文摘
介绍。本研究旨在评估12从六个部分的细胞毒性喀麦隆药用植物敏感和耐药肿瘤细胞系。我们还研究了模式的作用最活跃的植物,剑兰quartinianus,Vepris soyauxii,Anonidium mannii。方法。提取的细胞毒性测定使用刃天青化验。流式细胞仪是用于细胞循环分析和细胞凋亡的检测,分析线粒体膜电位(MMP)和测量的活性氧(ROS)。结果。40 g / mL,三种提取物显示CCRF-CEM白血病细胞的增长不到50%。这包括摘录g . quartinianus(GQW;25.69%),Vepris soyauxii叶子(:;29.82%),Anonidium mannii叶子(AML;31.58%)。最低的集成电路50值低于30μGQW了g / mL, AML和:7/9,8/9,9/9测试癌症细胞系,分别。最低的集成电路50值为每个工厂都是4.09μ9.14 g / mL,μ针对U87MG.Δg / mL (表皮生长因子受体细胞),分别为:AML和10.57μg / mL GQW(针对CCRF-CEM细胞)。GQW诱导细胞周期阻滞在G0 / G1和S阶段,同时:AML和诱导在G0 / G1被捕。所有三种提取物诱导细胞凋亡在CCRF-CEM细胞MMP的损失,同时也AML增强活性氧的生产。结论。三个活跃的植物可能是一个新抗癌药物的开发。
1。介绍
癌症是人类死亡的主要原因之一,代表全球死亡的第三大原因(12.4%),第一个是心血管疾病(30%),第二是传染病,包括艾滋病毒/艾滋病(18.8%)(1]。化疗仍然是最好的选择在许多恶性疾病(2]。然而,耐药性的出现,尤其是多药耐药性(MDR),可以使许多临床建立抗癌药物无效(3]。因此,MDR的一个主要担忧许多癌症患者的预防治疗。恶性肿瘤也越来越被认为是一个重要的公共卫生问题在非洲(4]。在世界范围内,每年新癌症病例的数量将达到1500万,到2020年,其中70%将发生在发展中国家,政府不准备解决日益增长的癌症负担,存活率往往不到一半的那些在更发达的国家(4]。已经注意到,在整个大陆,尽管非洲人口传染病继续负担,非传染性的疾病需要更多的关注[4]。目前,有限的资金在非洲国家应对癌症。意识的阻碍在非洲流行值得优先级,和进一步的资源都应动员预防和治疗癌症。对抗癌药物的研究已成为世界范围内努力在发达国家和发展中国家,由于化疗是主要在许多恶性肿瘤的治疗5]。大多数标准的抗癌药物被孤立或从自然资源中,根据他们的使用在传统医学(6]。放映的药用植物作为抗癌药物提供了现代医学与有效的细胞毒性药物。超过60%的美国批准了抗癌药物从天然来源7- - - - - -9]。在喀麦隆,在传统医学中使用植物系统被广为记载在喀麦隆药典[10]。证据强调这些植物的重要性提供了癌症治疗(11- - - - - -16]。然而,这些植物是否也有效的细胞对常规化疗在很大程度上是未知的。已经建议ethnopharmacological用法免疫和皮肤疾病,如炎症、感染、寄生虫、和病毒性疾病时应考虑选择植物用于治疗癌症,因为这些反映疾病轴承相关癌症或类似癌症症状(17,18]。虽然植物选择在当下研究在喀麦隆传统医学用于对抗癌症,还有缺乏关于使用公布的数据。因此,在细胞毒性的连续搜索候选人从喀麦隆植物未ethnopharmacological有关癌症的信息使用,我们六个喀麦隆的抗增殖潜力调查植物对抗癌症细胞系具有不同耐药机制,也就是说,磷酸腺苷磁带(ABC)转运蛋白(22、抗乳腺癌蛋白),肿瘤抑制基因p53,或致癌基因(表皮生长因子受体)。细胞毒性的摘录剑兰quartinianus答:富有。(鸢尾科),Vepris soyauxii心血管病。(芸香料),Anonidium mannii(摘要)心血管病。一昼夜的。(番荔枝科)进一步分析研究他们的作用方式对细胞循环分布、MMP和活性氧。
2。材料和方法
2.1。植物材料
收集所有药用植物用于现在的工作在不同的领域之间的喀麦隆1月和2012年4月(表1)。植物被确定在国家植物标本(喀麦隆雅温得),代金券,标本被沉积在引用数据表中给出1。
2.2。提取
脱水和粉植物样本(1公斤)浸泡在甲醇(3 L) 48 h,在室温下。甲醇提取集中在真空中获取原油提取(12]。这些提取物被储存在4°C到进一步使用。
2.3。化学物质
阿霉素、长春花碱和道诺霉素是由大学提供的药店的约翰内斯古腾堡大学(美因茨,德国)和溶解在PBS(表达载体、Eggenstein、德国)的浓度为10毫米。Geneticin(72.18毫米)从Sigma-Aldrich购买(德国慕尼黑)。
2.4。植物化学的初步调查
主要次生代谢产物等生物碱类,花色苷、蒽醌类、黄酮类、酚类、皂苷、甾醇类、三萜烯(表2)根据常见的植物化学的方法测定先前描述(34]。
2.5。细胞培养
非耐CCRF-CEM和耐多药杰姆/ ADR5000白血病细胞维持1640年RPMI介质(表达载体)补充10%胎牛血清在湿润5%股份有限公司2气氛在37°C。阿克塞尔博士提供的敏感和耐药细胞被好心的索尔布雷(耶,耶拿大学儿科学系德国)。耐药亚系的生成是描述35]。22的具体超表达,但不是其他ABC转运蛋白,据报道(36,37]。乳腺癌细胞转导与控制向量(mda - mb - 231 pcdna3)或与乳腺癌抗蛋白质互补,BCRP(mda - mb - 231BCRP克隆23)维持在标准条件下对CCRF-CEM细胞如前所述。人类野生型HCT116 (p53+ / +)结肠癌细胞克隆以及基因敲除HCT116 (p53−−/)通过同源重组是一个慷慨的礼物来自福格斯坦博士b和h Hermeking(美国马里兰州巴尔的摩霍华德•休斯医学研究所)。人类多形性成胶质细胞瘤U87MG细胞(nontransduced)和U87MG细胞系转导与表达载体窝藏表皮生长因子受体(表皮生长因子受体)基因与基因外显子2到7 (U87MG.Δ删除表皮生长因子受体)请提供的w . k . Cavenee博士(圣地亚哥路德维希癌症研究所,美国)(38]。mda - mb - 231BCRP,U87MG.Δ表皮生长因子受体,和HCT116 (p53−−/)保持在DMEM培养基中含有10%的边后卫(表达载体)和1%青霉素(100 U /毫升)链霉素(100μg / mL)(表达载体),不断接受800 ng / mL, 400μ分别g / mL geneticin。人类HepG2肝癌细胞和正常AML12肝细胞得到从美式文化集合(写明ATCC,美国)。前面的媒介没有geneticin被用来维持mda - mb - 231, U87MG HCT116 (p53+ / +)、HepG2和AML12细胞系。细胞是通过每周两次。所有实验进行细胞对数生长期。
2.6。刃天青还原试验
刃天青减少试验(16,39)进行了评估研究样本对癌细胞的细胞毒性。指标的分析是基于减少染料,刃天青,高度荧光resorufin可行的细胞。不能存活的细胞迅速失去减少刃天青的代谢能力,从而不产生荧光信号。简单地说,贴壁细胞分离治疗0.25%胰蛋白酶/ EDTA(表达载体,达姆施塔特,德国)和1×10的整除4细胞被放置在每一个的96孔细胞培养板(热科学、Langenselbold、德国)总量为200μl细胞被允许附加在一夜之间,然后用不同浓度的治疗的研究样本。对于悬浮细胞,整除2×104每口井的细胞被播种在96 - wellplates总量的100μ立即l .研究样本在不同浓度的额外增加了100个μL培养基获得总额200μ信用证。24小时或48小时后,20μL刃天青(Sigma-Aldrich、Schnelldorf、德国)在ddH 0.01% w / v2O是添加到每个在37°C和盘子孵化4 h。荧光测量在无限M2000 Pro板读者(Tecan Crailsheim,德国)使用一个激发波长的发射波长544 nm和590 nm。每个试验做了至少两倍,有六个复制。可行性评估是基于与未经处理的细胞进行比较。集成电路50值代表样本的浓度抑制50%的细胞增殖和计算所需的校准曲线线性回归使用Microsoft Excel。
2.7。流式细胞仪进行细胞周期分析和检测凋亡细胞
细胞循环的分析是由流式细胞术使用Vybrant DyeCycle (Initrogen)。的Vybrant DyeCycle紫染色DNA-selective,细胞membrane-permeant, nonfluorescent染料在活细胞DNA含量分析。的Vybrant DyeCycle紫染色是双链DNA荧光在绑定。白血病CCRF-CEM细胞(1×106)治疗浓度相当于IC5024 h值的粗提取液,48和72 h。孵化后,1μL (Vybrant DyeCycle紫染色是加入1毫升的细胞悬液和孵化为30分钟37°C。细胞在LSR-Fortessa流式细胞仪测量分析仪使用紫激光(becton dickinson,德国)。一万细胞数为每个样本。Vybrant DyeCycle紫染色测定440海里激发。分析了Cytographs使用FlowJo软件(Celeza、瑞士)。所有的实验都至少执行一式三份。
2.8。线粒体膜电位的分析(MMP)
提取的影响,在分析MMP 5、5′, 6′6 -tetrachloro-1, 1′, 3、3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine碘)(JC-1;Biomol、德国)染色。JC-1是一种染料,可以有选择地进入线粒体,表现出强烈的红色荧光在健康正常的线粒体膜电位。与减少细胞MMP的红色荧光消失。简单地说,1106CCRF-CEM细胞治疗与不同浓度的测试化合物或DMSO(溶剂控制)为24小时孵化JC-1染色解决方案根据制造商的协议为30分钟。随后,细胞在一个LSR-Fortessa流式细胞仪测量分析仪(正)。对于每一个样本,1104细胞数。JC-1信号测量与561 nm励磁(150兆瓦),发现使用586/15 nm带通滤波器。化合物与640 nm励磁信号分析(40 mW)和检测使用730/45 nm带通滤波器。所有参数都标注在对数刻度。分析了Cytographs使用FlowJo软件(Celeza、瑞士)。所有的实验都至少执行一式三份。
2.9。测量活性氧(ROS)流式细胞术
2′,7′二乙酸-Dichlorodihydrofluorescein (H2DCFH-DA)(德国Sigma-Aldrich)探针用于ROS的高度敏感和可量化的检测。nonfluorescent H2DCFH-DA扩散进入细胞,胞质酯酶裂解成2′,7′-dichlorodihydrofluorescein (H2DCF),无法分散的细胞。在过氧化氢的存在,H2贴现是荧光分子氧化二氯荧光素(DCF)氧化酵素。来自DCF的荧光信号可以通过流式细胞仪测量并量化,从而表明细胞内ROS浓度(40,41]。简单地说,2106CCRF-CEM细胞resuspended PBS和孵化2μM H2在黑暗中DCFH-DA 20分钟。随后,细胞被洗PBS和resuspended RPMI 1640培养基含有不同浓度的提取或DMSO溶剂(控制)。1 h孵化后,细胞被洗和悬浮在PBS。随后,细胞的流式细胞仪测量石中剑流式细胞分析仪(becton dickinson,德国)。为每个示例1104细胞数。贴现为488 nm励磁(25 mW)和检测使用530/30 nm带通滤波器。所有参数都标注在对数刻度。分析了Cytographs使用FlowJo软件(Celeza、瑞士)。所有的实验都至少执行一式三份。
3所示。结果
3.1。化学成分的提取进行了研究
定性分析的结果表明,每一个研究植物提取物包含至少一个类次生代谢产物,如生物碱、花色苷、蒽醌类、黄酮类、酚类、皂苷、三萜。所有研究提取物中含有生物碱、酚类和单宁(表2)。
3.2。细胞毒性的研究样本
CCRF-CEM细胞的生长抑制作用由12属于六药用植物提取物是描绘在图1。的提取剑兰quartinianus(全植物;GQW;25.69%),Vepris soyauxii(叶子;:;29.82%),Anonidium mannii(叶子;AML;31.58%)抑制细胞生长在40 50%以上μ克/毫升。
更详细地调查这些提取物,IC50值测定在癌症细胞系。:提取活性(IC50< 40μ9 g / mL)对所有敏感或耐药细胞系。集成电路50值低于30μg / mL得到GQW、AML和VSLagainst 7/9, 8/9, 9/9测试癌症细胞系,分别。的集成电路50值的范围从4.09μ克/毫升(U87MG.Δ表皮生长因子受体细胞)13.60μ克/毫升(HepG2细胞):10.57μ34.01克/毫升(CCRF-CEM)μ克/毫升(U87MG.Δ表皮生长因子受体GQW),从9.14μ克/毫升(U87MG.Δ表皮生长因子受体32.02)μ克/毫升(mda - mb - 231BCRP对AML)。控制药物阿霉素,IC50值的范围从0.11μ195.12克/毫升(CCRF-CEM细胞)μ克/毫升(CEM细胞/ ADR5000)(表3)。高程度的耐阿霉素观察5000 CEM / ADR细胞(1772倍),mda - mb - 231BCRP细胞(7.11倍),U87MG.Δ表皮生长因子受体(5.76倍),而相应的父母的细胞系。HCT116 (p53−−/)细胞弱耐阿霉素(2.84倍),而HCT116 (p53+ / +)细胞。有趣的是,耐药细胞系没有或者只有弱耐测试提取(≤2.53倍)。值得注意的是,没有一个测试提取物抑制的增长超过50%正常AML12肝细胞浓度为40μ克/毫升。抵押品的敏感性,这意味着比敏感细胞耐药细胞更敏感,观察三个对U87MG.Δ提取表皮生长因子受体与电阻小于1度。这是还指出:和AML提取物对HepG2细胞和AML提取对杰姆/ ADR5000细胞。所有的植物提取物显示更高的集成电路50值在正常AML12 HepG2相比,肝细胞肝癌细胞。此外,AML12正常肝细胞比HepG2阿霉素耐药肿瘤细胞对阿霉素。没有一个正常AML12提取物抑制肝细胞50%以上。
3.3。细胞周期分布和凋亡
CCRF-CEM细胞循环分布和诱导细胞凋亡的细胞在治疗GQW,: AML,描绘在图2。72 h后治疗,GQWextract诱导细胞周期阻滞在G0 / G1和年代阶段:和AMLextracts诱导G0 / G1被捕。三种提取了一个依赖于时间的增加sub-G0 / G1细胞,表明诱导细胞凋亡。CCRF-CEM细胞浓度相当于集成电路处理50价值的研究提取逐步接受了细胞凋亡,在sub-G0 / G1期百分比从11.2%(24小时)为GQW 44.3%(72小时),从19.7%(24小时)为:53.2%(72小时),从(24小时)的22.7%和76.2%对AML (72 h)。sub-G0 / G1期的值记录与AMLwere高于获得参与细胞(范围从3.82%(24小时)到9.37% (72 h)),但与那些获得控制药物阿霉素(范围从59.4%(24小时)到71.9% (72 h))(见补充资料在网上http://dx.doi.org/10.1155/2013/285903,图S1)。
(一)
(b)
(c)
3.4。影响线粒体膜电位(MMP)
:,我们评估GQW的效果和AML提取物在CCRF-CEM MMP的细胞。如图3,改变比例为13.5%,28.9%,32.3%是由GQW,:, AML提取,分别与双重的IC治疗24小时后50。未经处理的细胞的MMP的值是4.81%。在类似的实验条件下,这些值都低于参考化合物、长春花碱收益率为48.6%,之前报道(33]。
3.5。影响活性氧(ROS)
:GQW的影响,AMLextracts CCRF-CEM细胞ROS水平进行调查(图24 h后治疗4)。控制代理,H2O2,ROS水平增加到10.4%,而参与细胞的活性氧产量为0.94%。只有AML诱导显著CCRF-CEM细胞ROS生产处理浓度相当于2集成电路50(8.42%)。
4所示。讨论
耐药性是一个复杂的多因子的现象,可以从一系列的生化机制的结果,包括药物吸收减少或增加药物流出,摄动的目标酶或改变目标酶的表达,改变药物的代谢,增加药物引起的DNA损伤的修复,或失败进行细胞凋亡(42,43]。电阻现象可能导致治疗的失败与致命的癌症患者的结果。次生代谢产物发挥重要作用在植物防御食草动物,微生物感染,和其他可以利用种间防御和对抗人类疾病,包括癌症(44]。他们的抗增殖特性已被广泛讨论45]。在目前的研究中,这些类次生代谢物中发现的植物提取物(表进行测试2)提供一个初步的解释他们的活动。结果代表第一个植物化学的细胞毒性数据的活动g . quartinianus,诉soyauxii,答:活。
根据写明ATCC标准,30岁μg / mL代表上层IC50限制被认为是有前途的粗提取液的纯化(46]。在目前的工作,最高浓度测试(40μg / mL)在我们的筛选是略高于这个极限。在此,我们记录了IC50值低于30μg / mL GQW、AML和:提取物对大多数的癌症细胞系(表进行测试3)。这表明GQW的粗提取物,AML,:可以作为细胞毒性化合物的潜在来源。
除了识别原油提取合理的较低的集成电路50值,我们确定了提取杀死否则耐药肿瘤细胞的能力。记住,耐药性是化疗的一个主要障碍诊所,寻找小说noncross-resistant细胞毒性化合物从自然资源是迫切的。耐药细胞模型overexpressing 22、BCRP或ΔEGFR以及p53基因敲除细胞被用来评估的适用性研究解决耐药性多因子的提取。三个提取的程度的阻力通常低于相应耐药细胞系(表阿霉素3),清楚地强调对抗多药耐药性可能产生的作用。甚至是取悦抵押品敏感性在很多情况下被观察到。这一现象的特点是耐药细胞的事实比父母的更敏感测试化合物敏感细胞(47,48]。
癌症化疗的目的是杀死癌细胞与尽可能少的破坏正常细胞(49]。:,GQW和AML提取物更对HepG2细胞毒性肝细胞癌和其他癌症细胞系比正常AML12对肝细胞进行测试。这突出了至少一些特异性的三个目标植物提取物对恶性细胞对正常细胞没有影响。
:,我们进一步发现GQW中断和AML提取物诱导细胞凋亡的MMP的同时除了AML产生活性氧。我们所知,GQW的细胞毒性,:,AML首次被报道在这里。因此,隔离这些植物的有效成分是值得更好的理解他们的活动对癌细胞。
总之,目前的研究提供了证据的潜在细胞毒性GQW,:, AML提取物对敏感和耐药肿瘤细胞系。CCRF-CEM三提取物诱导细胞凋亡细胞MMP的损失,在AML的情况下,也增强活性氧产量。这些植物提取物的优点更详细的调查,提高在未来肿瘤治疗的耐药和耐火材料。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Victor Kuete艾梅g . Fankam和便雅悯Wiench进行了实验。维克多Kuete和托马斯·Efferth设计研究。维克多Kuete写道。托马斯Efferth监督所提供的工作和研究设施。所有作者阅读和批准了期末论文。
承认
维克多Kuete非常感谢亚历山大•冯•洪堡基金会18个月的奖学金在德国通过“Georg培养经验丰富的研究员研究奖学金”项目。
补充材料
三种植物诱导白血病细胞凋亡和细胞周期阻滞CCRF-CEM细胞。在72 h治疗,剑兰quartinianus诱导细胞周期阻滞在G0 / G1和S阶段,同时Vepris soyauxii和Anonidium mannii诱导在G0 / G1被捕。