文摘

神经干细胞(nsc)、能够自我再生细胞,但他们的再生能力是有限的。目前的研究调查的影响β-sitosterol-D-glucoside (BSSG)海马nsc增殖并确定相应的分子机制。CCK-8试验的结果表明,BSSG显著增加NSC增殖和BSSG的有效性是类似于基本成纤维细胞生长因子和表皮生长因子。信使rna表达分析显示,960个基因差异表达nsc后BSSG对待。在960个基因中,IGF1被认为是一个关键的调节基因功能促进NSC增殖。MicroRNA MicroRNA的表达分析表明,30和84 MicroRNA调节和表达下调,分别。miRNA-mRNA相关性分析显示,许多mRNA包括IGF1信使rna被microrna与降低负调控表达,从而增加相应的mRNA的表达。IGF1蛋白质表达的增加被ELISA进行验证。Picropodophyllin (PPP, IGF-1R)的抑制剂抑制试验证实,proliferation-enhancing效应取决于IGF1。本研究提供的信息BSSG作为一种高效、廉价的生长因子的选择,是密切参与IGF1的影响。

1。介绍

神经干细胞(nsc)被定义为未分化细胞自我更新能力和潜力产生神经元,星形胶质细胞、少突胶质细胞在中枢神经系统(1,2]。nsc位于subventricular区(SVZ)和海马的subgranular区(SGZ)。nsc和神经再生都进行了广泛的研究提供合适的治疗脑的疾病(3,4通过细胞移植)。然而,大多数nsc逮捕G0期的有丝分裂细胞周期;这种再生能力有限的内生和嫁接NSC归因于NSC增殖的抑制作用和神经发生5]。研究还表明,一些草药的活性成分如细胞质(6)和有丝分裂原,如表皮生长因子(EGF) [7)和碱性纤维母细胞生长因子(bFGF) [8)加快NSC增殖。然而,这些活性成分是昂贵或化学性质不稳定,限制了他们的应用程序。因此,可靠的选择应确定化学成分。

在这项研究中,第一个证实β-sitosterol-D-glucoside (BSSG sterolin)增加海马nsc的扩散。研究显示BSSG的多种生物活性,包括抗炎作用[9,10],驱虫剂活动[11[],immunomodulating活动12,13]。在这项研究中,BSSG提升NSC增殖由于众多基因的调节,特别是增加IGF1表达式。

最新进展在微阵列分析等生物信息学和高通量技术带来一场革命在我们理解生物过程的分子机制。在这项研究中,信使rna和微rna (microRNA)表达芯片分析了解影响nsc的分子机制。microrna是小内生,非编码RNA是高度保守的,一直被认为是一个强大的工具通过RNA干扰途径基因表达调控14,15]。有能力的microrna的绑定和管理大量的mRNA和潜在的单个mRNA多个microrna的目标,可以调整蛋白质在细胞内的表达在一种非常精确的方式16]。

一些分析方法应用于微阵列分析法,包括基因本体论(去)分析。去分析(http://www.geneontology.org/)提供了一种受控词汇表来描述任何生物体的基因和基因产物的属性。涉及三个领域:生物过程,细胞成分,和分子功能17]。生物过程是指生物目的基因或基因产物的贡献。这一过程是通过一个或多个命令完成装配的分子功能。分子功能是定义为一个基因的生化活动的产品。蜂窝组件是指在细胞基因产物是活跃的。这些词汇反映了我们对真核细胞结构的理解。在这些领域中,生物过程有助于理解生物功能指定何时何地事件确实发生了。因此,生物过程是用来描述特定的生物功能的差异表达基因。此外,基因网络分析有助于理解相互作用的基因。

2。材料和方法

2.1。制备BSSG

BSSG(纯度:98%,提供的生药学、南京中医药大学)股票的解决方案是在二甲亚砜(DMSO)。在每次实验进行之前,解决方案在新鲜培养基稀释获得最后一个DMSO浓度≤0.1%。

2.2。主要NSC文化和识别

主要NSC文化建立了根据以前公布的协议(18]。总之,海马体的Sprague-Dawley鼠胚胎16 d的胚胎阶段在冷CMF-HBSS然后分离机械切割。离心收集的细胞和resuspended neurobasal介质(美国CA Gibco)补充表皮生长因子(EGF, 20 ng / mL;PeproTech Inc .,落基山,新泽西,美国),基本成纤维细胞生长因子(bFGF, 20 ng / mL;PeproTech USA Inc .), B27补充(2%;美国Gibco)、青霉素(50 U /毫升)和链霉素(50μg / mL)。这些细胞被调整到1×10的密度⁵细胞在培养瓶/毫升和种植。中替换为1/2相同的介质在3 d的间隔。细胞被免疫细胞化学染色主要抗体巢蛋白(Boshide、武汉、中国)使nsc的识别。

2.3。CCK-8化验

2.3.1。细胞增殖检测存在剂量依赖的相关性

剂量依赖性细胞生存能力监控使用细胞计数kit-8 (CCK-8)测定。CCK-8是一个敏感的非放射性比色测定用于确定可行的细胞的数量在细胞增殖和细胞毒性分析。在这项研究中,nsc在96孔培养板包含生长培养基的细胞密度5×10³细胞每口井。细胞被分成9组:对照组和BSSG治疗组(1.25、2.5、5、10、20、40、80年和100年μ米BSSG)。每一组旨在建立六double-pore治疗。每个BSSG治疗组治疗BSSG的相应金额。描述的细胞治疗72 h,然后CCK-8解决方案(Beyotime生物技术、海门、中国)添加到细胞培养基的最终浓度10μL / 100μ为另一个4 h L和孵化37°C。吸光度测量在450 nm决定细胞生存能力的比例,使用标(ELx800 BioTek仪器,Inc . Winooski, VT,美国)。

2.3.2。比较NSC增殖促进BSSG, bFGF和EGF

理解的有效性BSSG加强nsc增殖,我们比较BSSG bFGF和表皮生长因子通过执行CCK-8化验。96孔板的细胞培养的细胞密度1×10⁴每口井的细胞,然后分为六组:bFGF和EGF空置集团(bFGF⁻表皮生长因子⁻:随着neurobasal介质和B27补充);bFGF集团(neurobasal介质,B27补充和bFGF 20 ng / mL);EGF组(neurobasal介质,B27补充,EGF 20 ng / mL);和bFGF⁻表皮生长因子⁻+ BSSG组(10、20和40μ米),细胞治疗72 h如上所述,和CCK-8化验。

2.4。信使rna表达微阵列分析

2.4.1。信使rna表达分析

mRNA表达芯片分析是由使用Roche-NimbleGen鼠形12×135 K数组(罗氏公司,由康晨集团),为了理解的影响BSSG mRNA的规定,披露BSSG促进nsc增殖的机制。

总RNA从每个样本(5对照组样本和五个样本BSSG-treated组(40μ米),细胞治疗72 h如上所述)和量化NanoDrop nd - 1000。总RNA用于标签和阵列杂交基于以下步骤:(1)使用上标ds-cDNA逆转录合成装备(美国表达载体);(2)ds-cDNA标签使用一种颜色的DNA标记工具包(美国罗氏罗氏);(3)阵列杂交利用罗氏杂交系统并使用罗氏洗了洗缓冲设备;和(4)阵列扫描使用轴突GenePix 4000 b基因芯片扫描仪(分子设备公司,桑尼维尔,美国)。

扫描图像导入到NimbleScan软件(版本2.6)网格对齐和表达数据分析。表达数据被四分位数规范化标准化和健壮的多片平均(RMA)算法包含在NimbleScan软件。调查水平文件和基因水平正常化后生成的文件。10基因水平文件导入到安捷伦GeneSpring GX软件(版本11.5.1)进行进一步分析。差异表达基因被火山情节过滤(值< 0.05;褶皱变化≥2.0或≤0.5)。

基因的网络被使用的搜索工具绘制字符串(http://string-db.org/)和绘图工具cytoscape。然后执行网络的连通性分析获得基因的“枢纽”节点,使用单面确切概率法(19]。网络“节点”(或“组件”)代表基因。节点使用很大程度上值通常被称为“中心。“中心基因被认为是重要的基因,扮演重要的角色在细胞的功能和结构。

2.4.2。实时PCR验证mRNA表达分析

执行实时PCR验证mRNA表达分析。总RNA(从信使核糖核酸微阵列分析)中提到的样品一样是反向转录上标二世逆转录酶(表达载体)。实时PCR进行使用ABI PRISM7900系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA),在正向和反向引物为目标基因,或正向和反向引物GAPDH基因作为参考。相对量化的目标基因是由计算比率的浓度的目标基因和参考。

GAPDH基因的引物序列和目标基因表中列出1。

2.5。microrna的微阵列分析

2.5.1。microrna的表达分析

证据显示,microrna在干细胞调控的重要功能20.,21]。特定的microrna调节许多类型的干细胞的功能,包括神经干/祖细胞(22,23]。在目前的研究中,microrna的表达谱进行了分析了解microrna的BSSG对调节的影响,描述microrna的相关性和信使rna。总之,总RNA(从信使核糖核酸微阵列分析)中提到的样品一样是收获使用试剂盒(表达载体)和miRNeasy迷你包(试剂盒)根据制造商的指示。总RNA测量使用NanoDrop 1000后,样本标签使用miRCURY Hy3 / Hy5电源标签工具包和杂化在miRCURY LNA数组(v.18.0)。清洗步骤后,幻灯片被G2505C安捷伦扫描仪扫描。

扫描图像导入GenePix Pro 6.0软件(突)网格校准和数据提取。复制microrna是平均和microrna强度≥30在所有的样本选择计算归一化因子。表示数据的归一化值正常化。正常化后,明显和差异表达microrna是被火山情节过滤。

2.5.2。实时PCR验证microrna的表达分析

实时PCR验证执行微分microrna的表达分析。总RNA是reverse-transcribed cDNA用lamv逆转录酶(中心)、核糖核酸酶(中心)、核苷酸(疯狂的有限公司),RT缓冲区,和RT引物(表达载体)。的混合是在16°C的环境中30分钟,40分钟42°C, 85°C 5分钟生成一个图书馆的microrna的互补。U6用作内部控制规范化。实时PCR随后使用ABI PRISM7900执行系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)根据标准化的协议。在95°C的反应是孵化10分钟,其次是40周期的间隔10 s在95°C和1分钟的间隔60°C。数据分析。内部控制基因的引物序列和目标基因在表中列出2和3。

2.6。IGF1蛋白测定

IGF1蛋白质测定进行调查的关键调节器BSSG促进NSC增殖。细胞培养在24-well板块5×10的细胞密度⁴细胞每口井,分为4组:对照组和BSSG-treated组(10、20和40μ米)。每一组旨在建立六double-pore治疗。细胞治疗72 h如上所述。上层清液的收集和加工使用Quantikine鼠IGF1酶联免疫试剂盒(研发系统,Inc .,明尼阿波利斯,美国),指令后由制造商提供。每个决定使用一个微型板块的吸光度读者(EL×800年BioTek仪器,Inc . Winooski, VT,美国)设定在450海里;阅读在570海里从读数减去450海里。细胞的数量在每个计算使用细胞计数板。IGF1水平报道pg / 10000细胞。

2.7。购买力平价抑制试验

IGF1是由1型IGF受体(IGF1R)。购买力平价是IGF1R的抑制剂(24]。购买力平价的抑制作用IGF1R没有coinhibit胰岛素受体(IR)或与ATP体外激酶化验,这表明购买力平价可能抑制IGF1R自身磷酸化的底物水平(25]。如果PPP防止BSSG-induced NSC增殖,然后BSSG取决于IGF1的功能。

在这项研究中,PPP (Tocris生物科学,英国布里斯托尔)股票的解决方案准备在DMSO和储存在4°C。在每次实验进行之前,这些解决方案在新鲜培养基稀释获得最后一个DMSO浓度< 0.1%。96孔板的细胞培养的细胞密度1×10⁴细胞每好,分给PPP-BSSG治疗组(双向;用购买力平价剂量的0,0.01,0.1,1和2μM和BSSG剂量的0,10、20和40μ米)。每一组旨在建立四个double-pore实验。细胞治疗72 h, CCK-8化验。吸光度测量在450 nm决定细胞生存能力的比例。

2.8。统计分析

统计分析利用SPSS 16.0版软件程序为windows (SPSS, Inc .,芝加哥,IL)。多个使用单向方差分析进行了比较,其次是Bonferroni期末测验。所有数据提出了平均数±标准差,统计学意义被接受在5%的水平。

3所示。结果

3.1。nsc的识别

nsc巢蛋白阳性(图1)。

3.2。细胞增殖检测存在剂量依赖的相关性

在浓度为40 BSSG显著增加NSC增殖μ米()。观察相同的结果在5、10和20μM BSSG (,图2)。

3.3。比较NSC增殖促进BSSG, BFGF和EGF

nsc增殖诱导是通过添加bFGF (20 ng / mL;)、表皮生长因子(20 ng / mL;)和BSSG在不同浓度(10和20μ米,;40μ米,)。在NSC增殖BSSG 40的效果μM是类似bFGF和EGF(图3)。

3.4。信使rna表达分析

信使rna表达芯片分析的结果显示,960个基因差异表达与BSSG nsc的待遇后,包括333 upregulation基因基因差别(褶皱变化≥2)和627年对这些(褶皱变化≤0.5)。使用术语去描述的基因的差异表达分析(生物过程)。表中列出的主要差异表达基因4和5。

表4和5显示,大多数upregulation基因参与有丝分裂细胞周期阶段,尤其是在米提高细胞增殖。相比之下,大多数基因差别的对这些基因参与细胞分化,表明细胞分化抑制,细胞增殖的可能性,因此,更多是给予。

3.5。基因的网络分析

大多数的基因网络由upregulation基因差别和对这些(图4(一))。“中心”基因的基因网络中的节点包括Bub1b(出芽的苯并咪唑1同族体β),Cdc20(细胞分裂周期20同族体),Plk1 (polo-like激酶1),Spp1(唾液蛋白、骨桥蛋白),IGF1(胰岛素样生长因子I), Aurkb(极光激酶B),和Ndc80(着丝粒相关2)基于连通性分析的结果(图4 (b))。BSSG中心基因的表达增加,主要参与细胞周期(这些基因的功能看到Genecards,http://www.genecards.org/),从而提高NSC增殖。

3.6。实时PCR验证mRNA表达分析

信使rna表达分析被实时PCR验证。量化的比较mRNA表达获得使用实时PCR和微阵列分析来确定微阵列分析(表的可靠性6)。表6表明,褶皱的变化(测试与控制)的微阵列分析几乎类似于PCR;一个由微阵列基因表达的增加或减少量化分析与PCR的结果是相一致的。这个结果表明,微阵列分析的结果是可靠的。

3.7。microrna的表达分析

总共30调节microrna(测试与控制、褶皱变化≥2)和84年下调microrna(测试与控制,褶皱变化≤0.5)后得到nsc BSSG处理(图5)。

3.8。实时PCR验证microrna的微阵列分析

microrna的表达分析被实时PCR验证。量化的比较microrna的表达获得了使用实时PCR和微阵列分析来确定微阵列分析(表的可靠性7)。表7表明,褶皱的变化(测试与控制)获得的微阵列分析几乎是类似于那些通过PCR。一个由微阵列基因表达的增加或减少量化分析与PCR的结果是相一致的。这个结果表明,微阵列分析的结果是可靠的。

3.9。miRNA-mRNA相关分析

microrna被认为是一个强大的工具来调节基因的表达通过RNA干扰途径(14,15]。因此,miRNA-mRNA相关分析进行了进一步了解BSSG调节nsc基因的影响。五个表达下调microrna, mir - 322 - 5 - p, mir - 301 - a - 3 - p, mir - 129 - 5 - p, mir - 322 - 3 - p,和mir - 129 - 2 - 3 p的目标mrna参与调节细胞增殖(基于miRWalk数据库http://www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/和大卫生物信息学资源6.7http://david.abcc.ncifcrf.gov/tools.jsp),选择进行相关分析。五个microrna之间的交互和预测目标mRNA(包括获得的差异表达基因mRNA微阵列分析)被可视化为网络(图6)。生成的网络使用cytoscape(≥2褶皱变化或≤0.5,),米兰达目标预测,负相关过滤,揭示出许多mRNA包括IGF1信使rna被五个microrna负监管,表达下调,从而增加相应的mRNA的表达。

3.10。IGF1蛋白定量

IGF1蛋白质在细胞培养上清液量化。IGF1蛋白质水平显著增加nsc BSSG处理后在20和40μ米(,图7)。

3.11。购买力平价抑制试验

购买力平价的BSSG-induced细胞增殖抑制合适的浓度(图8)。购买力平价在NSC增殖的抑制作用弱于0.01μM;然而,抑制在0.1显著μ米()和1 (),2μ米()。类似地,购买力平价在BSSG-induced细胞增殖的抑制作用弱于0.01μ相比之下,m . BSSG-induced细胞增殖抑制时细胞暴露在购买力平价≥0.1μm .这个结果显示,如果IGF1的功能受阻,那么细胞增殖引起BSSG不复存在了。

4所示。讨论

NSC增殖促进神经发生是必要的(26,27]。神经发生是增强NSC增殖时适当地提升。目前的研究提供了一种有效的替代物质BSSG,价格低廉,化学稳定性(BSSG粉末在室温下保持稳定的最大两年)。

BSSG存在在许多高等植物(28]。BSSG简单的隔离程序29日]。此外,它自1913年以来一直综合准备(30.];因此,BSSG可以很容易获得。在这项研究中,最小有效浓度是5μM, BSSG的有效性是类似于bFGF (20 ng / mL)和表皮生长因子(20 ng / mL)浓度的40岁μ米,揭示优秀proliferation-promoting活动。

BSSG proliferation-promoting活动的监管众多基因的结果。upregulation基因的mRNA表达分析显示,大多数参与有丝分裂细胞周期阶段,尤其是在米提高细胞增殖。相比之下,大多数的表达下调表达基因参与细胞分化,表明细胞分化抑制,因此,提供更多的细胞增殖的可能。之间的差异表达基因,基因的“枢纽”节点Bub1b, Cdc20, Plk1, Spp1, Aurkb, IGF1,和Ndc80调节。大部分的这些“集线器”基因是必要的完成一个细胞周期根据Genecards (http://www.genecards.org/),的重要性是不言而喻的。然而,主要调节基因,诱导细胞进入细胞周期或加速细胞周期的进程更实质性的细胞增殖。IGF1的关键是调节基因在这些“集线器”基因,因为它表现出显著的刺激经济活动。

IGF1基因编码一种蛋白质功能和结构类似于胰岛素,但IGF1展品更高的刺激经济活动。实验证据表明,IGF1在中枢神经系统开发功能,促进神经细胞增殖,生存和分化,IGF1可能功能以旁分泌和自分泌方式(31日]。体内IGF1的活动,包括NSC的刺激和祖细胞增殖在胚胎和产后早期发育,已检查(32]。此外,内生IGF1是一个重要的角色在齿状颗粒细胞生存产后大脑发育过程中(33]。此外,IGF1的内生中介焦ischemia-induced神经祖细胞增殖(34]。BSSG内生IGF1的表达增加了更多的生物活动,自IGF1 nsc的增长和发展中发挥了重要的作用。

BSSG增加内源性IGF1的表达作为信使rna表达微阵列分析显示,miRNA-mRNA相关性分析和IGF1蛋白质定量。特别是,IGF1 mRNA被microrna负监管(mir - 129 - 5 - p, mir - 301 - a - 3 - p,和mir - 322 - 5 - p), nsc BSSG处理后使之抑制。换句话说,IGF1 mRNA的表达增加。因此,IGF1蛋白水平增加。证据支持之间的密切关系的能力BSSG IGF1促进细胞增殖。购买力平价抑制试验证实BSSG取决于IGF1的功能,功能的抑制时细胞暴露在合适的剂量的购买力平价。

BSSG本研究提供的信息,一个便宜的和稳定的化合物,从而促进NSC增殖。BSSG可能会作为一种生长因子的选择,开发可用于临床医学和研究应用。

确认

这项工作得到了国家重点基础研究计划项目(973项目2011 cb707501),广州的科技重点项目(11 bppzxaa2070006)和第六批项目中国江苏省六大人才高峰和项目优先资助的学术项目江苏高等教育机构的发展,PAPD(中药结合西医)。