时。从每个实验瓶中制备细胞悬液，210 ×g离心10分钟。然后去除上清液，用2ml PBS (pH 7.4)洗涤剩余的小球5次，然后在210 ×g离心10分钟，以去除任何低亲和力结合的化合物。最后一种PBS洗涤液被收集，并作为高效液相色谱分析的低特异性参考。最后加入2 mL 75%乙醇裂解细胞球，反复冻融。该溶液在8000 ×g离心10分钟，上清液通过0.22过滤μ用高效液相色谱法分析。

CAE的工作浓度为100.0μg/mL，与HepG2细胞孵育，检测细胞活力。制备7种生物碱等浓度的混合标准工作液，与HepG2细胞在10℃下孵育μ克/毫升。此外，脂质调节剂gemfibrozil作为肝细胞提取的阳性对照，其工作浓度为100.0μg/mL，如前所述[21］.

3．4．细胞生存能力分析

在有或无生物碱的情况下，通过MTT法评估FFA诱导的HepG2细胞的细胞毒性 h、 二十 μ向每个孔中加入1 L MTT溶液，并在37°C下将培养板进一步培养4小时 h、 然后媒体被移除，100 μ加入L DMSO，轻轻摇匀5分钟。采用酶联免疫吸附测定法，在485 nm处测定光吸光度(Mithras LB 940, Berthold Technologies, Germany)。每个条件都是重复三次。

3.5。在体外Antihepatic脂肪变性试验

HepG2细胞接种于6孔板，密度为细胞在2.0 mL/孔10% FBS-DMEM培养基中孵育48 h。当细胞融合度达到80-90%时，用0.5 mmol/L油酸钠/棕榈酸钠(2:1)加不同生物碱溶液孵育24 h。将不同浓度的生物碱溶液应用于细胞，并在培养基中对每个样品进行预防性给药处理。对照组是在没有额外生物碱或CAE的培养基中暴露于0.5 mmol/L FFA的细胞，称为“模型组”。另一个对照组是用不含ffa的培养基处理的细胞。每组有6个平行孔。

将所有生物碱对照品溶解于DMSO中。在0.1%盐酸中制备适当浓度的CAE。为了研究生物碱对抗肝脂肪变性的剂量依赖性作用，制备了一系列浓度的生物碱和CAE。

3.6。细胞内TG含量及油红O染色

通过检测TG含量和Oil Red O染色检测HepG2细胞内脂质积累量。细胞内甘油三酯含量按厂家说明使用酶促铬甘油三酯测定试剂盒测定，并归一化至各实验样品的总蛋白含量。根据厂家说明使用BCA蛋白检测试剂盒(中国Cwbiotech)测定蛋白质含量。TG积累抑制率计算公式如下: 将样品固定在4%多聚甲醛中，用油Red O染色15 min。用异丙醇洗涤样品几秒钟，然后用三次蒸馏水洗涤。结果采用倒置荧光显微镜(德国HAL-100蔡司)测定。

3.7。统计分析

数据以均数±标准差表示。各实验组之间的统计学意义由使用SPSS软件(16.0版)的Student 's test决定，其中被认为具有统计学意义。

4.结果

4.1.CAE的色谱分析

优化了色谱参数，以实现对CAE溶液中所有7种生物碱的高分辨。7种生物碱均能在270 nm紫外检测器上得到清晰的分离和检测，如图所示2(一个)-第（A）行。参考标准品用于在100.0℃下定量CAE中的每种生物碱 μ克/毫升浓度。数据显示，生物碱含量最高的是小檗碱，为31.74μ克/毫升。其次是黄连碱和巴马汀，含量为10.64μ和9.10克/毫升μ分别g / mL。其他生物碱浓度较低，表小檗碱为4.56μg/mL, 1.44μg/mL，1.30时的木兰素 μg/mL, 1.10μ克/毫升。CAE的色谱图比较见图2(一个)-图中(A)线与混合参考标准2 (b)-Line (A)表明这7个生物碱是CAE中的主要峰，占CAE溶液的59.88%。

4．2．对HepG2细胞的细胞毒性作用

用0-2.0 mmol/L油酸钠/棕榈酸钠(2:1)处理HepG2细胞24 h，采用MTT法测定细胞毒性。FFA在浓度低于1.0 mmol/L时无细胞毒性。MTT法测定不同浓度生物碱和CAE联合0.5 mmol/L FFA的细胞毒性。结果表明，CAE对HepG2细胞无明显毒性，浓度达100.0μ克/毫升。在浓度小于50.0时，各生物碱对HepG2细胞均无细胞毒性作用μg/mL。

4．3．肝细胞提取

CAE肝细胞提取物的色谱图如图所示2(一个)．HepG2细胞变性后，在270 nm处HPLC检测到两个峰(图)2(一个)流程(B))。通过比较每个峰的保留时间与相应的标准(图2 (b)-第（B）行），峰5和7在26.4处被确定为黄连碱 最小和小檗碱含量为36.8 使用低特异性洗脱的色谱图（图2(一个)-线(C))以排除洗脱过程可能产生的混淆峰。同时，空白肝细胞提取不添加CAE或生物碱，以剔除细胞成分本身的任何峰(图)2(一个)流程(D))。低特异性洗脱和空白细胞提取均未发现CAE或生物碱的峰，其中小檗碱和黄连碱是CAE中含量最丰富的两种成分。下一步是探索测试化合物对细胞的亲和力是否与每个成分的浓度有关。因此，制备各生物碱浓度相同的混合参比生物碱溶液，10.0μg/mL，用上述方法处理HepG2细胞。使用这个参考溶液，我们确认了之前鉴定的高亲和力成分小檗碱和黄连碱从变性的HepG2细胞中提取(图)2 (b)-第（B）行）。这表明该物质的浓度与其结合亲和力之间没有相关性。此外，黄连素与黄连素在提取后的峰面积比比提取前的0.72高1.22。这表明黄连素与HepG2细胞的结合能力可能强于黄连素无论CAE中小檗碱的浓度如何。小檗碱和黄连碱被定义为能够与肝细胞高亲和力结合的成分，而其他五种生物碱可以低亲和力结合。吉非罗齐用作阳性对照证明从HepG2细胞中提取是成功的（图2 (c)）.

4.4。ffa诱导肝脂肪变性HepG2细胞模型

肝脂肪变性的一个特征是肝细胞内TG的异常积累。一个在体外在此之前，人们曾采用HepG2细胞法检测脂肪酸诱导的肝脂肪变性，并认为这是一种有效的筛选模型。据报道，以2:1比例外源性添加油酸/棕榈酸组成的FFA是诱导该条件的最优条件[22］.为了提高油酸和软脂酸在培养基中的溶解度，采用2:1油酸钠/软脂酸钠的FFA混合物，并进一步优化了浓度。研究发现，0.1 - 2.0 mmol/L浓度的FFA处理24 h可导致细胞内TG水平显著增加()，达到0.5 mmol/L的FFA。联合应用生物碱时，以0.5 mmol/L油酸钠/棕榈酸钠2:1浓度作为模型组的诱导浓度。油红O染色(图5 (b))显示，在0.5 mmol/L FFA条件下，HepG2细胞胞质中脂滴明显积累。

4.5.通过CAE和生物碱降低TG

首先，使用一系列CAE浓度处理肝脏脂肪变性HepG2细胞模型24 h。结果发现，CAE处理的浓度范围为12.5μ100.0 g / mLμg/mL有降低TG的作用，呈剂量依赖性，而50.0μg/mL达到显著的抑制作用()如图所示4．说明CAE具有抗tg积累的活性。

我们之前在CAE的色谱分析中发现了7个生物碱组成的主标记峰。因此，通过对每种生物碱的一系列浓度来评估每种生物碱的TG还原能力。各生物碱的相对含量在100.0范围内测定μ克/毫升CAE。各生物碱的浓度分别为0.2、1.0、5.0和25.0μg/mL，观察其对TG积累的抑制作用。表格1显示了各浓度系列生物碱的TG抑制活性。发现了几个主要结果。(1)小檗碱在0.2时对细胞内TG水平有较强的抑制作用，呈剂量依赖性μg/mL，显著性为和1.0μg/mL，显著性为．最高浓度为25.0μg/mL，抑制TG积累的能力为61.3%。(2)黄连碱对细胞内TG的抑制作用最强;然而，0.2的浓度没有剂量依赖效应μ25 g / mLμ克/毫升。在0.2μg/mL浓度下，黄连碱已显著()减少了48.9%的TG积累。然而，在浓度梯度的较低的末端(0.01)存在剂量依赖效应μ克/毫升(0.2)μ克/毫升()，在额外治疗期间。(3)虽然巴马汀、columbamine、表小檗碱和木兰碱对细胞内TG水平的降低也表现出剂量依赖关系，但仅在最高浓度5.0时μg/mL，这种降低是显著的(）.(4) Jateorhizine在0.2浓度范围内均不能抑制ffa诱导的肝脂肪变性模型μ25.0 g / mLμg/mL，且无剂量依赖性。为了更好地了解这7种生物碱的抑制活性，我们将每种生物碱在各检测浓度下的TG抑制率用趋势图表示(图)3.）.在5.0μg/mL浓度下，生物碱分为高活性组(黄连碱和小檗碱)和低活性组(其余生物碱)。黄连碱在0.2 ~ 0.2浓度范围内的抑制作用强于小檗碱μ1.0 g / mLμg/mL。与黄连碱和小檗碱相比，其他被测生物碱（不包括药根碱）对TG积累的抑制作用较弱。药根碱不能明显抑制TG积累。

4.6。生物碱组合物的TG还原能力

通过组合分析进一步验证黄连碱和小檗碱对TG积累的抑制作用，并评价两者之间是否具有协同或拮抗作用。黄连碱和小檗碱结合形成高亲和性生物碱组，而其他5种生物碱结合形成低亲和性生物碱组，其浓度以丰度为50.0为基础μ克/毫升CAE。TG还原结果如图所示4．高亲和生物碱组对降低TG有明显的抑制作用()，而低亲和生物碱组仍然没有明显的抑制作用。与黄连碱和小檗碱单用相比，黄连碱和小檗碱联合组TG的降低量没有增加，说明这些生物碱对TG的积累没有协同作用。支持这些结果，油红O染色(图5结果表明，CAE、小檗碱、黄连碱及黄连与小檗碱联合治疗组脂滴明显降低，而低亲和生物碱联合治疗组脂滴作用较弱。

5.讨论

口服药物的新陈代谢始于吸收进入血液，在血液中药物维持其摄入状态或代谢，然后进入器官和细胞。在本研究中，进行了全面的药代动力学研究。原型生物碱，包括jateorhizine，小檗碱，黄连碱和巴马汀，以前已经在口服乌吉丸后的大鼠血浆中通过LC-MS/MS鉴定和定量[23］.泻心汤对大鼠的进一步研究发现，其中三种生物碱，黄连碱，巴马汀和小檗碱，在大鼠尿液中检测时仍保持其初生形态[24］.这些结果表明，黄连素和黄连碱不能在血液中代谢，而是以原来的形式从尿液中排出。这说明黄连素和黄连碱可以到达肝脏和肝细胞。因此，我们在工作中证明的高亲和力相互作用应该会发生。这里研究的其他生物碱要么不能进入血液，要么对肝细胞没有亲和力。

之前的研究已经发现黄连素影响葡萄糖代谢，导致胰岛素分泌增加，脂肪生成抑制，线粒体功能抑制，5 '腺苷单磷酸激活蛋白激酶(AMPK)通路激活[25- - - - - -28］.小檗碱的这种抗糖尿病和胰岛素增敏作用已经在一些相对较小、短期的临床试验中得到证实[29］.到目前为止，从CAE中提取的其他生物碱对脂质调节的报道很少。在我们的实验中，黄连碱的降脂作用优于小檗碱。一些关于黄连碱药理活性的研究报道了其血管松弛作用[30.，一种保护心脏的作用[31，一种抗糖尿病作用[32和抗菌作用[33］.这提示黄连碱作为一种抗肝脂肪变性药物值得进一步研究。而其他生物碱，包括巴马汀、麻黄碱、表小檗碱、哥罗巴胺和木兰花碱，也具有一定的降脂活性。结果表明，其他5种生物碱抗肝脂肪变性活性较弱，且无明显的协同作用。

CAE中7种生物碱的结构与活性之间的关系是非常有趣的。这七种都是苄基四氢异喹啉生物碱的衍生物。然而，由于替换组的存在，它们之间存在微妙的差异(图)1)，这导致了我们在实验中观察到的亲和力和活动差异。结构分析表明，黄连素和黄连碱在C2、C3处有一个共同的亚甲基二氧基，与其他生物碱不同。结构与功能关系的研究表明，亚甲基二氧基被取代后，生物碱的抗菌活性增强。与此同时，被甲氧基取代的毒性效应增加[34，35］.对小檗碱的研究也表明，C2和C3中的亚甲基二氧基是抗菌药物的重要基团[33]及抗真菌特性[36］.此外，五味子素的研究表明，亚甲基二氧基在肝线粒体还原谷胱甘肽(GSH)刺激活性中发挥重要作用[37］.这些结果提示亚甲二氧基可能是抗肝脂肪变性的关键活性基团。此外，黄连碱除了在C2, C3处有一个常见的亚甲基二氧基外，在C9, C10处还有一个亚甲基二氧基，而小檗碱在C9, C10处有一个甲氧基。

肝细胞内脂质代谢主要受细胞内脂质稳态的调节。脂肪酸β-氧化和VLDL设备都位于细胞质内。调节脂肪生成的核受体也位于细胞质中，包括SREBP-1C、PPAR-α，和LXR [1，2］.因此，抗肝脂肪变性药物必须表现出对细胞膜的亲和性或进入细胞内才能起作用。高效液相色谱法提取肝细胞是一种筛选对肝细胞有高亲和力成分的方法，该方法适用于抗肝脂肪变性研究的筛选。为了增加这种方法的特异性，在体外FFA诱导的HepG2肝细胞脂肪变性也被用作肝细胞提取后的评估工具。由于在筛选和评估中使用了相同类型的细胞，因此保证了两种方法之间的一致性。相信该方法将是适用的，并且是研究其他多组分脂肪变性的有力工具中药提取物，如黄酮、皂甙和萜烯酸。

利益冲突

两位作者宣称没有相互竞争的经济利益。

致谢

这项工作得到了广东省教育部、教育部、中国研究部（2011B090400、79）、中国广东省自然科学基金项目（10351022401000000）、中国广东省自然科学基金项目的资助。（S2012010009288和S2013010015021）。

参考文献

1. S. C. Matherly和P. Puri，《单纯性肝脂肪变性的机制:毕竟不是那么简单》肝病临床，第16卷，第5期。3，页505-524,2012。视图:谷歌学者
2. B. W. Smith和L. A. Adams，《非酒精性脂肪性肝病和糖尿病的发病机制和治疗》，自然评论内分泌学，第7卷，第5期8，第456-465页，2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
3. 史克强，范永昌，刘文银等，“中药对非酒精性脂肪肝的治疗作用:系统综述和荟萃分析，”分子生物学报告第39卷第3期10, pp. 9715-9722, 2012。视图:谷歌学者
4. Z.-Q。Xie, G. Liang, L. Zhang et al.，“低胆固醇作用的分子机制银杏叶肝细胞提取物:与洛伐他汀的比较研究Pharmacologica学报，第30卷，第2期9, pp. 1262-1275, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
5. “转录组分析揭示了多种调节效应银杏叶在高脂肪饮食的老鼠肝脏中提取的2月期刊第276卷第2期5, pp. 1450-1458, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
6. 潘世耀、余振林、董汉强、向春杰、方文福和高国明，“五味子乙醇提取物降低高脂/高胆固醇饮食喂养的小鼠肝脏甘油三酯水平，注意急性毒性，”循证补充和替代医学， 2011年第1期，文章编号729412,6页，2011年。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. J.-Q。王佳丽，李玉华。“黄酮类化合物的预防作用木姜子属一家韩国高脂饮食大鼠肝脏脂肪变性水平的研究民族药物学杂志号，第121卷。1, pp. 54-60, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
8. 洪兴国，唐华，吴磊，李爱玲，“紫花苜蓿的保护作用泽泻胶实验性非酒精性脂肪肝提取物《药学与药理学杂志》，第58卷，第2期10，第1391-1398页，2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. 》。元,H.-Y。元,工程学系。钟,G.-Z。金,G.-C。“活跃的一部分艾sacrorumledeb。通过激活人HepG2细胞中amp激活的蛋白激酶，减少肝脂积聚。生物科学、生物技术和生物化学第74卷第1期2，页322 - 328,2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. 冯颖，林欣欣，沈玲，洪玉玲，“多成分中药的药效研究”，《中国药理学报》，中国中药杂志第38卷第2期5, pp. 629-632, 2013。视图:谷歌学者
11. S.-L。李鹏，李丽华。盛,R.-Y。李,L.-W。气,L.-Y。“活细胞提取和HPLC-MS分析预测中药生物活性成分”，医药与生物医学分析杂志号，第41卷。2，页576-581,2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
12. 杨晓霞，张玉玲，张晓霞和李晓楠，“细胞膜色谱及其在中药生物活性成分分析中的应用，”中国药理学杂志，第20卷，第2期。1, pp. 20-25, 2011。视图:谷歌学者
13. m .香港H.-Y。妈,X.-R。吴,Y.-Q。朱秋华和h - w。“建立了肝细胞提取结合高效液相色谱法筛选中药潜在活性成分的方法青蒿作为一种典型的方法，”分子，第十七卷，第二期2, pp. 1468-1482, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. Liu y, D. Wang, D. Zhang, et al.，“蓝莓多酚化合物对油酸诱导的肝脂肪变性的体外抑制作用，”农业与食品化学杂志，第59卷，第59期22, pp. 12254-12263, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. 刘建福、马友友、王友友、杜志勇、沈建康和彭海丽，“木犀草素减少HepG2细胞中的脂质积聚与激活AMPK和减轻氧化应激有关。”植物疗法的研究，第25卷，第2期4, pp. 588-596, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
16. 谢伟，顾东，李军，崔凯，张颖，“黄连素和黄连素的作用及作用机制黄连高脂日粮喂养C57BL/6J小鼠肠道微生物与肥胖的关系《公共科学图书馆•综合》，第6卷，第2期9、文章编号e24520, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. 冯颖，王宁，叶旭东等，“肝保护作用及其可能机制黄连四氯化碳水提物对大鼠慢性肝毒性的影响民族药物学杂志，第138卷，第3期，第683-690页，2011年。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. 叶玉云，冯玉云，汤玉云等，“肝保护作用”黄连水提取物对四氯化碳诱导的大鼠急性肝毒性的影响民族药物学杂志号，第124卷。1, pp. 130 - 136,2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
19. D.Wang，Z.Liu，M.Guo和S.Liu，“电喷雾串联质谱法对黄连中生物碱的结构阐明和鉴定，”质谱学杂志第39卷第3期11，页1356-1365,2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
20. Cao Y.， Bei W.， Hu Y. et al.，“黄连生物碱低胆固醇血症与高脂血症大鼠CYP7A1上调胆汁酸相关”，植物学期刊第19卷第2期8-9，第686-692页，2012。视图:谷歌学者
21. K. Pahan, M. Jana, X. Liu, B. S. Taylor, C. Wood, S. M. Fischer，“Gemfibrozil，一种降脂药物，抑制人体星形胶质细胞中一氧化氮合酶的诱导”生物化学杂志，第48卷，第48期277，页45984-45991,2002。视图:出版商的网站|谷歌学者
22. 黄永发。褚海华，叶玉英等，“五味子素B对游离脂肪酸诱导的L-02细胞脂肪变性的抑制作用”，世界胃肠病学杂志，第十七卷，第二期19, pp. 2379-2388, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
23. Yuan J.， Wang Y.， R. An et al.，“液相色谱-串联质谱法同时测定大鼠血浆中6种生物碱和1种单萜的含量及口服乌己丸后的药动学研究”，色谱学报B， vol. 895-896, pp. 154-161, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
24. 谭b，马玉英，石仁，王涛，“高效液相色谱法同时测定大鼠尿液中黄连三种生物碱:在药动学研究中的应用”，生物制药和药物处置第28卷第2期9，页511-516,2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
25. L.-J。邢林，张磊，刘涛。华,P.-Y。Zheng, and G. Ji，“黄连素通过上调非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝脏IRS-2 mRNA表达降低胰岛素抵抗”，欧洲药理学杂志，第668卷，第2期3, pp. 467-471, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
26. “小檗碱减少MTTP启动子甲基化和减轻高脂饮食诱导的大鼠脂肪肝，”脂质研究杂志第51卷第1期9, pp. 2504-2515, 2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
27. 唐建军，冯玉峰，曹士生，黄连素与黄连作为新型抗肿瘤药物的研究进展，中药与生物医学研究进展，民族药物学杂志第126卷第1期1，第5-17页，2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
28. 何福明，廖玉华，杨亚杰等，“葛根春连汤的抗动脉粥样硬化作用和肝细胞AMPK依赖性降脂作用，”民族药物学杂志，第142卷，第2期。1, pp. 175-187, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
29. A.F.Cicero和E.Tartagni，“小檗碱的抗糖尿病特性：从细胞药理学到临床效应，”医院执业，第40卷，第5期。2, pp. 56-63, 2012。视图:谷歌学者
30. “黄连碱对大鼠主动脉环血管舒张作用的机制分析”，国家自然科学基金项目，美国中医杂志，第40卷，第5期。2, pp. 309-320, 2012。视图:谷歌学者
31. l l。锣,L.-H。方,S.-B。Wang等，“黄连碱通过抗氧化和抑制RhoA/Rho激酶通路对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌梗死发挥心脏保护作用，”动脉粥样硬化第222期1, pp. 50-58, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
32. H. A. Jung, n.y. Yoon, H. J. Bae, b.s。Min, and J. S. Choi，“黄连生物碱对醛糖还原酶的抑制活性”，药物研究档案第31卷第1期11, pp. 1405-1412, 2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
33. 严冬，金朝华，许晓华。肖,X.-P。董，“黄连素生物碱的抗菌性能黄连法国通过微量热法”,生物化学与生物物理方法杂志，第70卷，第2期6，页845-849,2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
34. c c。林丽婷，吴丽婷，方芳。许,D.-E。Shieh, L.-C。“细胞毒性作用黄连和淫羊藿sagittatum提取物及其主要成分(小檗碱、黄连碱和淫羊藿苷)对肝癌和白血病细胞生长的影响临床和实验药理学和生理学第31卷第1期1-2，页65-69,2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
35. 韩颖，闫东，赵颖，彭春生，肖欣，“原小檗碱的毒性作用黄连在四膜虫thermophila男朋友₅基于微量热法的生长:一种可靠的结构-功能关系评价方法，”热分析与量热计杂志，第108卷，第108号1, pp. 341-346, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
36. “小檗碱的抗真菌作用白色念珠菌通过微量热法和对应分析，热分析与量热计杂志第102卷第1期1，页49-55,2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
37. “五味子素B增强大鼠心脏和H9c2细胞线粒体功能和谷胱甘肽状态以及热休克蛋白表达的结构决定因素”，Ko K. M.和P. Y. Chiu，“五味子素B增强大鼠心脏和H9c2细胞线粒体功能和谷胱甘肽状态以及热休克蛋白表达的结构决定因素”分子与细胞生物化学第276卷第2期1-2，页227-234,2005。视图:出版商的网站|谷歌学者

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