文摘

肝纤维化的研究中使用的动物通常必须牺牲。超声波已经证明有能力诊断肝纤维化和肝硬化在实验小动物模型。然而,很少有研究使用高频超声(HFU, 40 MHz)监测大鼠肝脏的变化和其他纵向中空器官。在这项研究中,肝纤维化是由管理二甲基亚硝胺诱导SD大鼠(静),年龄在8周,连续三天每星期4周。一个中药易关剑(YGJ)口头管理(每天1.8克/公斤)DMN-induced肝纤维化大鼠2周。与正常相比控制老鼠,老鼠接受静2周或4周的平均体重,显著降低肝脏羟脯氨酸的索引和高程,,GPT的内容。YGJ草药治疗明显阻止老鼠DMN-induced肝纤维化。HFU评分结果在正常对照组,两周DMN-treated老鼠,四周DMN-treated老鼠,和结合YGJ治疗2周和4周DMN-treated老鼠也达到统计学意义。因此,HFU是一个精确的工具的纵向分析肝纤维化进展在小动物模型中,YGJ可能是有用的在逆转肝纤维化的发展。

1。介绍

肝纤维化有报道称是坏死和炎症反应引起的各种因素如感染、中毒、有害因素。肝纤维化导致激活枯氏细胞,单核细胞和肝星状细胞,导致肝索的退化。侮辱扰乱了正常肝的持久性体系结构,导致再生结节和血管功能障碍的发展,用于确定肝硬化阶段(1,2]。肝活检是诊断肝纤维化或肝硬化的主要工具和评估肝脏受伤的严重程度。然而,这个过程有一些缺点,包括其侵袭性、抽样误差的可能性,以及潜在的并发症。

超声波已经证明有能力诊断肝纤维化和肝硬化在实验小动物模型(3- - - - - -6]。然而,在这些研究中使用的超声波频率总是低于15 MHz,和图像的质量是有限的空间分辨率。高频超声(HFU)成像,最近开发的技术,允许小实验动物的成像分辨率非常高(7,8]。这种系统的频率高于20 MHz,和空间分辨率小于100μ米(8- - - - - -10]。这种技术最重要的优势之一是是非侵入性形象的器官和组织生活的动物。这种能力允许监测疾病进展在动物模型在纵向研究中,可以缩短观测时间和减少牺牲动物的数量11]。在我们之前的研究中,我们确定了外科解剖学的啮齿动物腹部使用高频超声(40 MHz) [12]。

中药(中药)multi-ingredient提取低副作用的治疗慢性肝脏疾病(13,14]。易关剑(YGJ)煎煮中药是一个复杂的处方组成的9医学草药(15,16]。虽然仍然没有循证临床研究,YGJ一直用于治疗人类肝炎引起的肝纤维化和显示明显的逆转肝纤维化的疗效。YGJ的主要活性成分提取、阿魏酸,catalpol,显著抑制肝纤维化的进展在四氯化碳-(亚兰)诱导动物模型研究[17]。此外,更多的肝纤维化的临床表征模型表明,肝脏在二甲基亚硝胺(静)对待动物与黑暗变色因为拥堵的萎缩18]。然而,疗效DMN-induced YGJ提取的肝纤维发生尚未完全阐明。

在目前的研究中,我们使用一个商用高频(40 MHz)超声成像系统检测和监测肝纤维化的进展在活的有机体内在正常控制,2周DMN-treated老鼠,四周DMN-treated老鼠,老鼠和结合YGJ治疗2周和4周DMN-treated。YGJ提取物对肝纤维化的治疗效果是广泛评估在组织学检查、生化值和肝fibrosis-related基因规定。

2。方法

2.1。动物模型

二十个男Sprague-Dawley (SD)大鼠(年龄在8周,体重250 - 300克)。动物们被安置在一个有空调的房间°C 55 - 60%的相对湿度和12 h光/暗周期。这项研究符合“指导实验室动物保健和使用”,国立中兴大学的伦理委员会批准(批准号102 - 10)。两个截然不同的实验建立了肝纤维化大鼠模型,利用静息和一个使用生理盐水(对照组)。DMN-induced纤维化组大鼠腹腔注射1%静(10毫克/公斤体重)连续三天每星期2周或4周如前所述15,19]。静治疗2周后,老鼠口服服用1.8克/公斤YGJ草本提取物(幸田来未医药有限公司、桃园、台湾)。模拟控制组给予相同体积的磷酸盐(PBS)腹腔内4周。老鼠2或4周的治疗后牺牲与静息或正常磷酸盐(PBS)或结合YGJ草药疗法。

2.2。高频超声(HFU)考试

动物是轻和2.0 - -2.5%异氟烷麻醉蒸汽和置于仰卧位,呼吸自然。老鼠麻醉后,腹部被剃,进一步清洁用化学染发剂时尽量减少超声波衰减(19]。商用HFU系统(Visual超音速Vevo 770、多伦多,安大略省,加拿大)被用在这个实验。一个中心频率的换能器40 MHz,提供40的轴向分辨率μ米和14.6毫米的视野,用于图像老鼠的腹部器官。当开始执行HFU分析,超声波凝胶是在皮肤上作为一个耦合流体。

2.3。纵向评价HFU腹部器官

HFU被用来评估每个老鼠在第十周和十二周的第一天。每个老鼠的腹部被三个有经验的研究人员仔细扫描。肝脏检查评估回声、同质性、表面的边缘,肝内血管异常。此外,脾脏的大小和腹水的存在与否也检查和记录。

2.4。超声评分系统

评估HFU诊断肝硬化的有效性,我们得分的超声发现老鼠使用修改后的评分系统(20.]。项目包括肝实质echotexture、脾脏大小、腹水,血管,和边缘的表面分数肝硬化的严重程度。详细的评分方法提出了表1。

2.5。组织学检查

验证在活的有机体内成像结果,老鼠都牺牲了,他们的肝脏被立即删除。与前面观察到病变的大小和位置,视觉检查和体外我们的肝脏进行。肝脏指数(肝湿重/体重)和脾脏指数(脾湿重/体重)计算。肝组织切片固定5小时Bouin的解决方案,其次是隔夜敞口10%缓冲福尔马林溶液,pH值7.2,然后嵌入石蜡。肝脏样本切割(5μ米)和苏木精和伊红染色())和picrosirius根据标准协议(21- - - - - -23]。马森的三色的和小天狼星红染色法是用来评估胶原沉积(15]。

2.6。组织羟脯氨酸和血液生化指标

血清谷氨酸草酰乙酸转氨酶(了)和谷氨酸丙酮转氨酶(GPT)浓度测定用JSCC工具包(罗氏,印第安纳波利斯,美国)。肝羟脯氨酸含量测定(如前所述15]。

2.7。通过定量rt - pcr检测Fibrogenesis-Related信使rna

纤维发生基因的mRNA表达,alpha-smooth肌肉肌动蛋白(α- - - - - -SMA)和胶原蛋白alpha - (1) (胶原蛋白α我)是由半定量rt - pcr。管家基因glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH作为内部控制。大约900 ng的总RNA提取肝组织与亲逆转录酶使用GeneAmp反向转录RNA PCR试剂盒(美国应用生物系统公司,福斯特,CA)和低聚糖d (T) 16个引物。整除的逆转录酶被用于PCR扩增的混合α- - - - - -SMA(5′-TGGCTATTCCTTCGTGACTACTG-3′, 5′-AAAGATGGCTGGAAGAGAGT CAC-3′),胶原蛋白α我(5^”-GTTCGTGACCGTGACCTTGA-3′, 5′-TTGGGGT TCGGGCTGATGTA-3′),和GAPDH(5′-ATCCCCAGAGCGTCATTCG-3′, 5′-GAGAGAGCCCTGCCTGCC-3′)。每个基因的转录水平与GAPDH mRNA的规范化使用半定量的方法如前所述[15,24]。

2.8。统计分析

结果表示为平均值±标准偏差(SD)。DMN-treated组和对照组之间的差异学生的评价以及。统计学意义是(*或^#)。

3所示。结果

3.1。总值的相关性肝脏特征和HFU图像结果在活的有机体内在控制和DMN-Treated老鼠

在图1,面板(A)提出的总值外观正常肝脏、面板(B)介绍了总值的两DMN-treated鼠肝、和面板C了总值的四周DMN-treated鼠肝脏。面板(a)、(b)和(c)显示面板相对应的超声图像照片(一),(b)和(c)。在正常大鼠(图1(一)),肝脏是一个软,红棕色的器官组成的主要四叶(叶中值,右叶,左叶,和尾状叶)。DMN-treated大鼠2周,肝表面的相对深色比正常的老鼠,和肝脏的边缘涂上淡黄色的材料(图1(B))。在四周DMN-treated老鼠,肝脏是小和相对深棕色和涂有黄色物质沿着裂缝和利润率(图1(C))。在超声图像,正常肝实质有制服,像海绵一样的纹理与低回声(图1(a))。通过薄壁组织的血管,分支管状结构,可以观察到追踪门户或肝静脉。在两DMN-treated纤维化大鼠,肝脏超声图像的相对高回声(图1(b))。最高回声模式观察四周DMN-treated鼠肝脏(图1(c))。此外,腹水也发现了超声波在四周DMN-treated鼠肝脏(图1(c))。

3.2。病理特性在正常控制和DMN-Treated老鼠

评估的可靠性HFU成像,我们进行苏木精和伊红染色()),马森的三色的染色检查病理改变和胶原沉积(图2)。正常肝小叶结构和中央静脉和辐射肝索在正常控制老鼠的肝脏(数字2(一),2(一),2(D)2(d))。脂肪变性、坏死、炎性细胞的浸润,明显纤维化的形成中隔两周DMN-treated集团(数字2(B),2(b),2(E)2(e)和更强烈的四周DMN-treated集团(数字2(C),2(c),2(F)2(f))。

3.3。HFU分析相关的器官

的肝脏(图2周3(E),3(e),3(F)3(f))或四周(数字3(我),3(我),3(J)3(j)) DMN-treated老鼠相对比正常的小老鼠(数字3(一),3(一),3(B)3(b))。DMN-treated鼠的脾脏的超声图像显示回声增加(数据3(G),3(g),3(K)3(k))。肾脏也hyperechogenic DMN-treated老鼠(数字3(H),3(h),3(左)3(左))。腹水DMN-treated老鼠经常被探测到。

3.4。超声评分来评估YGJ治疗效果

在修改后的评分系统,正常控制老鼠得分为0。与静息治疗2周后,平均分数,经过4周的静息治疗,增加到。如表所示2,我们可以看到超声评分明显不同于两DMN-treated老鼠()和四周DMN-treated老鼠(),而正常大鼠的控制。四周的平均分数DMN-treated和YGJ 2周治疗组明显下降(,)相比,四周DMN-treated老鼠没有YGJ疗法。评估interobserver和intraobserver可变性HFU成像评估肝纤维化的严重程度,三个有经验的独立运营商分级肝正常图像,纤维化或肝硬化。加权kappa统计数据被用来分析interobserver S1和S2和intraobserver协议如表所示在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2013/302325。结果表明,intraobserver协议是70 - 100% (= 0.53 - -1.0)和interobserver协议从93%到100%甚至更高(= 0.85 - -1.0)。因此,这是一个可靠的超声评价方法对大鼠肝纤维化和肝硬化。

3.5。正常的生理和生化特点,DMN-Treated, DMN-Treated YGJ疗法相结合的老鼠

如表所示3、老鼠对待静2周或4周明显不同于控制大鼠体重、脾脏指数、羟脯氨酸水平,有水平,GPT的水平。然而,老鼠接受静息和结合2周YGJ治疗显著降低血清和GPT水平,恢复体重相比DMN-treated没有YGJ疗法组()。此外,肝羟脯氨酸浓度四周DMN-treated组增加5.6倍正常对照组(),但明显减少YGJ治疗组(相比单独DMN-treated组。

3.6。YGJ草药疗法对肝组织学改变的影响

肝脏组织病理学分析包括组织切片染色)和马森的三色的染料结合HFU成像分析如图4。肝组织从四周DMN-treated老鼠有更多的脂肪变性,纤维隔,退化的肝细胞坏死的肝细胞,融入pseudolobules以及较高的胶原蛋白内容(数据相关联4 (g),4 (h),4(我))比正常老鼠(数字控制4(一),4 (b),4 (c))和DMN-treated老鼠(图2周4 (d),4 (e),4 (f))。然而,四周DMN-treated老鼠结合YGJ草药治疗2周明显减轻肝纤维化程度,显著降低胶原沉积(图4 (j),4 (k),4(左))。

3.7。YGJ对基因表达的影响α- - - - - -SMA和胶原蛋白α我

基因表达的αsma和胶原蛋白α我,代表肝纤维化因素,用rt - pcr(图进行了分析5(一个))。的mRNA水平αsma和胶原蛋白α我增加在帷幕DMN-treated老鼠(1.5——1.7倍)或4周(3.6 - 1.9倍)DMN-treated老鼠,分别与正常对照组相比()。YGJ草药治疗的mRNA水平显著降低αsma和胶原蛋白α我67% ()和45% (),分别与四周DMN-treated单独组(图5 (b))。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们表明,高频超声(HFU 40 MHz)成像是一个有用的工具在活的有机体内分析肝组织在慢性毒素暴露和诱导的大鼠肝纤维化。此外,我们开发了一个超声评分系统来帮助评估肝纤维化大鼠的严重程度。意味着HFU成像分数增加而增加纤维化阶段。这是一个有用的工具来评估YGJ草药治疗的治疗效果。

小动物被用作调查模型毒素或病毒诱导肝损伤几十年(25- - - - - -28]。证实肝损伤的病理结果,大多数的研究已经牺牲了动物实验和对照组在不同时间点在研究过程中。这种类型的研究设计有两个缺点。首先,它缺乏连续性。例如,鼠标是牺牲后2周的毒素暴露,和鼠标B是牺牲了毒素暴露4周后。在这种情况下,我们通常认为的病理变化表现出鼠标B变化观察到鼠标的延续a。然而,即使动物属于相同的压力,可能会有一些偏见。其次,这种类型的研究设计要求更多的动物祭祀。如果不使用成像评估研究动物,动物必须牺牲在每一个观察和介入的时间点。

超声波被用来分析小动物的肝脏在很长一段历史29日,30.]。起初,研究人员发现,出现弥漫性肝病ultrasonographically作为肝脏回声的变化相对于肾皮质或脾脏。准确评估肝脏疾病的严重程度,一些定量的方法和工具已经开发出来。Matsuhashi和他的同事们发现,声音的速度是非常有用的诊断脂肪肝和肝硬化(6]。Guimond等人证实,定量超声组织特征可以作为一个工具来持续监测小鼠慢性肝改造(3]。王等人建议使用刚度测量声辐射力量可以提供一个定量评估肝纤维化的程度,可以用于诊断,管理和研究肝纤维化的31日]。何鸿燊等人建议超声波Nakagami成像是一个功能成像工具补充使用常规B-scanning动物研究肝纤维化的32]。然而,所有研究上面提到的需要使用复杂的或特定的技术或工具。由于技术进步,HFU,指频率高于20 MHz,变得更加容易获得(7- - - - - -10]。诊断HFU Fernandez-Dominguez等人报道,是一种有效的方法,监测的发展从脂肪变性肝细胞癌在小鼠肝脏疾病33]。类似于他们的研究结果,我们发现HFU可以作为非侵入性工具用于监测大鼠的肝脏疾病进展。

一项研究表明,低频(2 - 5 MHz)和高频探头(5 - 12 MHz)是可靠和有效的替代的组织学分期慢性肝脏疾病(34]。然而,我们的研究使用40 MHz调查表明,获得的图像有一个更高的分辨率比20 MHz探测器,它是容易监测疾病进展的详细变化使用40 MHz调查。40 MHz调查的另一个优点是,河鼠的脾脏可以很容易地检测到。使用20 MHz调查时,声波受到老鼠的肋骨。

使用超声波评分系统是一个可靠的方法来评估人类弥漫性肝病的严重程度和小动物5,35,36]。燕等人报道,超声波评分系统,尤其是当结合计算机断层扫描(CT)和血清纤维化标志物,有较高价值的无创性定量诊断肝纤维化在纵向研究(5]。在我们的研究中,正常控制之间的分数明显不同,两周DMN-treated,四周DMN-treated老鼠。减少偏见的超声波图像的解释,运营商必须练习使用HFU系统至少3周之前启动的一项研究。此外,超声图像记录和分析工作由两个运营商基于共识。

根据中国医药理论、肝脏疾病是由一种流行病病原体引起的湿和热会导致停滞的血液37]。当肝脏疾病发展到肝硬化,结果是一个血液不足。血清的活动得到了和GPT是最常用的生化标记物的肝损伤(38]。目前考试引起的肝损伤进展的重复管理静发现血清GPT活动明显增加。YGJ草药疗法显然压抑DMN-induced和GPT活动,表明YGJ提取有强有力的王亚南的效果。肝羟脯氨酸含量,α- - - - - -SMA和胶原蛋白α- - - - - -1.我基因表达数据也表明YGJ提取物治疗显著地减少胶原蛋白的积累与DMN-treated和PBS-administrated组。肝组织的病理改变明显改善与YGJ提取物治疗,表明YGJ提取物对肝纤维化的抑制作用。

5。结论

很明显,HFU提供更高分辨率的图像监视老鼠的肝脏疾病的进展。使用HFU可能减少侵入性程序所需的数量,减少牺牲动物的数量。此外,超声评分系统用于检测,基于HFU分级、和监视老鼠的肝脏疾病的进展,和这个系统关联的结果与病理结果。我们也证明YGJ疗效的主要机制可以保护肝脏损伤通过降低血清GPT以及减少了激活肝星状细胞的差别,通过对这些基因α- - - - - -SMA和胶原蛋白α- - - - - -1.我信使rna表达。它提供了科学证据的临床使用YGJ提取物在治疗肝纤维化、肝硬化。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突存在。

作者的贡献

魏陈,陈Jiun-Yu、唐代东和陈Hsiao-Ling这项研究同样起到了推波助澜的作用。

确认

这项研究的部分支持由国家科学委员会授予nsc - 101 - 2313 - b - 005 - 012,教育部,台湾,根据目标顶尖大学计划(前提- 101 s0508)。作者想表达自己的感激之情。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表或论文的准备。

补充材料