文摘
果胶酯酶抑制剂(PEI)隔绝果冻图(热带榕属植物awkeotsang牧野)是一种可食用的组成部分在亚洲很受欢迎的饮料消费。乙型肝炎病毒(HBV)感染是普遍的在亚洲,和当前治疗乙型肝炎病毒感染需要改进。本研究旨在评估裴对乙型肝炎病毒的表面抗原表达的影响(表面)。人类肝癌细胞株Hep3B Huh7担任体外模型评估细胞毒性和表面抗原表达。主要从小鼠肝细胞培养的文化作为正常。细胞生存能力是衡量3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)比色测定。HBsAg表达式是评估通过测量表面分泌到培养基使用酶联免疫吸附试验。结果表明,裴并不影响的可行性人类肝细胞肝癌细胞株或主老鼠。裴抑制肝癌细胞系中表达窝藏内生(Hep3B)和集成(Huh7)乙肝病毒基因组的浓度和时间的方式,因此暗示一个普遍的活动对HBV基因表达。总之,它表明,贝聿铭从果冻无花果抑制人类的表达宿主细胞中正常原发性肝细胞没有毒性作用。
1。介绍
乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个重要的健康问题,因为它的患病率增加。是高度相关的肝硬化和肝细胞癌的发展的发展,极其预后不良的恶性肿瘤。目前的抗病毒药物用于治疗乙型肝炎病毒感染包括拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦,和干扰素(IFN)α(1]。然而,抗病毒药物的有效性,特别是核苷类似物,受限于耐药性由于HBV基因突变引起的长期管理(2,3]。例如,拉米夫定管理导致高电阻由于乙肝病毒与YMDD变异株的出现(4]。治疗干扰素-α为一个有限的时间通常是打断了其毒性反应,如发热、疲劳、头痛、肌痛、抑郁症,和myelosuppression [5]。这些限制妥协目前治疗乙肝病毒感染的治疗效果。显然,重要的是要开发一种新型的一类治疗乙肝病毒感染的基础上一个创新的策略。
果冻图(热带榕属植物awkeotsang牧野)是一个本地伍迪广泛生长在台湾的藤蔓。产生的水提取物果冻凝乳果冻无花果瘦果的钙是很受欢迎的饮料。果胶酯酶(PE)催化的deesterification果胶和原果胶转化成可溶性果胶和果胶酸盐。以前,江泽民等人报道,体育活动解决方案来自完整的瘦果逐渐增加,然后降低到几乎为零在90 h提取PE (6]。有趣的是,果冻无花果瘦果的体育活动时消除碎瘦果的均相溶液使用相同的PE提取过程。因此,一些物质释放碎瘦果在PE提取,也就是说,PE抑制剂(pei),抑制体育活动和减少PE-catalyzed反应速率(6]。裴准备从完整的果冻无花果瘦果以前分离和特征多肽分子量为3.5 -4.5 kDa,由组氨酸50%以上。这些裴显示明显的竞争性抑制PEs来自水果和蔬菜的活动(6]。贝聿铭的已知生物活性包括增长抑制人类白血病U937细胞通过内在途径诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡参与和激活半胱天冬酶3 (7]。然而,裴对抗病毒的生物活性仍然未知。
本研究旨在考察anti-HBV效应的自然饮食成分提纯果冻无花果。乙型肝炎病毒表面抗原表达的宿主细胞作为主要的端点。原发性肝细胞与小鼠作为正常的同行评估的安全。
2。材料和方法
2.1。制备的裴果冻无花果瘦果
贝聿铭的解决方案准备从pectin-depleted果冻无花果瘦果的海鲜科学、国立高雄海洋大学,高雄,台湾,之前报道6]。贝聿铭的产量提取从果冻无花果瘦果约0.1% (w / w)。总之,瘦果被冲洗20卷5% (w / v)的氯化钠溶液反复洗掉主要的果胶和体育;随后,他们均质使用搅拌机(6000 rpm) 2分钟。后提取使用15部分(1/15,w / v)的蒸馏水5 h和离心机(10000×g, 10分钟,4°C),上层在沸水浴加热30分钟变性残余PE。原油裴解决方案集中使用一个旋转蒸发器下减压(< 100毫米汞柱)。主要是使用250毫升的乙酸乙酯提取,这是重复四次。这些集中(1000毫升)在减压蒸发(< 100毫米汞柱)在室温下得到裴集中精神。进一步分离被加载执行大约300毫克的裴集中与乙酸乙酯为25×400毫米玻璃列挤满了ToyoPearl HW-40S树脂(Tosoh生物科学公司,东京,日本),通过监测在280海里。甲醇洗脱(甲醇:丙酮:水(45:25:30,v / v / v)] 1.5毫升/分钟的流量被用来分离裴集中精神。 The fourth pooled fractions with PE inhibitory activity (termed as PEI) were lyophilized and stored at −20°C until use. Cells were incubated in 35 mm Petri dishes at an initial concentration of 105细胞/毫升的裴(50 - 400μg / mL) 37°C湿润5%股份有限公司2孵化器。
2.2。肝癌细胞和文化
人类肝癌细胞系Hep3B港口和Huh7细胞内源性和集成乙肝病毒基因组,分别HBsAg的稳定生产和作为乙肝病毒复制的体外模型8,9]。这些肝癌细胞培养在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)含10%胎牛血清,105国际单位/L penicillin, 100 mg/L streptomycin, and 1,000 micromole/L L-glutamine in a humidified 5% CO2孵化器在37°C。
2.3。准备和初级小鼠肝细胞的文化
原发性肝细胞分离得到6 - 8-week-old雄性BALB / c小鼠使用Klaunig等人描述的程序做了一些调整(10]。麻醉后剖腹手术,门静脉插管灌注和calcium-free汉克斯平衡盐溶液(hbs)含有乙烯glycol-bis - (b-aminoethyl) N, N9-tetraacetic酸,和N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane磺酸。其次是与哈佛商学院含有胶原酶灌注肝细胞的分离。删除后肝脏,肝细胞机械分离和过滤网状和被梯度离心法分离Percoll(通用电气医疗集团,小都,英国)和清洗。细胞培养,镀完全培养基和足够的肝细胞生长因子。媒介是定期或根据需要改变。
2.4。生长抑制和细胞生存能力评估使用MTT试验
肝癌细胞的生存能力是由四唑染料比色MTT (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑)试验(11),表示为实验组的MTT值除以MTT值的未经处理的对照组。
2.5。试验以确定相对HBsAg表达式
肝癌细胞培养与10%胎牛血清的DMEM 24 h和转移到血清DMEM有或没有裴和孵化。培养基中的HBsAg分泌测定使用商业酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(一般生物、台北、台湾)。光密度值决定使用ELISA和细胞生存能力规范化。检测病人的血清中表明现有的乙型肝炎病毒感染和发展肝硬化和肝细胞癌的风险。因此,表面是一个有用的指数评价病毒活动(12]。相对HBsAg表达决心使用以下公式:从PEI-treated细胞(HBsAg / MTT) / (HBsAg / MTT)从未经处理的细胞。从未经处理的对照组(HBsAg / MTT)视为一个100%的表情。测量的病毒抗原由乙肝病毒宿主细胞分泌,如HBsAg Hep3B细胞所分泌,被用于各种研究评价细胞因子药物对乙肝病毒的影响。
2.6。统计分析
结果意味着±SEM。不同治疗组间被学生的评估以及或方差分析测试。统计分析软件包使用社会科学统计软件包,v18.0 (SPSS Inc .,芝加哥,IL),和一个值< 0.05被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。裴对肝癌细胞的生存能力的影响
确定裴在人类肝癌细胞的细胞毒性,Hep3B Huh7细胞治疗与不同浓度的裴(0、6.25、12.5,25岁,50岁,100年,200年和400年μg / mL) 48 h,然后进行MTT试验。如数据所示1(一)和1 (b),贝聿铭在0 - 400的浓度μg / mL没有明显影响细胞的可行性Hep3B和Huh7细胞,分别。因此,裴在这些细胞的生物活性是可能不是由于细胞毒性。
(一)
(b)
3.2。相对的减少由裴乙肝表面抗原在人肝癌细胞表达
检查表面的相对表达水平在人类肝癌细胞暴露于裴。Hep3B Huh7细胞治疗与不同浓度的裴(0、6.25、12.5、25、50、100人μ采用无血清g / mL) 48 h后血清饥饿。培养基是然后收获HBsAg的数量由ELISA测定。如数据所示2(一个)和2 (b),裴镇压了内生Hep3B细胞表面抗原表达和抑制的HBsAg产生稳定的克隆人类肝癌的HBV DNA-integrated Huh7细胞内源性乙肝病毒基因组。这种抑制作用是浓度为87.3%±4.6%和77.5%±5.1%减少为100μ克/毫升的裴Hep3B Huh7细胞,分别(数字2(一个)和2 (b))。此外,HBsAg-inhibitory浓度的50%,也就是说,25岁μ贝聿铭的g / mL,时间效应(12、24、48小时)也证明了Hep3B和Huh7细胞,如图3(一个)和3 (b)。
(一)
(b)
(一)
(b)
3.3。裴对正常肝细胞的生存能力的影响
主要培养肝细胞分离BALB / c小鼠作为一个正常的同行评估的裴正常组织的毒性。正常肝细胞治疗与不同浓度的裴(0、6.25、12.5,25岁,50岁,100年,200年和400年μg / mL) 48 h,然后进行MTT试验。如图4,裴浓度大于那些有效抑制乙肝表面抗原在肝癌细胞不表达明显减少正常肝细胞的可行性。
4所示。讨论
我们发现裴隔绝果冻无花果,原料中发现在亚洲很受欢迎的饮料,抑制人类的表达宿主细胞中正常原发性肝细胞没有毒性作用。
如前所述,目前治疗乙肝病毒是有毒或有倾向通过基因突变导致耐药性。我们发现的天然裴果冻无花果可能抑制HBsAg表达式没有任何毒性肝细胞,这可能会促进新的治疗制剂的发展。裴从果冻图由耐热多肽(3.5 - -4.5 kDa)与57%基本的氨基酸,这抑制了内在杨桃体育活动所需甲醇降低葡萄酒(13]。还不知道裴的生物活性果冻无花果后将保留在胃肠道消化。因此,还需要进一步的体内测试。
实验模型进行这项研究由Hep3B细胞存在内生HBsAg和一个稳定的克隆HBV DNA-integrated Huh7细胞。裴抑制乙肝表面抗原在两个细胞系表达,表明对HBsAg表达普遍的活动。然而,这个实验模型只提供筛选平台anti-HBV代理(14]。进一步的分子研究,包括病毒复制化验,确认是否需要裴从果冻无花果可以抑制乙肝病毒。
正常肝毒性评估基于体外肝细胞生存能力没有裴肝毒性的证据。目前使用anti-HBV代理有不同程度的毒性5),进一步支持贝聿铭作为小说的发展潜力anti-HBV代理。
在临床实践中,chemotherapy-related乙肝病毒再活化和随后在HBV-infected暴发性失败并不罕见患者(15,16]。抗病毒药物如拉米夫定预防管理已被证明是有效的(17]。鉴于贝聿铭是发现在一个安全的和常用的饮料,预计裴可能预防的另一个选择在癌症患者对乙肝病毒再活化已经收到许多化疗药物。
5。结论
总之,裴隔绝果冻无花果可以抑制人类乙肝表面抗原在宿主细胞表达没有任何对正常肝细胞毒性的影响。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项研究支持部分由台湾卫生部临床试验和研究卓越中心(doh102 - td - b - 111 - 004)和美国国家科学委员会,台湾(nsc101 - 2314 - b - 039 - 024),以及农业和粮食机构委员会农业、行政院、台湾(100 as-4.2.1-fd-z3)。