文摘
Lingguizhugan汤(LGZG),一个典型的中国传统医学(中医)公式,已被用于治疗肥胖和高脂血症近年来,但相关机制调控脂类代谢的LGZG还不清楚。在这里,我们报告的有效性和可能机制LGZG与高脂肪饮食引起的脂肪肝大鼠(HFD)。我们的研究结果表明,LGZG显著减毒HFD-induced脂肪肝疾病,以体重、肝指数、附睾的脂肪pad-body重量比(EFP / BW)、肝损伤、肝甘油三酯(TG)可能通过增加血清甲状腺激素水平,改善机会(通过调制TRβ1和CPT1A表达式),代谢和运输(通过调制SREBP-1c ACSL和ApoB100表达)的脂肪酸。此外,我们发现了草药结合变暖阳的性质来缓解水肿LGZG公式并提出了生物学基础的传统影响通过进一步研究分解公式。这项研究第一次揭示了LGZG调节脂质代谢的机制。此外,我们的研究表明,它可能是可行的理解中医的科学含义从经典公式的角度的传统功效。
1。介绍
Lingguizhugan (LGZG)汤是一种古老的中国草药配方书从一个典型的临床中医(中医)标题Jingui Yaolue对疾病的治疗由phlegm-fluid潴留引起的。记录,条件和痰液潴留应该调制通过与温暖的自然药物,和特定的公式是Lingguizhugan汤。LGZG是一个典型的公式建立了变暖阳的治则下缓解水肿,表示痰和液体潴留。在过去的十年里,LGZG也被应用于疾病痰的特点和液体潴留,例如慢性充血性心力衰竭(CHF)。metaanalysis包括280名患者认为LGZG inotropes临床效益的增加、利尿剂和血管舒张药治疗在瑞士法郎(1]。此外,在动物实验中,发现LGZG改善心功能和心脏内分泌功能的兔子模型瑞士法郎(2),降低血清和II, ET-1, TNF -α,il - 1β水平,延缓不良心室重构,降低模型大鼠细胞因子的过度瑞士法郎(3]。此外,LGZG发现抑制抗精神病药物引起的体重增加无明显副作用(4),这表明LGZG带来的好处可能对代谢综合征(MS),这被认为是在中医痰的性质和液体潴留。LGZG还演示了临床益处hyperlipidemic大鼠的血液流变学,也表明它可能是另一种选择治疗高脂血症(5,6]。综上所述,探索具有重要意义的影响和可能的机制LGZG在非酒精性脂肪肝病(NAFLD),肝组件患病率高的女士。
我们的研究小组一直在地里干活的副功拜用中医治疗二十多年。我们的流行病学证据(7)表示,过多的祷告的中医病机关键是痰和液体潴留,这主要是由spleen-yang不足引起的。此外,我们发现,气候变暖阳,以减轻水肿消除副功拜患者的肝脏脂肪堆积(8]。我们之前的研究比较了三种不同的经典公式的有效性在肝脂肪变性(以肝甘油三酯)HFD-induced副功拜的大鼠模型。这些公式是根植于三个不同的治疗原则,这是对脾补气滋补,气激活变暖阳,暖阳,以减轻水肿。最后结果表明LGZG有效减少肝甘油三酯(TG) [9]。因此,调查机制的影响LGZG副功拜副功拜将提供另一种治疗选择,帮助我们理解中医治疗原则的科学内涵变暖阳在副功拜治疗减轻水肿。
2。材料和方法
2.1。药物制备和饮食
中国草药LGZG包括四个:云苓(20克),小枝、肉桂(15克),苍术Macrocephalae(15克),甘草(10克)。剂量根据课本的决定的Hndouts Jingui Yaolue(10]。所有的草药都购自上海中医药大学附属龙华医院。草药汤准备依照传统中药煎煮方法,简单地说,(1)将所有药草在锅(瓷器)用500毫升水;(2)煮热后最高的草药浸泡30分钟;(3)减少热量和炖20分钟;(4)转移液体过滤;(5)添加水和煮剩下的,然后重复(3)和(4)再一次一次剂量的药物;(6)混合在一个玻璃罐两剂。最终浓缩汤100毫升(纯溶液)。质量控制下的高效液相色谱(HPLC)如前所述11,细节补充1所示(见补充资料在网上http://dx.doi.org/10.1155/2013/429738)。LGZG的剂量服用10毫升/公斤/ d(纯溶液),这是大约7倍的标准剂量在实践中,根据dose-equivalence老鼠和人类之间的方程(12]。同时,下面的公式是基于准备草药组合规则:Lingguizhugan煎煮小枝、肉桂(LZG云苓,苍术Macrocephalae,甘草),Lingguizhugan煎煮云苓(GZG小枝、肉桂,Atractylodis Macrocephalae,甘草),Lingguizhugan煎煮苍术Macrocephalae和甘草(LG,云苓,小枝、肉桂)。在煎煮方法和质量控制LGZG中使用的一样,平等的疫苗接种。普通饮食和HFD(由10%猪油,2%胆固醇,和88% STD)从上海得到Si-Lai-Ke实验动物有限公司(上海,中国)。
2.2。动物和干预措施
SPF动物(雄性Wistar鼠130 g±10 g)从上海得到Si-Lai-Ke实验动物有限公司(上海,中国)。老鼠被安置在一个防晒系数、温度(24°C±2°C)和湿度(55%±10%)房间,12小时光暗周期(开始喂饲的光)在实验中心,上海中医药大学附属龙华医院。动物随机分为6组:正常组,模型组,LGZG集团LZG集团、GZG集团和LG集团()。
研究开始后1周的适应时期。正常组大鼠喂养与普通饮食,而其他组的老鼠和HFD美联储。食物和饮用水/草药汤随意提供。治疗持续了5周,药物浓度滴定每隔一天据《每日液体摄入的动物。
五周后,动物被牺牲在戊巴比妥钠(2%,5.5毫升/公斤)麻醉后12小时的快。收集血液样本血清管从腹主动脉。两个样品(1.0厘米×1.0厘米×0.2厘米)从相同的叶和位置在肝脏被获得,然后neutral-buffered福尔马林固定在10%。剩下的肝脏储存在−80°C到使用。
所有动物程序批准的上海中医药大学动物实验伦理委员会。
2.3。病理学
肝脏样本固定在10%福尔马林48小时,然后经常加工石蜡。部分削减在切片机的厚度4μm是苏木精和伊红染色(H & E),然后获得显微图像。
2.4。生物化学分析
铁铝榴石转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl - c)、低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白)测量与自动分析仪(日立7170年,日本)。
TG浓度化验使用工具后从南京建成生物工程研究所获得制造商的指示。200毫克肝组织得到搭档给剪成小块。这些组织被放置在3毫升ethanol-acetone混合物(v v = 1: 1),均质冰在10000 - 20000转/分钟20秒(重复2 - 3次),然后储存在4°C过夜。在第二天,样品在3000转/分钟离心20分钟在4°C得到上层清液。
3、5、3-Triiodothyronine (T3)、游离三碘甲状腺氨酸(发生),总甲状腺素(T4)和游离甲状腺素(FT4)测量与罗氏诊断GmbH (E170,罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国)。
2.5。实时PCR mRNA分析
TRβ1 CPT1A SREBP-1c、ApoB100 ACSL mRNA水平由实时PCR。引物设计软件(表使用底漆总理5.01)。
定量测定了使用预混料交货Taq工具包(豆类)根据制造商的说明应用生物系统公司StepOne +序列检测系统。实时周期计条件如下:首先在95°C变性30秒,然后放大与40个周期(每个周期在95°C变性5 s和退火30分钟/扩展60°C)。证实了产品纯度分离曲线分析。基因表达是量化相对于对照组的值调整后β肌动蛋白的2−ΔΔCT方法如前所述[13]。
2.6。蛋白质分离和免疫印迹
每组三个肝脏样本在液态氮均质,和全细胞蛋白提取利用溶菌产物缓冲含有蛋白酶抑制剂(完整的超平板电脑,minipore)。蛋白质浓度是量化spectrophotometrically (Bioiek H4)用BSA蛋白分析工具包(热)。蛋白质样品分离页面使用10% SDS-polyacrylamide凝胶。样品被转移到聚偏二氟乙烯膜(Immobilon-P转移膜,微孔)和屏蔽5%的牛奶。膜与鼠标发射机阻塞孵化β1主要抗体(1:100年,圣克鲁斯)为1.5 h在室温下的二级抗体(鼠标,细胞信号)在室温下1 h。主要的抗体包括兔子anti-CPT1A(1: 500年,proteintech),和鼠标anti-SREBP-1(1: 250年,abcam),兔子anti-ACSL(1: 500年,proteintech),鼠标anti-beta-actin(1: 1000年,abcam)是相似的。最后,每个蛋白质乐队使用增强化学发光检测(ECL,微孔)。光密度值与Gel-Pro分析仪测定。
2.7。统计分析
数据被表示为平均数±标准差,分析了单向方差分析(方差分析),LSD -,或者Games-Howell合适。统计学意义是定义为双侧值< 0.05。使用SPSS 16.0统计分析软件SPSS,芝加哥,美国)。
3所示。结果
3.1。大鼠的体重、肝指数,附睾的脂肪Pad-Body重量比(EFP / BW)被LGZG减少
体重、肝指数和EFP / BW模型组明显高于正常组()。所有四个公式减少肝脏指数和EFP / BW模型组相比,尽管在LGZG发现统计学意义只是和LG组()。这个效果没有明显不同LZG和GZG组(、表2)。
3.2。肝损伤和TG被LGZG改进
组织学分析显示,在正常组(图1(一)),中央静脉周围(CV)肝细胞径向排列在盘子,和中细胞核位于细胞的中央。在模型组(图1 (b)),肝细胞不仅无序释放细胞质和气球样变性,而且丰富的脂滴和空泡形成了;中核位于细胞的边界。在LZG(图1 (d)(图)和ZGZ组1 (e)),他们类似于模型组。相反,在LGZG(图1 (c))和LG(图1 (f))组,脂滴明显减少与模型组比较,和肝细胞安排改善。比LG LGZG效果优越。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
肝脏TG(图的水平1 (g)在模型组显著高于正常组()。减少的趋势是LZG和GZG组与模型组(),而显著减少被发现在LGZG和LG组();此外,LGZG效果优于LG集团。
3.3。LGZG血清氨基转移酶和脂质水平相对较低
在模型组血清AST显著高于正常组(),并显著减少在LGZG发现,GZG和LG组与模型组(),而没有出现在改善LZG集团()。然而,正常血清ALT水平相似,模型,和治疗组。
血清高密度脂蛋白在模型组显著低于正常组(),而TG发现无显著差异。TG水平显著降低LGZG和LG组比较,模型组()。模型组血清TC水平显著高于正常组(),和TC水平显著降低LGZG和LG集团(),而没有发现显著的减少在LZG GZG组(、表3)。
3.4。这个是增加了LGZG血清
血清发生、T4、FT4水平模型组显著低于正常组(),而只有一个下降的趋势为T3水平被发现()。发生T3, T4、FT4水平显著增加LGZG和LG集团,与模型组相比)。T4水平显著增加GZG集团(),但对T3 GZG治疗没有作用,发生,FT4水平()。LZG治疗没有影响所有解说(、表4)。
3.5。通过调节TR LGZG脂肪酸改善机会β1和CPT1A表达式
甲状腺激素受体的基因和蛋白质表达β1 (TRβ1)和肉碱palmitoyltransferase-1A (CPT1A)肝组织的模型组显著低于正常组()(数据2(一个)和2 (b))。LGZG、GZG和LG治疗显著改进TR的mRNA和蛋白表达β1和CPT1A (),而没有这样的效果被发现在LZG集团()。LGZG对TR的mRNA表达的影响β1是优于其他组。
(一)
(b)
3.6。LGZG增强新陈代谢和运输脂肪酸通过调制SREBP-1c, ACSL, ApoB100表达式
固醇调节元件结合蛋白的基因和蛋白质表达1 c (SREBP-1c)从肝脏组织模型组明显高于正常组(数字3(一个)和3 (b)),而治疗组减少了表达明显()。
(一)
(b)
(c)
(d)
相反,长链酰coa合成酶的基因和蛋白质表达(ACSL)和载脂蛋白B100 (ApoB100)模型组显著低于正常组(P< 0.05)(数据3(一个),3 (c),3 (d));LGZG LZG, LG治疗显著提高表达ACSL和ApoB100 (),LGZG优于LZG和LG集团;然而,GZG治疗则没有表现出这样的效果()。
4所示。讨论
Lingguizhugan汤(LGZG)是一个典型的中药配方,已用于治疗肥胖和高脂血症近年来,但LGZG调节脂质代谢的相关机制尚不清楚。在这项研究中,我们表明,LGZG显著减毒HFD-induced脂肪肝疾病,以体重、肝指数、EFP / BW,肝损伤,肝脏TG。可能的机制可能包括增加血清解说和改善机会(通过调制TRβ1和CPT1A表达)、代谢和运输(ACSL通过调制SREBP-1c, ApoB100表达式)的脂肪酸。我们的研究中,首次揭示了LGZG调节脂质代谢的机制;此外,我们发现了草药结合变暖阳的性质来缓解水肿LGZG公式并提出了生物学基础的传统影响通过进一步研究分解公式。具有重要意义在理解传统经典公式的有效性。
副功拜TGs的积累,这是由游离脂肪酸(FFA)和肝细胞内的甘油。之间有一个积极的TG周期在生理条件下肝脏和脂肪组织。只能导出从肝脏在极低密度脂蛋白(VLDL)粒子并入后载脂蛋白(ApoB100)因为TG是脂溶的和不溶于身体(水环境)。TG在肝脏合成的能力大于合成ApoB100然后包VLDL的结果,副功拜常发生与失衡TG和载脂蛋白合成的生产。
FFA和甘油脂肪酶水解的肝细胞内TG,然后释放到血液,和FFA通过发电β氧化。FFA首先翻译前激活酰coa分解氧化,而后者是自由溶于水。因此FFA的代谢活动增强催化酰coa合成酶(ACS)。
我们的研究结果表明,LGZG LZG, LG显著增加肝ACSL (ACS的主要同种型肝)和ApoB100副功拜的大鼠模型。这三个公式有一个共同的草云苓和公式云苓(GZG)没有这样的效果,我们建议云苓(这和无味的味道是甜的,排湿乏味)的函数是关键因素,为什么一个公式可以减轻水肿。云苓可能通过促进功能包的VLDL TG,加强水溶解度和脂肪酸的代谢活动。减轻水肿的主要生物学基础是ACSL的高表达和ApoB100。
LGZG已经变暖阳的功能,以减轻水肿,还有中医yang-warming相似性和手功能。不显示重视在代谢调节显著促进能量代谢和脂肪代谢,尤其是他们改善脂质动员、减少脂肪储存,加速脂肪酸氧化。肝脏是一个重要的靶器官,不执行其功能,绑定到甲状腺激素受体(TRs)生理上,也扮演着重要的角色在合成、转换和失活的手。TRβ1 TRs的主要同种型肝脏是主要调制器在T3调节胆固醇代谢中发挥着关键作用在肝脏脂质代谢14,15]。临床前研究已在进行TRβ1受体受体激动剂和显示他们降低血浆胆固醇和TG。在动物研究中,TRβ1受体激动剂(M07811)被发现加速线粒体脂肪酸氧化和减轻肝脂肪变性16]。
研究已经证明,TR监管CPT1表达式通过绑定TH-response元素(混乱关系)的启动子区域里肉碱palmitoyltransferase-1 (CPT1),病原反应酶在肝线粒体脂肪酸氧化17- - - - - -20.]。体脂百分比CPT1表达密切相关,和转录水平的基因表达调控21]。High-CPT1表达式与脂肪酸分解高,体脂百分比低,减轻肝脂肪变性,和延迟发生脂肪肝的22]。CPT1目前已知的三个亚型:CPT1A CPT1B, CPT1C。CPT1A(肝同种型)主要表达在肝、肾、胰腺,脂肪酸的功能β氧化监管(23]。CPT1A表达式在NAFLD患者减少,肝脏TG减少通过增加CPT1A表达式(24]。肝脏TG水平显著增加而CPT1A活动约束(25]。增强CPT1A活动与改善脂肪酸β氧化,减少由高FFA和TG,造成的损害和TG分泌增加(26]。另一项研究表明CPT1A和ACSL之间的强相互作用27]。
桥本et al。28)表明,T3显著降低小鼠通过TR SREBP-1c表达式β1,这个抑制可能是由于TRs LXR(从SREBP-1c)对DNA结合位点的竞争(29日]。基因的表达参与脂质代谢和糖代谢受SREBP-1c,同种型的固醇调节元件结合蛋白(如)在肝脏30.,31日]。之前的研究报道,SREBP-1c监管的合成和储存在肝脏TG (32]。SREBP-1c过度会导致dyslipidaemia并导致脂质积累和脂肪肝。这是证实肝脂肪含量在ob / ob重叠基因敲除的小鼠SREBP-1明显低于在广式控制(33]。SREBP-1c调节脂质合成通过转录调节肝脂酶通过改变它的mRNA水平。我们的研究结果表明,LGZG、GZG和LG显著增加肝TRβ1的非酒精性脂肪肝大鼠模型。这三个公式有一个共同的草小枝、肉桂(一个函数的变暖阳气激活),而公式小枝、肉桂(LZG)没有这样的效果,所有四个公式显示CPT1A有益的影响,我们建议小枝、肉桂为什么一个公式变暖阳是关键因素激活。小枝、肉桂通过增加解说,可能功能肝TRβ1,CPT1A表达和增强脂肪酸β氧化。与此同时,草药组合(苍术Macrocephalae和甘草)强化脾脏的财产和补充气可能加强这种效果。气的主要生物学基础变暖阳激活是TR的高表达β1和CPT1A。
此外,我们的研究结果表明,LGZG和LG显著降低大鼠非酒精性脂肪肝模型肝TG水平,和公式云苓(利尿)或小枝、肉桂(气激活yang-warming)则没有表现出这样的效果。辨证理论的基础上,通过公式和对应的处方和综合症,我们提议,水和湿气滞留引起的脾阳虚是基本的非酒精性脂肪肝的中医发病机制,和变暖阳,以减轻水肿是一种有效治疗非酒精性脂肪肝preventionand治疗原则。这反映了治疗理念根植于Jingui Yaolue:条件和痰液潴留应该调制通过药物自然变暖。的结合云苓和小枝、肉桂LGZG可能是至关重要的,建立在变暖阳的治疗原则,以减轻水肿。这个公式直接支持的想法,有一个和谐的组合变暖能滋补和病理消除积累。的草药组合苍术Macrocephalae和甘草提高变暖阳,以减轻水肿的影响。
总之,我们的研究证实,LGZG HFD-induced提供了大量有益的影响大鼠非酒精性脂肪肝模型,LGZG的影响和机制可能包括这个和改善脂肪酸增加β氧化和新陈代谢。LGZG可能是女士的另类疗法,如非酒精性脂肪肝,基于本研究的数据。然而,进一步的临床试验关于LGZG疗效和其他可能的机制的研究是必要的。
缩写
| ACS: | 酰coa合成酶 |
| ACSL: | 长链酰coa合成酶 |
| ALT: | 铁铝榴石转氨酶 |
| ApoB100: | 载脂蛋白B100 |
| AST: | 天冬氨酸转氨酶 |
| CPT1: | 肉碱palmitoyltransferase-1 |
| CPT1A: | 肉碱palmitoyltransferase-1A |
| EFP / BW: | 附睾的脂肪pad-bodyweight比率 |
| 发生: | 游离三碘甲状腺氨酸 |
| FT4: | 游离甲状腺素 |
| 高密度脂蛋白胆固醇: | 高密度脂蛋白胆固醇 |
| 密度: | 低密度脂蛋白胆固醇 |
| 过多的祷告: | 非酒精性脂肪肝 |
| SREBP-1c: | 固醇调节元件结合蛋白1 c |
| ,如: | 固醇调节元件结合蛋白 |
| TC: | 总胆固醇 |
| TG: | 甘油三酸酯 |
| 混乱关系: | TH-response元素 |
| TRs: | 甲状腺激素受体 |
| TRβ1: | 甲状腺激素受体β1 |
| T3: | 3、5、3-triiodothyronine |
| T4: | 总甲状腺素 |
| VLDL: | 非常低密度脂蛋白。 |
利益冲突
刘涛和莉莉杨了同等重要的作用,本文。作者报告没有利益冲突。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金(81273727,81273727,81202979),重点学科建设项目,创新研究团队在大学从上海市教育委员会(J50305, E3008 ZYSNXD-CC-ZDYJ042, 2012 jw35, ZZszy12062)。
补充材料
安捷伦1100液相色谱系统组成的一个G1354A泵,一个G1313A auto-sampler,和紫外检测器是用于分析。在默克C18色谱分离进行了hibar列(4.6毫米×250毫米,5µ米)与甲醇乙腈:水:acetid酸(15:35:45:0.9,v / v)流动相的流速0.8毫升/分钟25°C 40分钟。lingguizhugan汤的高效液相色谱指纹图谱显示的主要山峰(甘草酸)254海里。甘草酸的含量为0.9548%。