文摘

海人酸(KA)是一种神经毒素,诱发癫痫发作,会引起海马。针灸是常用的作为替代治疗癫痫,和大家都知道保护海马神经元对KA毒性。利用蛋白质组学分析,我们研究蛋白质表达海马体在HT8针灸刺激后的变化。八周大的雄性C57BL / 6小鼠(20 - 25克)接受了针灸治疗在HT8穴位双边每天一次3天,然后被注射KA(30毫克/公斤)腹腔内。24小时KA注射后,海马的神经元生存和星形胶质细胞激活测量,和蛋白表达在海马体被二维电泳。针灸刺激在HT8抑制KA-induced海马神经元死亡和星形胶质细胞的激活。我们确定了11个蛋白的表达变化的KA或针灸刺激HT8,发现针灸刺激HT8规范化dihydropyrimidinase-related蛋白2的表达和调节转录激活蛋白的表达pur-alpha,丝氨酸/ threonine-protein磷酸酶5和T-complex 1亚基蛋白α相关神经元的生存。这些结果表明,针灸刺激在海马体HT8改变蛋白质表达谱的神经元生存KA-treated老鼠。

1。介绍

海人酸(KA)是一种强有力的兴奋剂α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic酸(AMPA) / kainate受体。KA管理的常见诱发癫痫发作和excitotoxic海马的细胞死亡,类似于观察颞叶癫痫患者(1,2]。因此被广泛用于癫痫动物研究作为触发引起颞叶癫痫动物模型(3]。

针灸已经被用于缓解各种神经系统疾病,包括癫痫和癫痫(4),但针灸治疗癫痫的机制仍然是难以捉摸的。在穴位,HT8被用作癫痫治疗穴位。在KA-induced癫痫发作动物研究、针灸刺激在HT8减少癫痫发作的严重程度,调节GABA-mediated信号通过增加谷氨酸脱羧酶(5,抑制KA-induced海马细胞死亡通过抑制小胶质细胞激活和细胞因子(6]。这些结果表明,针灸刺激从KA HT8保护海马细胞毒性,但它仍然是未知的蛋白质相关针灸刺激的作用。

二维电泳分离蛋白质(2 de)是一种方法基于电荷和分子量等复杂的蛋白质混合物从生物样品中提取的细胞和组织,并且这种方法可以检测蛋白表达水平和亚型的变化。使用这种技术,我们调查了acupuncture-associated蛋白质组剖面的变化在海马体KA-induced癫痫的小鼠模型。

2。方法

2.1。动物和分组

雄性C57BL / 6小鼠(8周大,体重20 g;东方生物有限公司、韩国)被安置在室温(22±3°C)下一个标准12 h光/暗周期(灯在h 07:00)无限制地食物和水。动物是依照当前准则成立于美国国立卫生研究院指导的实验室动物保健和使用(NIH没有出版。1985年85 - 23日),所有的努力都是尽量减少动物的痛苦,减少实验用动物的数量。老鼠被随机分配到四组:生理盐水组( )被注射生理盐水和没有接受针灸刺激;卡组( )被注射KA(σ,圣路易斯,密苏里州)和未接受针灸刺激;的 集团( )被注射KA和接收在穴位针灸刺激双边HT8;和 集团( )被注射KA和接收在穴位针灸刺激双边ST36作为针灸刺激对照组。

2.2。针灸刺激

10点到10点半。的老鼠 群被助理轻轻固定化抓住耳朵背后的松散皮肤用拇指和食指,和针灸针(0.18×8毫米;Dongbang针灸,Inc .)、韩国)插入在双边HT8穴位。HT8位于手掌表面,前肢之间的第四和第五掌骨骨(7]。针被插入的深度1毫米的速度被两个旋转和counter-spins每秒30年代,与之后立即删除。整个刺激持续了60年代。为 组,应用于穴位ST36相同的过程。ST36位于近五分之一点在直线上的抑郁外侧髌骨韧带前脚踝的折痕(7]。在老鼠身上穴位的位置在人类解剖学上对应的位置。刺激重复了三次:一天一次3天。动物的生理盐水和KA组固定在60年代类似的方式。

2.3。海人酸注入

三十分钟后针灸刺激,KA(30毫克/公斤的免费的基础;σ)腹腔注射胰岛素注射器BD超细二世(Becton,迪克森和公司,富兰克林湖,新泽西,美国)到KA的老鼠, , 组。生理盐水组的小鼠注射生理盐水代替KA。

2.4。免疫组织化学

24小时后注射KA,老鼠( 从每组)和4%多聚甲醛灌注溶解在0.1磷酸盐缓冲剂(PB)。大脑被移除的头盖骨,后缀一天,洗0.1 PB,沉浸在30%的蔗糖溶液在分割之前存储在4°C。冻结部分(40μ使用徕卡m)被削减CM3050S低温恒温器(徕卡微系统公司,位于德国)。

识别海马的神经元退化,甲酚紫染色。部分是安装在silane-coated幻灯片,风干,孵化1分钟解决1%甲苯基紫罗兰。接下来,该部分在冷自来水清洗彻底,一度在1%醋酸溶液清洗10年代,沉浸在提升等级的酒精脱水,二甲苯清除,使用安装介质盖玻片。

检测海马星形胶质细胞的激活,孵化了部分glial-GFAP(美国细胞信号技术,贝弗利,MA)主要抗体稀释1:1000 24小时在4°C。洗后在0.05 M磷酸盐(PBS)的部分与生物素化的孵化anti-rat免疫球蛋白(向量实验室,Inc .,伯林盖姆,CA)在室温下1 h,然后孵化与ABC试剂(向量实验室)在室温下1 h。在PBS的部分被洗,孵化diaminobenzidine 0.02%和0.003%过氧化氢在0.1 M Tris-HCl-buffered盐水(pH值7.5)5分钟,冲洗PBS,安装在gelatin-coated幻灯片,脱水,脱水,盖玻片。

使用亮场组织学图片拍摄,相差Axio范围A1显微镜(卡尔蔡司、从、德国)和Axiocam ICc3相机(卡尔蔡司)。海马细胞死亡和星形胶质细胞的激活是量化的光密度的海马CA3使用Image-pro + 6.0(美国马里兰州银泉的媒体控制论)。

2.5。二维凝胶电泳

24小时注射KA后,盐水的老鼠,KA, 组( 从每组)被有限公司2气体;大脑立即迅速从头盖骨中删除,和海马体中提取,并存储在−80°C到使用。

海马是均质直接由电机驱动的均质器(PowerGen125,费舍尔科学,匹兹堡,美国)在样品溶解溶液组成的7 M尿素,2 M包含4%硫脲 3 - ((3-cholamidopropy) dimethyammonio] 1-propanesulfonate(家伙),1% 二硫苏糖醇(DTT)和2% 苯甲脒pharmalyte和1毫米。蛋白质提取与涡流一小时在室温下。在15000×g离心后一小时15°C,不溶性物质都被丢弃而可溶性分数用于二维凝胶电泳。蛋白质浓度由布拉德福德化验方法(8]。

IPG干条(十问IPG 24厘米,Genomine,韩国)和7 M尿素平衡12 - 16个小时,2 M硫脲包含2%的家伙,和1%的德勤,pharmalyte 1%,分别,载有200人μ克的样品。等电点聚焦(IEF)在20°C使用Multiphor II电泳装置和每股收益3500 XL电源(Amersham生物科学,乌普萨拉,瑞典)根据制造商的指示。能源论坛的合作,电压是线性从150增加到3500 V为示例条目在3个小时之后,3500 V不变,后与集中完成96套。第二个维度之前,在平衡缓冲条孵化了10分钟(50 mM Tris-Cl pH6.8包含6 M尿素,2% SDS,和30%甘油),首先是德勤1%,第二个2.5%碘乙酰胺。平衡将被插入到sds - page凝胶(20×24厘米,10 - 16%)。sds - page都使用了Hoefer居屋单位2 d系统(Amersham生物科学)根据制造商的指示。二维凝胶在20°C 1700 Vh和二维凝胶被沾Coomassie G250所描述的安德森et al。9]。

定量分析的数字化图像进行了使用一个(7.0版本,Bio-Rad、大力神、钙、美国)软件根据制造商提供的协议。每个点的数量是总有效点强度归一化。蛋白质斑点倾斜超过1.4倍的表达水平与控制或正常样本选择的显著表达差异。

2.6。肽质量指纹

蛋白质肽质量指纹鉴定(及),蛋白质斑点被切除,用胰蛋白酶消化(WI Promega,麦迪逊,美国),混合着α-cyano-4-hydroxycinnamic酸在50%乙腈/ 0.1%三氟乙酸,并受MALDI-TOF分析(Microflex探测器20日力量Daltonics, Billerica,妈,美国)所描述的费尔南德斯et al。10]。每光谱光谱收集从300年拍摄结束了 600 - 3000范围和校准两点内部校准使用胰蛋白酶自身消化的峰值( 842.5099,2211.1046)。峰列表生成使用Flex 3.0分析。阈值用于挑选峰值如下:500年的最小分辨率单一同位素的质量,5 。搜索程序的吉祥物,由矩阵科学(http://www.matrixscience.com/),用于蛋白质及鉴定。以下参数被用于数据库搜索:胰蛋白酶酶裂开,最多一个错过的乳沟,碘乙酰胺(半胱氨酸)作为一个完整的修改,氧化(遇到)作为部分修改,单一同位素的质量,质量公差达±0.1。是概率评分及验收标准。

2.7。西方墨点法

anti-PURA主要抗体购自细胞信号技术(美国贝弗利,MA)和anti-PP5抗体来自Abcam(英国剑桥)。免疫印迹,样品(50毫克的蛋白质)加载到10% sds - page。分离后,蛋白质被转移到NC膜。1 h RT的膜动摇了TBS Tween-20含有0.1%,5%脱脂牛奶,0.2% BSA。1 h RT的膜是孵化主要抗体(anti-PURA或anti-PP5, 1: 1000)在TBS Tween-20含有0.1%。主要的抗体检测与HRP-conjugated二级抗体(anti-rabbit, 1: 1000),然后可视化与发射极耦合逻辑(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。这些墨迹图然后reprobed反β肌动蛋白抗体(1:1000;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)。乐队的强度检测蛋白质被微测量。

2.8。统计分析

所有数据都表示为 。并分析了单向方差分析Neuman-Keuls posthoc测试。所有统计测试执行使用棱镜5为Windows (GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)。统计学意义是 。

3所示。结果

3.1。针灸对KA-Induced海马细胞死亡的影响

我们评估了KA-induced CA3使用甲苯基紫染色细胞死亡。因此,在KA CA3区域的光学密度( %), ( %)组显著降低( 与生理盐水组),而密度 组显著升高( %)相比,在卡组( ,图1)。


图1
神经保护作用的针灸刺激穴位HT8在海马CA3区海人酸(KA)管理。KA破坏海马的神经元,而针灸刺激HT8阻止这种破坏。生理盐水:saline-injected对照组;KA, KA-injected组; :针灸与KA HT8注射组:和 ,针灸在ST36 KA注射组。比例尺代表200μm。数据表示为 。* 与生理盐水组。# 与卡组。 兑 组。
3.2。针灸在海马区GFAP表达的影响

KA的光学密度( %), ( %)组明显高于生理盐水组( %, )。然而,密度显著降低 集团( %)的价格相比KA和 组( 对每组,图2)。


图2
星形胶质细胞的激活在海马体海人酸(KA)管理。KA调节海马区GFAP激活,而针灸刺激HT8阻止这种激活。生理盐水:saline-injected对照组;卡:KA-injected组; 针灸与注射KA HT8集团;和 :针灸与KA ST36注射组。比例尺代表50μm。数据表示为 。* 与生理盐水组。# 与卡组。 兑 组。
3.3。在海马蛋白质差异表达

获取蛋白质的每组,2 de进行蛋白质提取物海马体。大约600多肽斑点可以显示在pH值3 - 10区间与Coomassie G250染色(数字3(一)和3(b))。复制地图匹配后,微分变化强度在盐水的老鼠,KA和 蛋白质组仅限于11:valosin含蛋白质(VCP) ubiquitin-like modifier-activating酶1同种型1 (ULMAE-1)、ATP合酶亚基d (ATP),热休克蛋白70 kDa 4 l (HSP70),热休克蛋白4,同种型CRA_c (HSP4L) dihydropyrimidinase-related蛋白2 (CRMP-2)、转录激活蛋白pur-alpha(对于),丙酮酸脱氢酶蛋白质X分量(PDX)丝氨酸/ threonine-protein磷酸酶5 (PP5), 1亚基α(TCP-1 T-complex蛋白质α),但一个个蛋白质LOC433182 (LOC433182)。相比VCP盐水组的表达,在卡组显著增加( )。在 集团也略有增加,但并不显著。ULMAE-1的表情,atp、HSP70和HSP4L KA和 组,生理盐水组相比均有显著下降。CRMP-2实际上是下降了KA注入( ),但针灸刺激在HT8明显恢复( 和KA集团)。对于水平、PDX PP5 TCP-1α注射KA, LOC433182持平,但针灸刺激在HT8显著增加(表1,数据3(c)和3(d))。

表1
差异表达蛋白质的蛋白质斑点在HT8针灸刺激后。

图3
蛋白质概况与微分表达式。(一)海马组织蛋白质概要文件获得在不同π范围。(b)的代表确认差异蛋白质斑点(红色)在二维凝胶模板在盐水中,KA和 组。11 (c)差异表达谱蛋白质。箭头上裁剪的图像二维凝胶代表蛋白质斑点显示不同的变化在盐水中,KA和 组。(d)表达下调或调节蛋白质的定量分析海人酸(KA)并在HT8针灸刺激。现场强度来自Coomassie-stained二维凝胶。VCP: valosin含有蛋白质;ULMAE-1, ubiquitin-like modifier-activating酶1;1对碘氧基苯甲醚ATP, ATP合酶亚基d;HSP70: 70 kDa热休克蛋白4 l;CRA_c HSP4L:热休克蛋白4对碘氧基苯甲醚;CRMP-2: dihydropyrimidinase-related蛋白2;对于:转录激活蛋白Pur-alpha; PDX: pyruvate dehydrogenase protein X component; PP5: serine/threonine-protein phosphatase 5; TCP-1α:T-complex蛋白1α亚基;蛋白质LOC433182 LOC433182:无特征。数据表示为 。* 和* * 与生理盐水组。# 与卡组。
3.4。确认改变蛋白质的免疫印迹分析

为了验证蛋白质组学分析的可靠性,对于和PP5被选为代表蛋白质和受到西方墨点法。一式三份西方的结果能够从海马体使用蛋白质提取的蛋白质生理盐水的老鼠,KA和 组2 de的一致(图4)。


图4
蛋白质组结果的验证使用免疫印迹分析对于和PP5蛋白在小鼠的海马。相同的趋势中发现2 de分析证实了这两种蛋白质。对于:转录激活蛋白Pur-alpha。PP5:丝氨酸/ threonine-protein磷酸酶5。数据表示为 。* 与生理盐水组。# 与卡组。

4所示。讨论

我们的结果表明,针灸刺激HT8防止KA-induced海马神经元死亡和星形胶质细胞的激活。海马的蛋白质表达谱的盐水,KA, 组使用2 de相比,MALDI-TOF分析、肽指纹女士,十一个差异表达蛋白质。

在excitotoxin-induced神经退化、小胶质细胞和星形胶质细胞被激活,导致海马神经元死亡通过诱导的炎症介质(11]。卡是一个excitotoxin, KA管理导致癫痫发作和激活小胶质细胞和星形胶质细胞在海马体。因此失活的小胶质细胞和星形胶质细胞起着重要的作用在减少KA-induced神经细胞死亡(12]。在这项研究中,我们证实了KA诱发神经元死亡和星形胶质细胞的激活在HT8海马体和针灸刺激可以抑制它们。这一结果表明,针灸刺激在HT8抑制KA-induced海马CA3的神经细胞死亡,和星形胶质细胞的失活可以占针灸刺激的神经保护作用。

VCP是ubiquitin-dependent atp酶参与蛋白质溶解通过泛素蛋白酶体系统与囊泡运输和融合(13),26 s蛋白酶体功能,和过氧物酶体组装14]。它扮演着一个重要的角色在ubiquitin-mediated蛋白质降解途径在神经退行性疾病15)和KA管理VCP水平的增加,导致内质网(ER)压力(16]。在这项研究中,KA管理显著增加VCP表达式;在HT8增加抑制了针灸刺激。因此,针灸刺激在HT8可能减少KA-induced ER应激通过抑制VCP表达式。

CRMP-2, collapsin响应中介蛋白质家族,导致轴突引导和生长和大脑内最丰富的CRMP家庭成员(17]。CRMP-2蛋白质水平的变化是相关的神经退行性疾病(18],upregulation CRMP-2有助于神经保护行动的活性氧(ROS)的压力(19]。KA增加活性氧的生产(20.),因此upregulation CRMP-2可能导致神经元死亡的抑制KA毒性。我们发现针灸刺激HT8恢复CRMP-2水平下降了KA管理,这意味着恢复CRMP-2级别的针灸刺激导致了对KA毒性神经保护作用。

对于结合sequence-specific单链脱氧核糖核酸或核糖核酸和影响DNA复制和基因转录的起始,尤其是海马CA3区(21]。对于减少突触后密度的减少蛋白9522),导致神经细胞丧失后癫痫持续状态(23)和KA管理(24]。丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PP5,广泛表达于大脑海马包括(25)和抑制细胞凋亡的调节c-Jun n端激酶磷酸化(26)和细胞凋亡信号调节激酶1活动(27]。T-complex蛋白1 (TCP-1) chaperonin家庭成员,正确折叠的蛋白质(28),支持本机的维护形式的细胞骨架蛋白(29日],所有TCP-1子单元的超表达抑制Neuro2a polyglutamine-expansion蛋白质的细胞毒性引起的细胞死亡(30.]。综上所述,对于增加,PP5, TCP-1有可能保护海马神经元对KA毒性。在这项研究中,针灸刺激在HT8调节对于的水平,PP5, TCP-1α,这可能有助于抑制海马神经元死亡KA引起的。

总之,这项研究表明针灸刺激与KA-induced HT8保护海马神经元损伤,而且acupuncture-mediated神经保护可能是由于,在某种程度上,改变表达式的规范化VCP CRMP-2,它们与细胞死亡机制后KA管理。此外,我们建议,对于PP5 TCP-1αupregulation在HT8针灸刺激可能是一个重大事件在针灸的神经保护作用。

免责声明

投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表。

利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益或利益冲突存在。

承认

这项研究受到了基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部、科学技术(号。2010 - 0021190和2005 - 0021190)。